利用加热块测定浮游动物的热耐受极限

摘要

本方案介绍了利用市售组件产生稳定且线性温度梯度的方法。该温度梯度可用于测定浮游生物（尤其是无脊椎动物幼虫）的最高耐热极限。

摘要

温度耐受极限和耐受范围被广泛用于预测物种分布。随着全球气温持续上升，了解温度耐受极限如何随驯化而变化，以及其在不同生活阶段和种群间的差异，对于评估物种在未来变暖环境下的脆弱性至关重要。大多数海洋生物具有复杂的生活史，包含早期浮游阶段。尽管量化这些微小早期发育阶段（数十至数百微米）的温度耐受极限有助于识别发育瓶颈，但由于目标生物体积极小、实验台空间需求大以及初始制作成本高，这一过程可能具有挑战性。本文介绍了一种适用于小体积（毫升至数十毫升）样品的实验装置。该装置结合多种市售组件，可产生稳定且线性的温度梯度。同时提供了该装置的制作规格，以及引入样本、区分并计数存活与死亡个体、计算致死温度的操作步骤。

引言

耐热性对生物体的生存和功能至关重要^1,2。由于人类活动导致的碳排放持续引起地球变暖，人们对热耐受极限的测定及其应用日益关注³。已有多种终点指标被用于确定生物的上限和下限热耐受极限，例如死亡、发育失败以及运动能力丧失等⁴。这些热耐受极限通常被用作生物体热生态位的替代指标。该信息进而可用于识别对全球变暖更为脆弱的物种，并预测未来物种的分布格局及其相互作用关系^3,5,6,7。然而，确定热耐受极限，特别是对于小型浮游生物而言，仍具有挑战性。

对于浮游生物，特别是海洋无脊椎动物的幼虫阶段，其热耐受极限可通过长期暴露实验来确定。长期暴露实验通过在数天至数周内将幼虫在多个不同温度下培养，并确定导致幼虫存活率和/或发育速率下降的温度来实现^8,9,10。然而，这种方法较为耗时，且需要大型培养箱以及幼虫培育方面的经验（有关海洋无脊椎动物幼虫培养的入门介绍，请参见参考文献¹¹）。

此外，也可通过急性热应激暴露来确定生物的耐热极限。该方法通常包括将装有幼虫的小瓶置于温度可控的干浴器中^12,13,14，利用PCR仪的温度梯度功能^15,16，或将玻璃小瓶或微量离心管放置于大型铝块的孔洞中，铝块两端分别施加加热和冷却以形成温度梯度，小瓶紧密嵌入孔中^17,18,19。典型的干浴器仅能产生单一温度，因此需同时运行多个设备以评估不同温度下的表现。热循环仪可生成温度梯度，但仅适用于小体积样品（120 µL），且操作需格外谨慎。与热循环仪类似，大型铝块可建立线性且稳定的温度梯度。这两种方法均可结合逻辑回归或概率单位回归分析，计算导致50%个体死亡的致死温度（LT₅₀）^12,20,21。然而，所用铝块长度约为100 cm，占用较大的实验室空间，且需要专用的数控铣床来钻孔。此外，还需配备两台科研级水浴装置以维持目标温度，整套装置的构建成本较高。

因此，本研究旨在利用市售部件开发一种替代方法，以产生稳定的线性温度梯度。该装置应具有较小的占用空间，并能够方便地用于浮游生物的急性热应激暴露实验。本实验方案以体型小于<1 mm的浮游动物为研究对象，因此已针对1.5 mL或2 mL微量离心管的使用进行了优化。对于体型更大的研究对象，则需要使用大于1.5 mL微量离心管的容器，并扩大铝块上的孔径。

除了提高实验装置的可及性之外，本研究 旨在 简化数据处理流程。尽管商业统计软件提供了使用逻辑回归或概率回归计算 LT₅₀ 的常规方法，但其授权费用不容忽视。因此，依赖开源统计软件 R²² 的易用脚本将使数据分析更加便捷。

本方案展示了如何使用市售部件制作一个紧凑型加热块，并将其应用于对浮游动物（沙钱Dendraster excentricus的幼虫）施加急性热应激，以确定其最高耐热极限。

