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使用 R 对听觉脑干反应波形进行半自动化的峰幅与潜伏期分析

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DOI：

10.3791/64737

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2022年12月9日

 , 
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 2Department of Neuroscience, Ernst J. Del Monte Institute for Neuroscience, University of Rochester Medical Center

本文内容

摘要

本文介绍了听觉脑干反应波形中前五个波峰和波谷的振幅与潜伏期的半自动化测量方法。另一个程序可将数据汇总并标注到电子表格中，供实验人员分析。这些免费的计算机程序通过开源统计软件包 R 来运行。

摘要

在过去15年中，许多研究报告评估了噪声暴露等损伤后听觉脑干反应（ABR）波形的变化。常见的变化包括波峰1的振幅降低、后续波峰的相对潜伏期缩短，以及中枢增益增加，后者表现为与波峰1振幅相比，后续波峰的振幅相对升高。许多实验人员通过目视识别波峰和波谷，以评估其相对高度和潜伏期；然而，当在每种频率和条件下以5 dB为增量在整个听力范围内采集波形时，这一过程极为耗时。本文介绍了一套可在开源平台R及其RStudio界面中运行的免费程序，用于半自动测量听觉脑干反应（ABR）波形的波峰和波谷。该程序可识别波峰和波谷的振幅与潜伏期，在生成的波形图上标示以便检查，将结果汇总并注释后输出至电子表格以供统计分析，并生成用于图表的平均波形。在自动识别过程出现误判的情况下，程序还提供额外工具辅助校正。本方法的目标是减少分析ABR波形所需的时间和工作量，从而鼓励未来更多研究人员将此类分析纳入研究中。

引言

听觉脑干反应（ABR）常用于测定动物模型和人类婴儿的听觉阈值。由于ABR是神经系统对听觉刺激产生反应的最早期脑电图（EEG）记录，因此它还包含额外信息，反映了耳蜗螺旋神经节神经元的协同放电以及听觉脑干中的早期信号处理过程，包括双侧处理1。这些反应可能受到噪声损伤的影响。例如，足以在小鼠中引起暂时性阈移的噪声暴露，也可能永久性地降低ABR波峰1的振幅2。此外，此类损伤还可能缩短峰间潜伏期，并增加后期波峰的相对振幅3，这可能与抑制性调控功能的丧失有关4。除上述发现外，已有研究表明，特定的基因突变可在无创伤情况下改变ABR波形5,6,7。因此，对ABR波形的常规分析可为实验模型中听觉系统的研究提供重要见解。

人们还对将听性脑干反应（ABR）波形用作患者诊断工具产生了兴趣。先前的报告已评估了人类患者在噪声暴露后或耳鸣患者中，ABR 波峰1是否降低8,9。值得注意的是，有报道称偏头痛发作会暂时延长数周内的峰间潜伏期，之后受影响个体的 ABR 波形恢复正常10。已有研究报道，COVID-19 可导致 ABR 峰间潜伏期发生长期改变11,12，尽管另一项研究报道了不同的结果13。听力损失在老年人群中常与痴呆共病，且听力损失越严重，痴呆进展往往越迅速14。研究人员已探讨了神经退行性疾病（如帕金森病（详见 Jafari 等人15）和阿尔茨海默病（详见 Swords 等人16））以及正常衰老过程中的 ABR 波形变化17。随着越来越多的研究人员和临床医生将感觉功能缺陷作为衰老相关常见疾病的生物标志物进行研究，诸如 ABR 之类的技术可能在医疗保健中成为常规手段。

查阅文献中的方法部分可知，实验室通常会使用 MatLab 编写自定义脚本来分析 ABR 波形。Intelligent Hearing Systems 公司生产的 ABR 平台具备波形分析功能，但需要操作者手动选择波峰和波谷。本文中，我们为开源且免费的统计环境 R 及其 RStudio 界面编写了半自动化的分析程序。本报告将使用这些程序获得的数据与实验人员手动识别波峰和波谷所得数据进行比较，结果表明两种方法获得的数据高度相关。重要的是，这些程序集成了盲法功能，即将样本的元数据保存在单独的文件中，直到分析结束时才合并。这些功能显著简化了我们实验室的波形分析流程。

