多重条形码成像分析技术最近显著改进了对肿瘤微环境的表征，使得能够全面研究细胞组成、功能状态以及细胞间相互作用。本文中，我们描述了一种染色与成像方案，该方案利用寡核苷酸偶联抗体的条形码技术和循环成像，从而实现高维成像 分析技术的应用。
方法文章
用于石蜡组织样本单细胞分析中免疫谱型与空间定位特征的多重条形码图像分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
使用寡核苷酸抗体条形码技术进行多重成像，可在同一组织切片中依次检测多个表位，是一种用于肿瘤评估的有效方法，有助于深入理解肿瘤微环境。该技术可实现福尔马林固定、石蜡包埋组织中蛋白质表达的可视化 当特异性荧光染料与抗体结合的条形码退火时，即可实现组织的标记 通过 互补寡核苷酸，随后进行样本成像；该方法确实能够在单次组织染色反应中使用包含超过40种抗体的可定制化抗体组合。该技术适用于新鲜冷冻组织、福尔马林固定石蜡包埋组织、培养细胞以及外周血单核细胞，意味着研究人员可利用此技术在单细胞分辨率下观察多种类型的样本。该方法起始于人工染色与固定步骤，所有抗体条形码均通过抗体混合液（antibody cocktail）施加。染色流体装置完全自动化，可重复进行标记、成像及去除光谱上可区分的荧光染料的循环，直至使用标准荧光显微镜完成全部生物标志物的成像。随后，将所有成像循环中获取的图像进行收集与整合，以实现所有标志物的单细胞分辨率。单步染色与温和的荧光染料去除不仅支持高度多重的生物标志物分析，还可保留样本以供后续其他分析（如苏木精和伊红染色）使用。此外，图像分析软件支持图像处理中的漂移校正、背景扣除、细胞分割与聚类分析，以及图像和细胞表型的可视化与分析，从而生成空间网络图谱。总之，该技术利用计算机控制的微流控系统与荧光显微镜，反复进行与组织结合的寡核苷酸偶联抗体互补的荧光标记DNA探针的杂交、成像与剥离。
引言
肿瘤微环境（TME）具有高度异质性，包含肿瘤细胞、肿瘤间质细胞、免疫细胞、细胞外基质的非细胞成分，以及由肿瘤细胞、间质细胞和免疫细胞产生并释放的大量丰富分子1，2。越来越多的证据表明，TME 在重编程肿瘤的分化、生长、侵袭、转移以及对治疗的反应中发挥关键作用3。
了解肿瘤微环境（TME）中不同类型细胞如何通过信号网络相互作用和通讯，对于改进癌症诊断、优化免疫治疗以及开发新疗法至关重要4。传统的组织显微技术，包括免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF），已被用于研究肿瘤样本中的细胞类型、丰度及细胞间通讯达数十年之久。然而，这些技术通常只能在一张组织切片上检测一种或两种蛋白质标志物，无法揭示这些细胞之间复杂的空間和结构关系5,8,7。
在过去的二十年中，已建立多种多重成像技术8。这些技术显著改善了对肿瘤微环境（TME）中免疫细胞组成、功能和定位的观察，从而推动了在单细胞水平上识别和进行空间表征复杂TME的能力迅速发展9,10。目前，利用这些多重成像技术研究TME中各类肿瘤细胞与免疫细胞之间的空间和结构关系，已成为生物学和临床研究的前沿课题11,12。
近年来开发的基于寡核苷酸偶联抗体条形码技术的多重成像方法，是一种重要的单细胞生物学研究平台，其原理基于在福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）样本中检测寡核苷酸偶联抗体13,14目前，这种多重成像技术能够在单个组织切片中同时对超过100种标志物进行成像。15，这增加了可区分的细胞类型的数量 原位这使得对肿瘤细胞和免疫细胞的空间分析达到传统免疫表型分析方法无法实现的水平16.