方案

1. 加热块的制备

1. 将120 V、100 W的条状加热器连接至变阻器（参见 材料表).
2. 通过在铝块上钻出60个呈6×10网格排列的孔洞（见 材料表）。确保孔与孔之间在两个方向上的中心间距为 2 cm，每个孔的直径为 1.1 cm，深度为 4.2 cm（图1).
   注意：在铣床或钻床上使用高速钢钻头进行钻孔。加热元件和冷却元件均被选择为尽可能覆盖15.2 cm × 5 cm接触表面的大部分区域。
3. 在其中一个20.3 cm × 5 cm的表面上，于1之间再钻两个孔^st 和 2^nd 柱和9^th 和 10^th 柱，尺寸与温度控制器探头相匹配（参见 材料表).
4. 使用1.2厘米（0.5英寸）透明亚克力板构建一个外壳（参见 材料表）以固定各部件并为完成的加热块提供绝缘。使用两层丙烯酸材料对加热元件的背面进行绝缘（图1).
5. 在最终组装时，涂抹导热硅脂（参见 材料表以最大化加热元件向金属块以及金属块向冷却元件的热传导。

2. 热梯度设置的确定

1. 使用Tygon管将水浴槽/水族箱冷却器连接（参见材料表）。根据需要使用泡沫管绝缘材料对管道进行隔热。
2. 将温控探头插入铝块侧面的孔中。确保探头1位于加热元件附近。
3. 将装满自来水（1.5 mL）的微量离心管插入所有铣削孔中（共60个管）。
4. 打开温度控制器，将探头1的停止加热温度设置为35–37 °C，探头2设置为21.5–22.5 °C。
   注意：所用温控器具有两个独立运行的输出端口；在此特定应用中，仅使用探头1来调节高温端。因此，将探头2的温度设为低温端温度。
5. 旋转调压变压器以启动加热元件，并将其调至中档。
6. 打开水浴槽/水族箱冷却器，并将冷却器温度设为15 °C。
7. 10分钟后检查铝块一端是否变热，另一端是否变冷。
   警告：加热元件的裸露部分可能很烫，请勿触碰。
8. 此后每隔10分钟使用带有K型电极的热电偶（参见材料表）检测每个微量离心管内的温度。约60分钟后温度将趋于稳定，并呈现线性分布（图2）。
9. 根据需要调整温度控制器和水浴装置的设置，以校准两端温度值。