方案

所有动物实验操作均事先获得罗切斯特大学动物研究委员会的批准。实验对象为12只1月龄的野生型F1代雄性和雌性小鼠。这些F1代小鼠由CBA/CaJ品系母鼠与C57BL/6J品系公鼠交配产生。小鼠在屏障环境动物房内饲养，采用标准的12小时光照/12小时黑暗循环，自由摄食饮水，并提供充足的筑巢材料。每笼饲养同性别小鼠不超过五只。

1. 获取用于分析的数据

注意：此步骤必须符合机构指南，并事先获得机构动物福利委员会的批准。从小鼠生成ABR数据的详细过程已在其他文献中描述18。

  1. 使用选定的平台记录ABR。
    注意：本示例中，记录是在小鼠上进行的。
    1. 使用持续时间为5 ms的点击刺激，起始声压级为75 dB，以5 dB为步长递减至5 dB。对每个刺激强度记录平均512次扫描。若在刺激后1.3 ms至12.5 ms之间的任何时刻，反应的峰-谷振幅超过31 µV，则舍弃该反应。
      注意：也可使用短音（tone pip）刺激的记录。预计该分析流程适用于其他物种，包括人类。
  2. 将ABR记录导出为ASCII文件。
    1. 对于IHS系统，打开计算机程序。
    2. 加载目标文件，并将所需的波形显示在同一页上。
    3. 在数据选项卡下，选择将页面另存为ASCII，以生成一个.txt文件。
    4. 适当命名数据文件（"ID"），并在一个名为"info.csv"的元数据文件中记录该ID及受试者信息。确保"ID"不包含基因型、性别、年龄或处理方式等信息；这些信息应记录在"info.csv"中。
      注意：如有需要，可使用一副标准扑克牌随机分配标签。
    5. 对所有需分析的文件重复上述步骤，作为独立的"ID"文件处理。

2. 在工作计算机上安装所需软件包并加载数据

  1. 下载并安装 R（https://www.r-project.org）和 RStudio（https://www.rstudio.com）。 
    注意：本方案所使用的 R 版本为 ≥ 4.0.0。
  2. 在 RStudio 的命令窗口中输入以下命令，安装所需的库 tidyverse、shiny、plotly 和 zoo：
    install.packages("tidyverse")
    install.packages("shiny")
    install.packages("plotly")
    install.packages("zoo")
  3. 从 White 实验室的 GitHub 页面（https://github.com/PWhiteLab/FindPeaks）下载脚本 FindPeaks.R 和 See_trace_click.R，以及相关文件“Time.csv”。
  4. 创建一个新文件夹，用于存放所有 ASCII 文件、"info.csv" 和 "Time.csv"。在本示例中，将该文件夹命名为 "Test_Folder"。在 "Test_Folder" 内，将 ASCII 文件放入一个名为 "ASCII_Folder" 的子文件夹中。

3. 使用 FindPeaks.R 进行初步分析

  1. 在 RStudio 中打开 FindPeaks.R 脚本。
  2. 在工具栏中右键单击 脚本 选项卡，选择 设为工作目录，并将其设置为 Test_Folder（参见 补充图 S1A）。
  3. 在 脚本 窗口中，单击工具栏右上方的 运行 按钮以加载程序（参见 补充图 S1B）。
  4. 在命令窗口中，使用以下命令分析波形（参见 补充图 S2）：
    FindPeaks_single("ASCII_folder/ID.txt") 用于单个文件分析（参见 补充图 S2A）
    FindPeaks_group("ASCII_Folder") 用于批量处理（参见 补充图 S2B）
    ​注意：该脚本将输出（1）显示带有标注峰和谷的波形的 pdf 文件（参见 补充图 S2C）以及（2）包含幅值（µV）和潜伏期（ms）数值数据的 ID.csv 文件。这两个文件都将保存在 "Test_Folder" 目录中。