本文介绍了一种优化的方案，用于将纯化的抗体与寡核苷酸进行偶联，并利用多重成像平台及多循环成像程序在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织上验证该偶联效果。此外，我们还描述了与此技术配套使用的基本图像处理与数据分析流程 。
方案
本回顾性研究已获得德克萨斯大学MD安德森癌症中心机构审查委员会的批准。福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本来自MD安德森癌症中心的患者，采集作为常规标准治疗的一部分。未对患者进行任何诊断或治疗性干预。已获得患者知情同意，允许将其提供的样本用于科研和发表。
1. 抗体组合设计中所用抗体的来源
- 在仔细评估组织质量和目标蛋白后，设计用于多重成像的抗体组合。抗体组合的设计考虑以下三种来源的抗体：1）完全经过商业验证的抗体，2）经多重成像技术筛选的抗体，以及 3）由终端用户共享的抗体。
注：经多重成像技术筛选的抗体已被证实有效，并可从供应商处获得。这些经过筛选的抗体可在用户完成寡核苷酸偶联后，用于多重成像染色。 - 如果在上述来源中无法找到目标蛋白对应的抗体，则可选用已知适用于免疫组化（IHC）的抗体克隆。此外，由于 IgM 克隆的失败率高于 IgG 克隆，因此建议在该多重成像技术中优先使用 IgG 同种型而非 IgM 克隆。
抗体偶联前的准备
- 在使用多重成像条形码鉴定用于偶联的抗体克隆时，建议购买溶于磷酸盐缓冲液（PBS）或类似缓冲液中的无载体蛋白抗体。已知载体蛋白（包括BSA、谷蛋白、甘油及其他蛋白质添加剂）会降低偶联效率。
- 选择最合适的抗体克隆，并在偶联前始终优化染色条件（即抗原修复和滴定）。可通过将未偶联的抗体克隆应用于该抗体的阳性和阴性组织样本，采用标准免疫荧光（IF）或免疫组化（IHC）方法进行验证。
注意：如果无法商业获取纯化抗体，则必须在偶联前进行抗体纯化处理。本文不讨论使用抗体纯化试剂盒的纯化流程。
3. 抗体偶联
- 获取抗体偶联试剂。市售的偶联试剂盒包含滤膜封闭液、还原液2、偶联液、纯化液、抗体储存液（均保存于4 °C），以及还原液1（保存于−20 °C）。
- 偶联
注意：将纯化的抗体用还原剂处理，使抗体的还原基团与该技术所用的多重成像条形码发生反应，从而形成共价键。该过程约需4.5小时，最终获得约120 μL偶联抗体，可稳定保存1年。所有离心步骤均在室温（RT）下进行，除最后一步（3.2.9）外，其余步骤的滤过液均应弃去，最后一步的收集管中含偶联抗体。- 使用移液器吸取500 μL滤膜封闭液，加入50 kDa分子量截留滤柱中，于12,000 x g离心2分钟，以阻断抗体的非特异性结合。
注意：若发现柱顶残留溶液明显，可将滤柱倒置放入收集管中，于3,000 x g离心2分钟。 - 将50 μg抗体溶于100 μL溶液中，移入滤柱，于12,000 x g离心8分钟。
注意：使用分光光度计测定纯化抗体的浓度，并计算对应50 μg抗体所需的溶液体积。若抗体溶液体积少于100 μL，可用1x PBS补足至100 μL。保留1 μg未偶联抗体用于偶联效果验证（步骤4.4）。 - 向每个滤柱中加入260 μL还原主混合液（由20 μL还原液1与825 μL还原液2混合而成，足以支持三次抗体偶联反应）。轻轻涡旋混匀2–3秒，或通过移液上下吹打使溶液与抗体充分混合。室温孵育30分钟。
- 孵育结束后，于12,000 x g离心滤柱8分钟。向滤柱中加入450 μL偶联液，再次于12,000 x g离心8分钟。
- 将所需条形码用10 μL无核酸酶水和210 μL偶联液重悬。
注意：应在染色前立即配制抗体标签。不得重复使用抗体条形码分装液。 - 完成步骤3.2.4的离心后，将重悬的抗体标签（约220 μL）加入对应的滤柱中。轻柔地上下移液混匀试剂。盖紧滤柱盖子，在室温下孵育偶联反应2小时。2小时后，于12,000 x g离心滤柱8分钟。
