方法文章

使用荧光测定法或流式细胞术测量半胱天冬酶活性

DOI：

10.3791/64745

⸱

2023年3月24日

 ,  , 
1Institute of Experimental Immunology, University of Zürich

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本协议描述了两种使用流式细胞术或分光荧光计通过荧光底物测量半胱天冬酶活性的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

半胱氨酸蛋白酶的活化，称为半胱天冬酶，仍然是多种形式的细胞死亡的重要过程。半胱天冬酶是细胞凋亡的关键启动剂和刽子手，细胞凋亡是研究最多的程序性细胞死亡形式。细胞凋亡发生在发育过程中，是组织稳态的必要事件。焦亡是利用半胱天冬酶的另一种细胞死亡形式，是通过激活炎症小体激活免疫系统的关键过程，导致白细胞介素-1（IL-1）家族成员的释放。为了评估半胱天冬酶活性，可以评估目标底物。然而，在检查单个细胞或低水平活性时，灵敏度可能是一个问题。我们展示了荧光底物如何与基于群体的测定或通过流式细胞术进行单细胞测定一起使用。通过适当的控制，可以使用不同的氨基酸序列来识别哪些半胱天冬酶是活跃的。使用这些测定，已经确定了肿瘤坏死因子（TNF）刺激时凋亡蛋白抑制剂的同时丢失，这主要诱导巨噬细胞凋亡而不是其他形式的细胞死亡。

引言

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半胱天冬酶参与几种形式的程序性细胞死亡。细胞凋亡是研究最多的程序性细胞死亡形式，与半胱天冬酶活性1有关。所有半胱天冬酶都有一个大大小小的催化亚基。半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-11具有半胱天冬酶活化和募集结构域（CARD），半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10含有死亡效应结构域（DED）2，3，4，5（表1）。细胞凋亡可以通过两种主要途径启动:外在途径和内在途径。外在凋亡途径由死亡受体触发，死亡受体是肿瘤坏死因子超家族（TNFSF）的一部分。死亡受体具有DED结构域，促进半胱天冬酶-8活性6。内在凋亡途径涉及细胞凋亡形成后半胱天冬酶-9的激活，需要释放细胞色素c和Apaf-17。引发剂半胱天冬酶，半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-9的激活导致刽子手半胱天冬酶的切割和随后的激活，即半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-6和半胱天冬酶-7。确定刽子手半胱天冬酶是活跃的表明细胞正在经历细胞凋亡，这种激活被认为是定义细胞死亡模式的重要因素。

半胱天冬酶活化也是调节炎症和诱导程序性细胞死亡替代形式的关键时刻。例如，半胱天冬酶-1活化导致白细胞介素-1家族8的促炎细胞因子的成熟。该家族细胞因子的释放和活化，特别是IL-1β和IL-18，是由质膜9，10处的加斯皮明D切割和孔形成引起的。胃皮素D孔的膜修复不足可导致一种称为焦亡11的细胞死亡。此外，半胱天冬酶-8活性导致半胱天冬酶非依赖性细胞死亡的抑制，称为坏死性凋亡12。受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）是坏死性凋亡和驱动NF-kB调节的炎症的关键因素之一。 模型显示，RIPK1被半胱天冬酶-8切割，导致限制NF-kB信号传导，细胞凋亡和坏死性凋亡13，14。因此，鉴定不同半胱天冬酶的活性有助于了解由此产生的炎症和细胞死亡方式。

与半胱天冬酶调节细胞死亡模式的功能无关，半胱天冬酶活性还可以调节其他细胞因子家族，如干扰素（IFN），以响应感染15，16。此外，半胱天冬酶参与非细胞死亡功能，包括细胞命运决定、组织修复和再生、通过 DNA 修复的肿瘤发生和神经元突触功能。半胱天冬酶在这些非致死性作用中的活性被认为受到细胞定位和半胱天冬酶数量的限制。因此，量化半胱天冬酶活性水平可以很好地定义细胞是否经历细胞死亡或半胱天冬酶是否在非细胞死亡功能中发挥作用4，17，18。

半胱天冬酶活性可以通过多种方法评估。裂解半胱天冬酶及其底物的蛋白质印迹已被用作活性指标，但这些测定充其量是定性的。为了确定半胱天冬酶活性是否与细胞死亡有关，定量测量是理想的。由于半胱天冬酶在由四个氨基酸组成的识别位点切割底物，因此已经开发了比色法、发光法或荧光法。然而，半胱天冬酶在其底物识别中似乎具有可塑性19，20。识别序列与蛋白质结构域无关（表1）。然而，四肽序列DEVD可用于检测半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7活性20，21。