4. 验证初步分析

注意：在低音量水平下，波形的部分可能难以与噪声区分开来，FindPeaks.R 可能会与实验人员的判断相比错误识别峰或谷。如果存在差异，可通过 See_trace_click.R 脚本获得的数据对 .csv 文件进行修改。

  1. 使用以下命令加载特定个体的波形数据（参见补充图S3A）：
    Waveform <- ASCII_extract("ASCII_Folder/ID.txt")
  2. 在RStudio中打开See_trace_click.R脚本。
  3. 在左侧的标题区域，点击运行应用按钮，并等待一个新的交互式（Shiny）窗口出现（参见补充图S3B）。
  4. 在左上角的输入框中，输入需要修订的波形的声音强度，并在窗口中查找显示的波形。
  5. 移动光标在波形周围，以显示任意位置的潜伏期和振幅。
  6. 点击正确的波峰及其后的波谷，以将数据记录在下方表格中。将潜伏期数据复制并粘贴到.csv文件中（参见补充图S3C）。
  7. 为计算振幅测量值，在电子表格单元格中用波峰振幅减去后续波谷振幅。

5. 数据集的编译与可视化

  1. 将已验证的 .csv 文件转移至 Test_Folder 中名为的新子文件夹 "峰值数据"
  2. 将数据追加到一个单独的 .csv 文件中，并将其命名为 "Peak_Data.csv"
  3. 使用以下命令：
    编译（"峰值数据")
    注意：该脚本将 info.csv 中的元数据与 Peak_Data.csv 结合，以使用分组信息标注数据。同时，自动计算峰间潜伏期和振幅比值。
  4. 对汇总的数据进行统计分析。
    1. 使用正态性检验（如Shapiro-Wilks检验）通过以下函数评估数据的分布情况：
      shapiro.test()
    2. 如果Shapiro-Wilk检验结果不显著，则数据集符合正态分布；因此，应使用ANOVA等参数检验方法对数据进行分析 具有以下功能：
      aov()
    3. 如果Shapiro-Wilks检验结果小于 p = 0.05 时，使用 Kruskal-Wallis 秩和检验（采用下述函数）或其他适当的非参数检验方法（其他可能方法参见讨论部分）。
      kruskal.test()
  5. 要显示平均波形，请使用以下命令：
    平均波形("ASCII_Folder "，aes(x = Data_Pnt_ms, y = "dB"，组别 = 基因型，颜色 = 基因型))
    注意：此命令以不同颜色显示不同基因型的平均波形。对于 y 变量 dB，插入与之对应的数字 期望振幅，例如 75，不加引号。对于其他比较，使用相应的 组别标签 从元数据中。

结果

我们使用听觉脑干反应（ABR）对点击序列的波形响应测试了这些程序，刺激强度从75 dB开始，以5 dB为步长递减至5 dB。这些数据的获取方法如前所述19。我们还使用短音脉冲（tone pip）数据对工具进行了测试，并获得了类似结果。大多数ABR系统的数据可导出为.txt（ASCII）文件。我们按照方案所述，将ABR的ASCII文件加载到计算机中，并在RStudio中打开。以批处理方式运行FindPeaks.R程序后，我们获得了带有自动标记的示例波形（图1）以及包含结果的.csv文件。随后对结果进行审查，以剔除无关的波峰。为了验证自动标记的准确性，我们还利用ABR软件的手动功能，对上述点击序列获得的每条波形中的前五个波峰和波谷进行人工标记。执行该任务的实验人员具有两年记录和分析ABR数据的经验。图2展示了两种方法的比较结果，其中FindPeaks.R自动识别的数据以红色表示，人工标记的数据以黑色表示。每条轨迹代表一只小鼠的数据。图中同时显示了两种方法的平均值及一个标准差范围。FindPeaks.R获得的结果与人工分析结果高度相关（见补充图S4）。