注意：建议取5 μL偶联溶液置于聚合酶链式反应管中，4 °C保存，用于后续验证流程（见下文）。 - 向每个滤柱中加入450 μL纯化液，于12,000 x g离心8分钟。重复此步骤三次。
- 向滤柱中加入100 μL储存液。轻柔地上下移液混合超过10次，并小心冲洗滤柱内壁。
注意：应将50 µg抗体溶解于100 μL储存液中。若偶联反应起始所用抗体超过50 μg，应按此比例增加储存液体积。 - 将滤柱倒置放入新的收集管中，于室温下3,000 x g离心2分钟。保留收集到的溶液。将偶联抗体溶液转移至无菌螺口管中，可在4 °C保存长达1年。
注意：偶联抗体应在制备后2天再使用多重成像技术进行检测。过早使用可能导致细胞核背景染色增强。
- 使用移液器吸取500 μL滤膜封闭液，加入50 kDa分子量截留滤柱中，于12,000 x g离心2分钟，以阻断抗体的非特异性结合。
4. 偶联确认
注意：在使用多重成像技术进行用户自行偶联抗体的染色实验之前，应通过凝胶电泳确认偶联效果，方法是使用5 μL偶联抗体（参见步骤3.2.6）以及1 μg未偶联抗体（通常为2 μL混合液）作为对照。成功的抗体偶联将表现为抗体分子量的增加。然而，该确认方案仅评估偶联化学反应的成功与否，并不涉及用于多重成像的抗体验证。
- 分别向预留的偶联抗体和对照未偶联抗体中加入 8 μL 和 11 μL 的无核酸酶水，使最终体积均为 13 μL。
- 向每份预留的偶联抗体样品中加入 5 μL LDS（或其他十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统）上样缓冲液和 2 μL 样品还原剂，并在 95 °C 干式加热器中变性 10 分钟。
- 在样品变性过程中，将 40 mL MOPS SDS 电泳缓冲液用 760 mL 超纯水稀释，将凝胶放入电泳装置的电泳槽中，并将稀释后的电泳缓冲液倒入槽内覆盖凝胶。
- 变性 10 分钟完成后，将一条预染蛋白标准品上样至凝胶的一个加样孔中，另一孔加入未偶联抗体（来自步骤 3.2.2），其余加样孔加入偶联抗体样品。随后在 150 V 电压下电泳，直至蛋白标准品迁移至凝胶底部。
注意：凝胶易粘附于微波安全容器，操作时可能撕裂，因此后续步骤中需小心操作。 - 电泳结束后，将凝胶转移至预先装有超纯水的微波安全容器中，并在微波炉中加热，直至水中出现第一个气泡。
注意：气泡形成所需时间因所用微波炉不同而有较大差异。 - 倒出容器中的水，向凝胶上加入约 250 mL 考马斯亮蓝 G-250 染色液，并在微波炉中加热至出现第一个气泡。随后取出装有凝胶和染色液的容器，置于摇床上染色 10 分钟。
- 染色后，小心倒出染色液，替换为约 200 mL 超纯水，将容器置于摇床上洗涤凝胶。
- 倒出超纯水，重复更换新超纯水洗涤五次，或直至水浴中不再明显可见染料残留。必要时将凝胶在摇床上过夜洗涤，直至条带清晰可见，再进行凝胶成像（图 1）。
注意：用于多重成像的抗体其染色模式应与染料偶联抗体相当。可使用已知表达目标抗原的组织切片，分别用寡核苷酸偶联抗体和染料偶联抗体进行染色。本研究中，在每种情况下，两种类型抗体的组织形态学结果一致且相互吻合，且与目标蛋白的生物学特性及测试组织样本中的预期细胞分布相符。该结果表明，寡核苷酸偶联抗体片段在基于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片的染色方法中具有良好的有效性。
5. 寡核苷酸偶联抗体染色
- 准备用于放置组织的盖玻片。
- 将盖玻片在0.1%多聚赖氨酸（poly-L-lysine）溶液中室温浸泡24小时，以增强组织附着能力。
- 浸泡后，倒掉多聚赖氨酸溶液，并用超纯水清洗盖玻片30秒，重复清洗四到六次。将用于清洗的超纯水中的盖玻片取出，置于无绒布巾上过夜干燥。