3. 热暴露及活细胞：死细胞计数

注意：一旦确定了温度梯度的所需设置，即可省略步骤2。

1. 开启循环水浴和加热器，并分别设置为 15 °C 和 37 °C，以形成从 19.5 °C 到 37 °C 的温度梯度。
2. 为确保热梯度呈线性分布，将装满自来水（1.5 mL）的微量离心管插入所有铣削孔中（共 60 支管）。
3. 等待 45–60 分钟，使加热模块达到设定温度。使用带有 K 型电极的热电偶测量每支微量离心管内的温度，确认其是否达到预期温度，并记录这些温度值。
4. 若研究对象的个体尺寸>500 µm，且易于从一个容器转移至另一容器（例如桡足类），则在 1.5 mL 微量离心管中加入 750 µL 的 0.45 µm 滤海水；反之，若研究对象体型较小，则在 1.5 mL 微量离心管中加入 250 µL 的 0.45 µm 滤海水。
   注：代表性数据中使用了沙钱（Dendraster excentricus）受精后第 2、4 和 6 天的幼体（参见材料表）。这些个体的平均大小（± 标准差，n = 15，每个年龄组）分别为 152 ± 7 µm、260 ± 17 µm 和 292 ± 14 µm。由于这些幼体易于浓缩（见步骤 3.5），因此微量离心管中均加入 750 µL 滤海水。
5. 通过反向过滤法浓缩研究对象的培养液（即将筛网置于盛有研究对象的容器中，从筛网上方抽除水分），使研究对象保留在烧杯底部¹¹。
   注：本实验中所用沙钱幼体采用 30 µm 尼龙筛网（参见材料表）。
6. 用滤海水冲洗浓缩后的动物样品（例如在使用藻类食物或其他化学物质培养时）。再进行一次反向过滤，以进一步浓缩动物样品。
7. 将已知数量的个体放入半满的微量离心管中。在体视显微镜下计数小型浮游生物（参见材料表），并使用玻璃巴斯德移液管进行转移。
   注：放入的生物数量取决于其大小；对于约 200 µm 大小的沙钱幼体，每支微量离心管放入 20 个个体较为合适。
   注意：优先使用玻璃移液管而非塑料移液管，因为某些浮游生物具有疏水性，会粘附在塑料表面。
8. 向含有动物的微量离心管中加入 0.45 µm 滤海水，直至最终体积为 1 mL。
9. 为使生物逐步升温至目标实验温度，将步骤 3.7 中准备好的含动物的微量离心管从加热模块的低温端开始放置。每排放置一对微量离心管（共 12 支管）。
10. 静置 10 分钟。
11. 将步骤 3.9 中插入的成对微量离心管移至相邻温度更高的钻孔中，并在每排的低温端补充新的成对微量离心管。此时每排将有四支管。再静置 10 分钟。
12. 持续以成对方式将含动物的微量离心管从低温端向高温端移动并补充新管，每次移动后静置 10 分钟，直至加热模块完全填满。
    注：步骤 3.9–3.12 被视为升温阶段，旨在使研究对象经历的温度逐步升高。
13. 让动物在指定温度下孵育 2 小时。此步骤为实验的恒温暴露阶段。
    1. 若孵育时间超过 2 小时，应每小时使用热电偶检测一次微量离心管的温度。
       注：根据实验需求调整孵育时间。若孵育时间超过 2 小时，需定期使用热电偶检查管内温度，以防设备意外故障。为尽量减少对研究对象的干扰，可随机将六支或更多仅含滤海水的微量离心管插入模块中用于温度监测。
14. 孵育结束后，使用带 K 型电极的热电偶测量每支微量离心管内的温度，并记录这些数值。
15. 取出全部 60 支含动物的微量离心管，并将其放入预先标记好的支架中。
16. 将这些管（步骤 3.14）在预定温度（如培养温度）下继续孵育 1 小时，作为恢复期。
    注：恢复期时长可能因物种而异。对于沙钱幼体，培养温度为 18 °C，因此样品被置于环境培养箱中。请参考相关文献和/或开展预实验，以确保存活与死亡计数不受恢复期长短的影响。在代表性数据中，恢复 1 小时后存活的动物数量与恢复 12 或 24 小时后的数量一致。
17. 为统计热暴露后存活的研究对象比例，使用玻璃移液管将单支微量离心管的内容物转移至 35 mm 培养皿中。
18. 在体视显微镜下观察并记录仍具活动能力（存活）的个体数量，以及停止游动或溶解（死亡）的个体数量。确保观察到的个体总数等于步骤 3.7 中放入管内的数量。若数量不符，应检查微量离心管壁及培养皿边缘是否有遗漏个体。

4. LT₅₀ 的计算

1. 生成一个 CSV 格式的表格，至少包含以下列标题：感兴趣的分组变量、试管温度（°C）、存活个体数和死亡个体数。
   注意：在代表性数据中，感兴趣的分组变量被“年龄”替代，因为目标是比较不同年龄组之间的差异。
2. 为使用逻辑回归拟合数据，应采用二项分布的广义线性模型。补充代码文件 1 展示了使用开源软件 R²² 的示例脚本。
3. 为确定中位上临界热耐受值（LT₅₀），需计算个体存活率为 50% 时对应的预测变量值（即温度）。补充代码文件 2 展示了在 R²² 中使用 MASS²³ 包的 dose.p 函数的示例脚本。

结果

本实验方案的目标是确定浮游动物的上限耐热温度。为此，需要建立一个稳定且线性的温度梯度。通过将水浴温度设定为 8 °C、加热器设定为 39 °C，该装置能够产生从 14 °C 到 40 °C 的温度梯度（图 2A）。通过调节两端温度设定值，可缩小或移动该温度梯度范围。例如，将加热器设定为 37 °C、水浴设定为 15 °C 时，也可生成一个范围更窄的温度梯度（19 °C 至 37 °C）。装置搭建后 45 分钟至 1 小时内，模块内的温度即可达到稳定（图 2B）。

为了说明本方案在浮游动物中的应用，研究了沙钱（Dendraster excentricus）幼虫在个体发育过程中上临界温度极限（以LT₅₀表示）的变化。成熟怀卵的沙钱从商业渠道获得（参见材料表）。通过注射0.5–1 mL的0.35 M氯化钾诱导配子释放。收集的卵用0.45 µm过滤海水经63 µm尼龙筛网冲洗。精子以干法收集并置于冰...