Smac模拟物是靶向细胞凋亡蛋白（IAP）抑制剂的化合物。在癌细胞子集中使用Smac模拟物会导致细胞对TNF诱导的细胞死亡变得敏感22。在原代巨噬细胞中，Smac模拟物在没有外源性添加TNF23，24的情况下引起细胞死亡。Smac模拟诱导的降解导致cIAP1的损失导致TNF的产生。如果检测到半胱天冬酶活性，这意味着细胞不是通过坏死性凋亡而死亡，而是以凋亡的方式死亡。在该方法中，切割的DEVD底物的检测用于鉴定半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7活性。确认凋亡细胞死亡的进一步实验已在24之前发表。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究是在苏黎世大学动物伦理委员会（#ZH149/19）的批准和指导方针下进行的。本研究使用8-16周龄的雄性C57Bl / 6J小鼠，在特定无病原体（SPF）条件下繁殖和饲养。完整的骨骼可以保存在带有2%热灭活胎牛血清（FBS）的无菌Hank缓冲盐水溶液（HBSS）中的冰上。分化当天从小鼠25 的股骨和胫骨收集骨髓。评估半胱天冬酶活性的两种方法都可用于其他细胞类型，包括原代细胞和转化细胞。

1. 区分骨髓来源巨噬细胞（BMDM）

注意:在组织培养层流罩中执行所有步骤，并使用无菌无菌技术。

  1. 用21 G针头准备1 mL注射器。
  2. 将 5 mL HBSS + 2% FBS 加入 15 mL 管中。










  6. figure-protocol-1



结果

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原代小鼠巨噬细胞分化6天。6天后，收获细胞，计数并接种。使用以下处理:不处理和Smac模拟物（化合物A）22 在250nM和500nM下16小时（图1）。该实验一式两份进行，以允许通过基于群体的测定或使用流式细胞术的单细胞分析来评估半胱天冬酶-3 / caspase-7活化。

使用BCA测定法定量细胞裂解物的蛋白质浓度（补充表1）。这对于确保半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7活性测定中使用的蛋白质量在样品之间是相同的是必要的。在这种基于人群的测定中，数据可以通过两种方式呈现。第一种是通过绘制调整后的荧光（y轴）与时间（x轴）的关系来显示动力学（图2A）。或者，可以计算斜率以直接比较样品（图2B）。基于具有多重比较的普通单因素方差分析，500 nM Smac模拟处理的斜率增加并不显着（Dunnett的多重比较检验28）。

为了使用流式细胞术分析半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7活性，收获细胞和上清液。使用未染色细胞或荧光减1作为阴性对照，以及未处理的细胞。通过流式细胞术收集的细胞的直方图显示，与未处理的细胞相比，用Smac模拟物处理的细胞的荧光发生了变化（图2C）。数据可以显示为中位数荧光强度（图2D）或未处理细胞的倍数变化（图2E）。

figure-results-1
图1:研究流程图。 （A）从C57Bl / 6小鼠中切除股骨和胫骨。将骨头冲洗并在20 ng / mL m-CSF中分化6天。（B）在第6天，收获巨噬细胞并重新播种进行处理。收获一组细胞用于裂解物并通过荧光活性进行评估，而另一组则收获，与荧光底物一起孵育，并通过流式细胞术进行评估。请点击此处查看此图的大图。

figure-results-2
图2:通过流式细胞术测定半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7活性和底物切割的动力学测定。 （A，B）半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7活性（C-E）和流式细胞术底物切割的动力学测定的代表性数据。用两种浓度的Smac模拟物（化合物A;250nM和500nM）处理巨噬细胞16小时。 （A）随着时间的推移检测裂解的DEVD AFC底物。将数据归一化为样品中的蛋白质浓度。（B）将每个样品的DEVD AFC的切割速率（斜率）归一化为未处理的斜率，并表示为未处理细胞的倍数变化。（C）与半胱天冬酶-3底物一起孵育的细胞的流式细胞术直方图。（D，E）与未处理的样品相比，MFI中的MFI比较和倍数变化。每个数据点代表一个独立的样本;显示平均值±平均值的标准误差;*p < 0.05，使用单因素方差分析和多重比较检验（邓内特多重比较检验）。请点击此处查看此图的大图。

半胱天冬酶物种基板序列蛋白质结构域
半胱天冬酶-1高，毫米（宽/长）EHD卡，大域，小催化域
半胱天冬酶-2高，毫米德克斯德卡，大域，小催化域
半胱天冬酶-4房 协（宽/长）EHD卡，大域，小催化域
半胱天冬酶-5房 协（宽/长）EHD卡，大域，小催化域
半胱天冬酶-9高，毫米（I/V/L）E（H/T）D卡，大域，小催化域
半胱天冬酶-11毫米（宽/长）EHD卡，大域，小催化域
半胱天冬酶-12毫米ATAD卡，大域，小催化域
半胱天冬酶-8高，毫米（I/V/L）E（H/T）DDED，大结构域，小催化域
半胱天冬酶-10房 协（I/V/L）E（H/T）DDED，大结构域，小催化域
半胱天冬酶-3高，毫米德克斯德大域，小催化域
半胱天冬酶-6高，毫米（I/V/L）E（H/T）D大域，小催化域
半胱天冬酶-7高，毫米德克斯德大域，小催化域
半胱天冬酶-14高秒，毫米（宽/长）EHD大域，小催化域
卡半胱天冬酶活化和募集领域
德德死亡效应域
房 协智人
毫米肌肉肌肉

表1:底物特异性和半胱天冬酶的蛋白质结构域。 该表改编自McStay等人20;沙利尼等人3;和范奥登博斯和兰坎菲4.