注意：组织学技术人员必须将选定的组织切成5 μm厚的切片，置于经多聚赖氨酸处理的盖玻片中央，并使其过夜干燥。干燥后，带有组织切片的盖玻片应储存在4 °C，储存时间不得超过6个月。本方案中的染色面板包含26个标记物。本方案所用组织为正常人扁桃体组织。盖玻片浸泡时间不应超过1周。涂覆多聚赖氨酸的盖玻片可在室温下保存，且必须在制备后2个月内使用。
- 染色前一天，将盖玻片架放入60 °C烘箱中过夜。
- 次日，将盖玻片样本放入预热至60 °C的盖玻片架中，并置于60 °C烘箱中。烘烤30分钟后，检查确认石蜡已从组织中完全熔化。
- 迅速将盖玻片架/样本依次浸入以下溶液系列：脱蜡剂中处理两轮，每轮6分钟；100%乙醇中处理两轮，每轮5分钟；90%乙醇中处理一轮，5分钟；70%乙醇中处理一轮，5分钟；50%乙醇中处理一轮，5分钟；30%乙醇中处理一轮，5分钟；以及二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理的超纯水中处理两轮，每轮5分钟。
注意：所有乙醇稀释液均使用DEPC处理的超纯水配制。若使用二甲苯进行脱蜡，应在通风橱中操作。 - 在将盖玻片架/样本进行溶液处理的同时，执行以下操作：
- 通过在空移液枪头盒底部放置浸水的纸巾，制备一个湿化室。
- 在压力锅中加入足量水，使水位达到50 mL烧杯的一半高度。
- 在4 °C条件下，每个样本向烧杯中加入5 mL甲醇。
- 用DEPC处理的超纯水将AR9缓冲液稀释至1x浓度；每个盖玻片架约需50 mL稀释后的缓冲液。
- 完成溶液处理后，向一个50 mL玻璃烧杯中加入约40 mL的1x AR9缓冲液，将盖玻片架/样本浸入烧杯中，并用铝箔完全覆盖烧杯及盖玻片架。
- 将包有铝箔的烧杯/盖玻片架放入盛水的压力锅中，在高压（约15 psi）下加热20分钟。
- 加热完成后，取出烧杯/盖玻片架，小心揭开铝箔，让其在室温下冷却约10分钟。
- 将盖玻片架/样本从1x AR9缓冲液中取出，浸入DEPC处理的超纯水中两轮，每轮孵育2分钟。
- 在孵育期间，从多重成像染色试剂盒中取出水合缓冲液、N阻断剂、G阻断剂、J阻断剂、S阻断剂以及抗体稀释液/阻断剂。对于两个盖玻片样本，按照图2所示配置，在6孔板中标记各溶液。
- 将盖玻片样本分别在5 mL水合缓冲液中处理两轮，每轮2分钟。
- 完成两轮水合缓冲液处理后，将盖玻片样本放入5 mL多重成像抗体稀释液/阻断剂中，在室温下孵育20–30分钟（不得超过30分钟）。
- 在孵育期间，通过配制200 μL的主混合液来准备抗体混合液，主混合液包含多重成像抗体稀释液/阻断剂、N阻断剂、G阻断剂、J阻断剂和S阻断剂。
注意：根据标记物数量及每个标记物的验证滴定比例计算所需总抗体体积，并从主混合液中减去该体积。例如，对于6个标记物，每个标记物滴定比例为1:200，则计算公式为：200 μL主混合液 − 6 μL抗体混合液 = 194 μL主混合液。
- 在多重成像抗体稀释液/阻断剂中孵育后，将盖玻片样本放入步骤5.5.1中准备的湿化室中，用移液器将190 μL抗体混合液滴加到盖玻片样本上，在室温下孵育3小时。
- 孵育结束后，用5 mL多重成像抗体稀释液/阻断剂清洗盖玻片样本两轮，每轮2分钟。
- 为将结合的抗体固定在盖玻片上的组织中，请在湿化室中执行步骤5.7.3–5.7.5。
- 用储存液将16%甲醛稀释至1.6%，与盖玻片共同孵育10分钟，然后用1x PBS清洗盖玻片三次。
- 用4 °C甲醇与盖玻片共同孵育5分钟，然后用1x PBS清洗盖玻片三次。
- 用1x PBS稀释的固定试剂5 mL与盖玻片共同孵育20分钟，然后用1x PBS清洗盖玻片三次。
- 将染色后的盖玻片样本置于储存缓冲液中，于4 °C保存，最长可保存2周。
6. 多重成像报告板