声级潜伏期图；振幅与潜伏期；75 dB 听力实验的峰值分析。
图1：年轻F1小鼠对75 dB咔嗒声刺激的代表性波形反应。 横轴表示以毫秒为单位的潜伏期，纵轴表示以微伏为单位的振幅。峰值由FindPeaks.R自动识别，并以红色标注，而谷值以蓝色标注。 请点击此处查看该图的放大版本。

听觉反应分析的波形振幅与潜伏期图；声强与反应关系研究。
图 2：手动识别峰与 FindPeaks.R 分析结果的比较。（A、C、E、G、I）为 12 只小鼠对点击刺激诱发的波形中 I-V 峰在 5 dB 至 75 dB 声强范围（横轴，所有图）下的振幅（单位：微伏），（B、D、F、H、J）为潜伏期（单位：毫秒）。手动获取的数据（黑色）与使用 FindPeaks.R 分析的相同数据集（红色）进行比较。平均值以粗线表示，阴影区域代表一个标准差。通过 Kruskal-Wallis 秩和检验评估，两种方法之间无显著差异（A，差异 = 0.0547977 ± 0.0010028，最大值 = 0.96，p = 0.9216；B，差异 = −0.0001734 ± 0.0001214，最大值 = 0.04，p = 0.8289；C，差异 = −0.0212209 ± 0.0006806，最大值 = 0.92，p = 0.9687；D，差异 = −0.0011047 ± 0.0001556，最大值 = 0.06，p = 0.771；E，差异 = −0.0323077 ± 0.0006169，最大值 = 0.66，p = 0.899；F，差异 = −0.0072189 ± 0.0001460，最大值 = 0.04，p = 0.8644；G，差异 = 0.201754 ± 0.0007407，最大值 = 0.64，p = 0.9312；H，差异 = −0.0007018 ± 0.0001717，最大值 = 0.09，p = 0.8013；I，差异 = 0.0347561 ± 0.0007343，最大值 = 1.05，p = 0.8856；J，差异 = −0.0078049 ± 0.0002762，最大值 = 0.16，p = 0.886），且结果高度相关（卡方值：A，0.009696；B，0.046684；C，0.0015395；D，0.084742；E，0.016102；F，0.029153；G，0.0074604；H，0.063322；I，0.020699；J，0.020544；差异以均值 ± 标准误表示；max = 绝对最大差异）。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图 S1：使用 FindPeaks.R 进行分析。 （A）选择工作目录（参见实验方案步骤 3.2）；（B）加载程序（参见实验方案步骤 3.3）。请点击此处下载该文件。

补充图 S2：波形分析的脚本输出与命令。 分别用于（A）单个文件和（B）批量处理的命令。（C）输出的 PDF 文件，显示带有标注峰和谷的波形。参见实验方案步骤 3.4。请点击此处下载该文件。

补充图 S3：分析结果的验证。 （A）加载波形数据（参见实验方案步骤 4.1）。（B）Run App 按钮的位置，图中同时标示了示例数据文件。（C）显示波形的 Shiny 窗口。本示例中，顶部窗口输入的声强为 75 dB。点击目标波峰及其随后的波谷，即可将振幅和潜伏期数据记录到表格中（实验方案步骤 4.6）。图中显示的是第 3 个波峰的数据。请点击此处下载该文件。

补充图 S4：手动识别峰所获得的个体数据与 FindPeaks.R 分析提供的数据比较。（A、C、E、G、I）为以微伏为单位的波幅，（B、D、F、H、J）为以毫秒为单位的潜伏期，横轴（所有图）表示声强从 5 dB 到 75 dB，数据来自对 12 只小鼠施加点击刺激所记录的波形中的 I-V 波峰。每只动物以图例中所示的独特颜色标记。FindPeaks.R 获得的数据以饱和色标示，手动获得的数据则以相同颜色的低饱和度版本标示。虽然本图中同时绘制了两组数据，但当两者相同时，仅显示一条线。请点击此处下载该文件。