补充表1:DEVD动力学分析。请按此下载此表格。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在该方法中，荧光底物用于基于群体的测定或单细胞分析以测量半胱天冬酶-3 / 半胱天冬酶-7活性。两种方法都基于底物的裂解以定量方式测量半胱天冬酶活性。一个优点是能够将这些方法用于大量样品。使用这些方法，在用Smac模拟物处理的原代巨噬细胞中检测到半胱天冬酶-3 / caspase-7活性。

基于群体的荧光测定的一个关键方面是从裂解到读取荧光的时间。在整个过程中，样品必须保持在冰上，特别是在"读取"测定之前。这可以防止底物过早裂解和荧光。使用基于群体的测定，可能需要较少的优化。测定中使用的蛋白质量被标准化，允许直接比较样品。需要注意的是，在凋亡细胞死亡的晚期，总蛋白质量减少;因此，可能无法检测半胱天冬酶活性。建议使用不同的动力学或不同的治疗剂量来规避这个问题。此外，除了该方法中描述的软件之外，其他软件可用于准确评估半胱天冬酶活性的速率。

对于流式细胞术测定，需要足够的事件或细胞来自信地浇灌群体。此外，可能需要对基于流动的测定进行更多优化，以实现底物与细胞数的最佳比例。然而，使用流式细胞术，该方法有助于测量其他参数，例如用于细胞类型鉴定的细胞表面标志物。

群体和单细胞方法都可用于其他半胱天冬酶。然而，重要的是要记住，识别序列对其他半胱天冬酶的区分较少。因此，必须使用其他半胱天冬酶活性方法。这包括抑制半胱天冬酶活性，CRISPR或敲低特定半胱天冬酶，以及蛋白质印迹以检测已知底物的裂解。

检测半胱天冬酶活性的一种替代方法是延时成像。相同的可渗透半胱天冬酶底物可以与其他活力标志物（如膜联蛋白V）一起使用，以提供有关细胞死亡动力学的信息。成像还可以分离半胱天冬酶活性和细胞存活，从而可以检测细胞群中亚致死量的半胱天冬酶活性。半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7的非致死功能与先天免疫细胞29中的抗病毒调节有关，特别是通过线粒体DNA释放15，16激活I型IFN。因此，这些测量半胱天冬酶活性的测定对于识别不同的细胞死亡模式至关重要，并且可能有助于评估非细胞死亡功能。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.W.W.由Clöetta医学研究员资助，S.R.由CanDoc UZH Forschungskredit支持，J.T.由中国国家留学基金委支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Sarstedt72.706.400
15 cm 培养皿Sarstedt82.1184.500
37 度培养箱摇床IKA 摇床 KS 4000i97014-816由 VWR 分发
6 孔细胞培养皿Sarstedt83.392
96 孔平底，白色聚苯乙烯，未消毒SigmaCLS3600
96 孔平板Sarstedt82.1581
Ac-DEVD-AFCEnzo Life SciencesALX-260-032-M005Caspase-3 底物
BD FortessaBD任何具有适当激发和发射检测器的流式细胞仪都可以工作
b-甘油磷酸SigmaG9422-10G
caspase-3 重组 Enzo Life SciencesALX-201-059-U025
CHAPSSigma1.11662
DMEM、低葡萄糖、丙酮酸Thermoscientific31885023
DMSOSigmaD8418-250ML
EDTASigma03685-1KG
EGTASigma324626-25GM
依托泊苷MedChemExpressHY-13629
FBSThermoscientific26140
流式细胞仪管Falcon352008
FlowjoFlowjo需要许可证，但任何可以分析 .fcs 文件的程序都足够
了甘油SigmaG5516-500ML
HEPESSigmaH4034
Magic Red caspase-3/7 检测试剂盒;流式细胞术或成像免疫化学技术935
M-CSFebioscience14-8983-80现在是 Thermoscientific
M-PlexTecan任何荧光读数仪都可以与适当的激发和发射检测器配合使用
NaClRoth3957.1
PBS pH 7.4Thermoscientific10010023
青霉素-链霉素-谷氨酰胺 （100X）Thermoscientific10378016
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒ThermoFisher Scientific23225蛋白浓度检测
抑制剂BiomolP9070.100
Smac 模拟物，化合物 A四联体也称为 12911;结构显示在 Vince et 的补充图中等人，Cell 2007
氟化钠SigmaS7920-100G
原钒酸钠Sigma S6508-10G
焦磷酸钠SigmaP8010-500G
星形孢菌素MedChem ExpressHY-15141
蔗糖Sigma1.07687
Tris 碱SigmaT1503-1KG
Triton X100SigmaT8787-50ML
TrypLE热科学A1285901在方案中，它被列为胰蛋白酶
的子公司，蛋白酶

参考文献

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