注意：根据定制设计的多重成像实验，准备一个96孔板（称为报告板），其中各个孔内含有条形码荧光染料，并与每个染色的盖玻片样本相对应。以下步骤为报告板的制备方法。
- 通过混合 4,880 μL 无核酸酶水、600 μL 10x 多重成像缓冲液、500 μL 检测试剂和 20 μL 核染色溶液，制备报告分子主混合液。该混合液足以用于所有孔的 20 个循环。
- 在定制的多重成像实验的每个循环中，向一个孔中加入 245 μL 溶液，该溶液包含报告分子主混合液以及该循环特异的条形码荧光染料。
注：有关本方案中用于癌细胞系 panel 的报告分子板布局，请参见 图 3。 - 为保护条形码荧光染料，将铝箔板盖贴附于报告分子板上，并将该板放入多重成像仪器中。
- 将报告分子板置于避光盒中，在 4 °C 下保存最多 2 周。
7. 校准并运行多重成像仪器
注意：高分辨率成像荧光显微镜在每次多重成像循环中以20倍放大、100%激发光强度以及低光漂白条件捕获四个不同的荧光通道。
- 使用DAPI通道校准成像焦点：将样本盖玻片放置在显微镜载物台上，手动移取700 μL 1:1,500稀释的核染色液至组织上。
注意：在样本洗涤和成像过程中，盖玻片始终保留在显微镜载物台上。 - 准备多重成像仪器时，使用DEPC处理的超纯水将10x多重成像缓冲液稀释至1x，并向试剂瓶中加入适当的溶液/溶剂，包括稀释后的1x多重成像缓冲液、DEPC处理的超纯水和二甲基亚砜（DMSO）。
- 试剂瓶填充完毕后，在多重成像仪器管理软件中输入实验设计；为每个循环指定正确的循环次数、孔号、z轴堆叠位置、标记物名称、类别和曝光时间（图4）；设置所有显微镜参数；并在样本盖玻片上选择需要成像的感兴趣区域。
- 在控制软件中点击实验按钮（图4A）。在实验设置与管理窗口中，点击新建模板按钮（图4B）。
- 在项目按钮旁边的空白处输入项目名称（图4C）。输入或选择总循环次数（图4D）。
- 点击通道分配按钮，将每个循环的信息填入对应列中（图4E），然后点击保存模板按钮。点击开始实验按钮以启动实验。
注意：在多重成像实验过程中，仪器从报告板的一个孔中取出条形码荧光染料（每孔最多四种荧光染料，包括DAPI），直接将其分配到样本盖玻片上，并对每个荧光通道的感兴趣区域进行成像。完成该循环的所有成像后，仪器将条形码荧光染料洗去，并分配下一循环的报告分子（来自报告板上的下一个孔）。成像持续进行，直至完成使用26种标记物的所有循环。
8. 图像采集
注意：可使用任何配备四个荧光通道（DAPI、Cy3、Cy5 和 Cy7）并装有 Plan Fluor 20x 物镜的倒置荧光显微镜采集多重图像。使用专门开发的流体装置，自动迭代执行盖玻片样本的成像和洗涤步骤。图像通过 Processor 软件（v1.8.0.7）以 QPTIFF 格式获取。
- 在处理器窗口中，点击 输入 按钮，然后选择实验名称。
- 在 处理选项 部分，选中并勾选 背景减除、去卷积、扩展景深 和 阴影校正。点击 开始 按钮。
9. 图像分析
注意：所获取的图像可上传至已获专利的自动化图像分析软件或开源软件程序（图5）进行下游分析。
- 点击 QuPath 在计算机上点击图标，打开软件。将 QPTIFF 文件拖至 观众 窗口
- 点击 亮度 & 对比度 按钮，将打开 亮度 & 对比度 窗口。勾选或取消勾选标记 已选 列，用于显示或关闭标记信号。
- 点击 缩放以适应 点击按钮以放大或缩小目标区域。
注意：多重图像数据可视化可为用户提供对组织微环境的深入观察。在FFPE样本中，各个标志物可通过荧光形式进行可视化（图6 和 图7）或病理学视图中进行。可使用多种计算平台来处理复合图像并分析多重组织图像数据。利用该软件，可对超高度多重组织的全切片图像实现空间表型分析、稀有细胞发现以及细胞邻域计算。 通过 多重成像技术。参见 图6 针对癌细胞系抗体组和扁桃体样本中的26种抗体（补充图1).