讨论

本出版物中描述的方案有助于简化获取听性脑干反应（ABR）对咔嗒声和短音刺激的电压幅度比和潜伏期间隔数据的过程。通过在 RStudio 中使用单条命令，实验人员即可提取、汇总并显示这些信息，生成单一文档用于统计分析。通过使该分析流程常规化，我们希望该领域能够发现 ABR 在发育过程、衰老过程或不同物种受到损伤时发生变化的新途径。此类信息可能有助于识别类似于噪声引起的突触病变的重要机制2。本实验所用的幼鼠反应差异较大，可能是因为在此年龄段听觉脑干仍处于成熟过程中20。尽管如此，两种定量方法显示出极强的相关性（图 2）。

该脚本使用名为“Time.csv”的文件来设定数据中的时间区间，以进行峰识别。简而言之，在指定时间区间内出现的最大电压幅度被标记为“峰1”，在下一个区间内出现的电压最小值被标记为“谷1”，依此类推。我们设定的时间区间涵盖了1至12月龄CBA/CaJ小鼠在8 kHz至32 kHz频率范围内的点击声和短音刺激听性脑干反应（ABR）的潜伏期。我们已成功使用该工具测量小鼠的短音刺激ABR反应。其他物种（包括人类）的ABR反应也出现在类似的时间窗内，因此我们预期该工具也可用于其他物种的数据分析。我们建议对人类采用新的并行ABR方法21，该方法可产生优质的波形。当前的时间区间设定限制了本工具仅适用于即时ABR反应的评估。然而，我们指出，用户可自行修改该文件中的时间区间数据，以实现对语音刺激ABR反应或事件相关电位（ERPs）的自动化测量，后者在声音刺激后通常在不同时段出现。

对该数据进行统计处理的一些特点值得强调。据我们所知，该领域尚未建立区分波幅增长模式的标准化处理方法。早期研究采用方差分析（ANOVA）22,23。本文中咔嗒声序列的数据（图2）为非参数性，因此采用了Kruskal-Wallis秩和检验。与ANOVA类似，Kruskal-Wallis秩和检验用于评估在特定刺激强度下所获得数值之间的差异；即比较图中得到的曲线。然而，其他分析方法也是可行的。从生物学角度看，波幅增长模式反映了随着刺激强度增加，更高阈值的神经元被进一步募集。这表明，代表曲线下面积的积分值可能是更具生物学意义的测量指标。广义估计方程（Generalized estimating equations, GEE）可用于对个体数据建模以进行积分分析，如Patel等人的研究所示5。值得注意的是，GEE分析能够考虑此类实验的重复测量设计。随着越来越多研究人员讨论数据分析方法，我们预期将在最佳实践方面逐步形成共识。

综上所述，本文介绍了一套免费且易于使用的工具，可用于测量、整合和可视化听性脑干反应（ABR）波形。通过遵循本实验方案，RStudio 初学者学生亦可使用这些工具，且该工具整合了盲法步骤，以提高实验的严谨性和可重复性。我们预计，常规的 ABR 波形分析将有助于发现影响听觉功能的损伤、基因变异以及其他治疗方法。

致谢

本研究工作获得了NIDCD向PW资助的两项基金支持：R01 DC018660以及一项行政补充资助R01 DC014261-05S1。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
C57BL/6J  小鼠Jackson Labs664
CBA/CaJ 小鼠Jackson Labs654
E系列PCDelln/a（该设备已停产）用于运行IHS系统。
小型消声室Industrial Acoustics Company特殊订单编号104306该装置可降低动物听觉测试时的环境噪声水平。
Optiplex 7040Delli5-6500Rstudio也可在Mac或Linux系统上运行。
Universal Smart BoxIntelligent Hearing Systemsn/a（该设备已停产）TDT和IHS均可将听力数据输出为ASCII文件。

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ABR RStudio Findpeaks Shapiro Wilk ANOVA

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