结果
我们采用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的扁桃体样本，开发了一种包含26种标志物的免疫肿瘤学检测面板，以利用条形码成像分析系统展示FFPE组织中的免疫状态。总体而言，其中19种抗体目前已在本实验室其他多重成像研究中使用。所有标志物均已在FFPE组织上通过显色免疫组化（IHC）进行了验证。所有抗体均与独特的DNA寡核苷酸偶联。在使用基于网络的仪器管理器设置盖玻片时图4）对于此条形码图像分析技术，需要注意的是，第一轮和最后一轮循环始终为“空白”（图2 和 图 4），用于从抗体的特异性信号中减去背景荧光信号。在荧光显微镜下采集QPTIFF格式的图像后，可使用多种专利的自动图像分析软件或开源软件程序进行可视化分析。复合图像可显示所有标记物或选定的标记物，以便更清晰地观察信号（图5）。此外，可对每种抗体的核、胞质或膜表达定位进行直观评估。免疫细胞、肿瘤细胞和间质细胞可被清晰识别。随后进行图像分析 可提供有关所有标记物的信号强度、动态范围和空间分布的信息（图6）。该技术使我们能够在单个组织切片中于亚细胞水平分析全部26种标志物图7通过分析标志物的共定位，我们能够鉴定细胞表型、确定细胞的空间位置、计算细胞间的距离，并揭示细胞的分布特征。该技术的关键意义在于提供了一个包含26种标志物的稳定检测组合，专注于组织微环境中免疫状态的评估。
图1：使用Bis-Tris蛋白凝胶进行定制偶联抗体验证的图像。 凝胶的第1道为蛋白质标准品。第2道和第4道显示条形码偶联抗体（箭头）。第3道和第5道显示未偶联抗体的重链和轻链条带（箭头头）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：两个盖玻片样本的染色板配置图。 缩写：HB = 水合缓冲液；B = 抗体稀释/封闭液；PSFS = 染色后固定液；PBS = 磷酸盐缓冲盐水；MeOH = 甲醇；S = 储存液。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：报告板配置。 每种偶联抗体均具有与特定报告分子互补的条形码。为设置报告板，应列出每种偶联抗体及其对应的报告分子。接下来，为每种抗体分配一个循环编号。通过执行两个空白循环（C1 和 C18）来评估三个荧光通道中的自发荧光水平，并在成像后使用图像采集控制软件进行背景扣除。此时，软件向导将检查仪器，以确保所有设置正确（图4）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：使用实验控制软件进行图像采集。（A）在控制软件的左下角选择实验选项卡，以准备并启动设置。（B、C）选择新建模板，输入新的项目名称和实验名称以配置实验参数。（D）更改起始循环孔位及循环次数，以反映报告基因在96孔报告板中的位置。（E）为实验运行指定的四个通道分配适当的荧光通道。请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：使用基于网络的软件（QuPath）进行图像可视化。 查看窗口显示了染色的扁桃体组织FFPE切片中的26个标记物。亮度与对比度窗口中显示了已勾选的标记物。最后，查看窗口展示了选中标记物的FFPE样本。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：使用基于网络的软件进行图像可视化。（A）扁桃体组织切片经26种标志物染色后，以QPTIFF格式获取图像，并使用商业数字切片浏览软件或开源软件（QuPath）进行注释与审阅。（B–F）在同一注释区域中显示六种标志物，以便更清晰地观察信号。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：使用基于网络的软件观察的26个独立标记物的视图。 扁桃体组织中标志物的表达情况如图所示 通过 使用免疫肿瘤学抗体组合进行免疫荧光染色（左上）。显示两个小区域（红色矩形框）内的单独标志物。放大插图显示表达这些标志物的细胞（白色箭头）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 8：多重图像采集工作流程的总结。 采用包含26种抗体的抗体组合对FFPE组织切片进行染色，随后进行多轮循环反应。对染色切片的原始图像进行计算处理，并利用合成图像进行细胞密度和空间分布分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充图1：扁桃体组织中的IHC验证。 使用单克隆抗体对FFPE组织切片进行染色。低倍镜下显示扁桃体组织中的标志物表达情况，放大插图显示标志物阳性细胞（红色矩形框）。请点击此处下载该文件。
讨论
肿瘤微环境（TME）在癌症的发生、发展及治疗反应中起着至关重要的作用。此外，TME中特定肿瘤浸润淋巴细胞亚群的密度可作为某些类型癌症的预后生物标志物。值得注意的是，除了TME的细胞组成外，肿瘤的空间特征也可为理解肿瘤生物学行为和识别潜在的预后生物标志物提供重要线索12,17。
由于多种免疫细胞群体参与促癌或抗肿瘤反应，深入理解这些细胞及其与彼此之间、以及与肿瘤细胞之间的空间关系，将有助于指导发现新的免疫治疗策略。以往的研究根据肿瘤内区域、肿瘤周围区域以及肿瘤细胞侵袭边缘的组织结构，对肿瘤微环境（TME）中细胞的位置和空间分布进行了分层分析18,19。在过去15年中，技术的进步使得基于细胞空间分布的单个细胞表型分析成为研究肿瘤微环境及分类潜在肿瘤免疫治疗生物标志物的一种新颖且具有影响力的方法。多重免疫荧光组织化学技术可同时检测多种生物标志物20。
与寡核苷酸偶联抗体策略类似，目前有四种基于蛋白质的多重检测平台用于研究肿瘤微环境（TME）：染色原标记、荧光标记、DNA条形码标记和金属同位素标记的抗体检测系统。成本较低的染色原免疫组化（IHC）平台可利用常规明场显微镜实现全切片可视化和病理学评估。在多重荧光免疫组化（IF）和IHC中，使用与荧光染料偶联的抗体。多重IF/IHC平台具有高特异性，能够对靶向抗体进行检测，甚至可在亚细胞水平实现定量分析6,21。此外，由于染色原和荧光染料的特性，单张切片上使用一组抗体即可同时检测多达10种生物标志物的表达。在基于金属同位素的平台上，采用金属标记的抗体进行具有单细胞分辨率和空间分辨能力的多重成像，对单个组织切片具有高灵敏度22。理论上，这些金属偶联抗体方法可在单个组织切片上同时检测超过100种生物标志物。同位素标记技术的一个挑战是同量异位素干扰，这使得富集纯度无法达到100%23。此外，随着检测标志物数量的增加，干扰也会随之增强。DNA偶联抗体检测平台则通过识别带有独特DNA条形码标记的抗体来实现检测。这些平台可同时以高特异性捕获超过40种生物标志物6。
多重成像是一种商业化的基于DNA条形码标记抗体的检测平台，可将DNA偶联抗体一步法应用于单个组织切片（图8）。在组织制备阶段，与需要使用厂家提供的金镀膜载玻片的多重离子束成像平台不同，多重成像平台仅需使用常规盖玻片或涂有0.1%多聚-L-赖氨酸的载玻片，以帮助组织贴附并在染色和成像过程中保持组织完整性。建议在切片后4周内使用盖玻片上的组织切片，因为未染色载玻片长期储存会导致抗原性降低。染色后的盖玻片样本可在4 °C的储存缓冲液中保存长达2周，且不会丧失染色信号。盖玻片样本的储存无需特殊设备。多重成像系统已升级为使用常规载玻片替代盖玻片，从而可对更大组织进行染色并便于操作。在使用还原溶液进行抗体偶联时（步骤3.2.3），反应时间应限制在不超过30分钟，以防止抗体受损。步骤5.6.6中的封闭缓冲液应新鲜配制，且不得重复使用。
与染色原、荧光及金属同位素标记的多重抗体检测平台相比，多重成像技术具有一定的优势。例如，目前市面上已有超过60种预设计的多重成像抗体组合可供选择，有助于节省抗体偶联与验证所需的时间和成本，且预设计抗体组合的数量仍在持续增加。这些抗体包括上皮癌标志物广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin）、黑色素瘤标志物SOX10、血管标志物CD31、基质标志物SMA以及多种免疫细胞标志物，均已通过验证，可直接用于实验。对于未预设计的抗体，市面上有专为多重成像技术设计的商用偶联试剂盒，操作简便、易于使用。用户自行偶联的抗体在4 °C保存条件下可稳定保存1年。此外，图像采集过程中无需对仪器进行预热。在该多重成像技术中，图像获取过程中的反复洗涤、杂交与剥离步骤极少导致标志物信号强度下降或组织形态受损。5,24,25此外，可使用简单的三色荧光显微镜以 QPTIFF 格式采集复合图像，并可通过第三方数字分析软件进行上传和分析。染色标记可在单细胞分辨率下可视化，从而实现细胞表型的鉴定。 通过 标记物的共定位（图6 和 图7）。对多重图像的综合分析进一步揭示了组织区室、单细胞标志物定量以及最近邻和邻近性数据（图8).
多重图像分析中的一个挑战是细胞类型的鉴定。通常情况下，当对图像应用更多的单对象分类器时，会标注出更多罕见的表型。因此，建议使用在同一种分类器中不共表达的已知标记物，并仅将与表型相关的分类器用于单个细胞的注释。细胞类型注释的差异将导致显著不同的空间分析结果，例如细胞空间分布和细胞邻域分析的差异26,27。
多重图像分析已成功应用于多种样本类型的染色与成像，包括福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）、新鲜冷冻组织、存档的全切片以及组织微阵列。乳腺、脑、肺、脾、肾、淋巴结和皮肤组织切片的多重图像均可获取，并获得深度的单细胞空间表型数据5,16,25,28。
未来，有望出现更多用于多重成像的预设计抗体。此外，亟需开发专门用于多重图像分析的软件。目前已有多种可用于Hi-Plex图像分析的商业及开源软件程序29，但科研人员仍需帮助以建立标准化的分析工作流程30,31。尽管本方案获得的复合图像可兼容第三方软件，但这可能增加用户的额外成本。多重成像技术的另一缺点是在使用大量抗体进行反复洗涤、杂交和剥离后，核蛋白检测信号会减弱。幸运的是，在设计报告板时，可在早期循环中回收条形码荧光染料，从而最大限度地减少该问题。最近，该平台已升级为新型高速扫描系统，显著缩短了获取复合图像所需的时间32。此外，已有研究报道采用酪胺偶联条形码的新策略，以增强基于寡核苷酸偶联抗体条形码的成像效果。该技术旨在放大那些难以获得条形码偶联抗体的靶标的染色信号33。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢MD安德森癌症中心研究医学图书馆编辑服务部的Donald R. Norwood对本文的编辑工作，以及MD安德森癌症中心转化分子病理学系多重免疫荧光和图像分析实验室的支持。本项目部分得到了MD安德森癌症中心转化分子病理学系转化分子病理学-免疫谱分析实验室（TMP-IL）Moonshots平台以及美国国家癌症研究所合作协定U24CA224285（授予MD安德森癌症中心CIMAC）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x AR9缓冲液 | Akoya Biosciences | AR900250ML | |
| 10x 缓冲液 | Akoya Biosciences | 7000001 | |
| 16% 甲醛 | 赛默飞世尔科技 | 28906 | |
| 1X 抗体稀释液/封闭液 | Akoya Biosciences | ARD1001EA | |
| 抗体偶联试剂盒 | Akoya Biosciences | 7000009 | 包含滤过阻断液、抗体还原溶液1、抗体还原溶液2、偶联溶液、纯化溶液、抗体储存液 |
| 检测试剂 | Akoya Biosciences | 7000002 | |
| 焦碳酸二乙酯 | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| 二甲基亚砜 | Avantor/VWR | BDH1115-4LP | |
| 乙醇，200 proof | |||
| G区阻断剂 V2 | Akoya Biosciences | 240199 | |
| Histoclear | 赛默飞世尔科技 | 50-329-50 | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Milli-Q Integral 10 | Millipore | ZRXQ010WW | |
| 尼康荧光显微镜 | 基恩士美国公司 | BZ-X810 | |
| 核染色 | Akoya Biosciences | 7000003 | |
| 无核酸酶水 | 赛默飞世尔科技 | AM9938 | |
| NuPAGE | 赛默飞世尔科技 | NP0008 | |
| PBS | 赛默飞世尔科技 | 14190136 | |
| PhenoCycler 条形码/报告基因组合 | Akoya Biosciences | 5450004 (BX025/RX025) | |
| 5450003 (BX022/RX022) | |||
| 5450023 (BX002/RX002) | |||
| 5250002 (BX020/RX020) | |||
| 2520003 (BX023/RX023) | |||
| 5250005 (BX029/RX029) | |||
| 5250007 (BX035/RX035) | |||
| 5250012 (BX052/RX052) | |||
| 5550012 (BX030/RX030) | |||
| 5550015 (BX042/RX042) | |||
| 5550014 (BX036/RX036) | |||
| QuPath | 开源 | https://qupath.github.io/ | |
| SimplyBlue SafeStain | 赛默飞世尔科技 | LC6065 | |
| 染色试剂盒 | （Akoya 生物科学公司 | 7000008 | 包含水合缓冲液、N阻断剂、J阻断剂、S阻断剂、固定试剂、储存缓冲液 |
参考文献
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