讨论

本方案通过急性热暴露，提供了一种简便且可定制的方法，用于测定小型浮游生物的热耐受极限。该装置采用10孔设计，低温端由水浴控制，高温端由加热器控制，具有灵活的温度终点设置，可精确测定LT₅₀。使用该方法可检测到小于<1 °C的热耐受差异（图3）。该方法可在数小时内快速测定多种物种的热耐受极限，所得数据已应用于多个物种分布模型^2,21。然而需要注意的是，与慢性暴露相比，急性暴露所获得的热耐受估值可能存在差异^8,26。

当前设计的一个主要优势是，在较小的空间（20.3 cm × 15.2 cm × 5 cm）内即可实现10个温度处理和6个重复。以往采用类似热梯度方法测定热耐受极限的研究使用了更大的铝制导热条（例如，文献²⁷...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.45 µm 膜过滤器	VWR	74300-042
½” 丙烯酸板	McMaster-Carr	8560K266	用于构建具有足够隔热性能的刚性外壳。
1 mL 注射器	VWR	76290-420
双通道 7 型热电偶数据记录仪	Omega Engineering	HH506A	可用任何可放入微型离心管的温度计替代
自动移液器	Ranin
带 430 不锈钢护套的螺栓和夹具安装条形加热器 120V 交流，1-1/2" 宽，100W	McMaster-Carr	3619K32
Crystal Sea 生物测定混合物	Pentair	CM2B	用于配制人工海水
Denraster excentricus	M-Rep		来自加利福尼亚的沙钱
解剖显微镜	Nikon	SMZ645
DIYhz 铝制水冷块，适用于 PC 计算机 CPU 图形散热器的液态水冷却散热系统，吸热头银色（40 mm x 120 mm x 12 mm）	Amazon		连接至水浴，用于冷却模块的一端。
易加工 MIC6 铸造铝板，厚度 2"，尺寸 8" x 8"	McMaster-Carr	86825K953	加工成 2" x 6" x 8"，带有 60 个等距孔（直径 11 mm，深度 42 mm），并在一侧额外钻两个孔用于恒温探头。
经济型柔性聚乙烯泡沫管绝缘材料	McMaster-Carr	4530K121	覆盖在冷却器与模块之间的塑料管上，以减少热量损失。若温度范围接近室温，可省略
EVERSECU 72w 110-240v 水族箱水冷加热/冷却温度控制器，适用于鱼虾缸、海洋珊瑚礁缸，适用于 20 L/30 L 以下水族箱冷却器	Amazon		可替代实验室级水浴
以幼体沙钱为例
GENNEL 100 g 银色硅胶导热硅脂，适用于 GPU、CPU、IC、LED、烤箱冷却	Amazon		提高模块与加热和冷却元件之间的热传导效率。
Inkbird WiFi 爬行动物恒温控制器，带两个探头和两个输出口，IPT-2CH 爬行动物加热垫恒温器（每输出口最大 250 W）	Amazon		监测热端和冷端，维持热端在设定范围内
Lauda Ecoline Silver 风冷式制冷循环器	VWR	89202-386	可用 aquarium chiller 替代
微型离心管	VWR	76019-014	若使用较大的动物，可选用扫描瓶（VWR 66022-004）作为替代方案
Nitex 网格滤膜	自制		使用热熔胶将 Nitex 网格固定在 1/2" PVC 管上
巴斯德移液管	VWR	14673-010
氯化钾（0.35 M）	Millpore-Sigma	P3911-500G
R 统计软件	The R Project for Statistical Computing
注射器针头	VWR	89219-346	根据目标生物的大小，可选用 14 号或 16 号规格的针头
Tygon 管	McMaster-Carr	5233K65	可根据所用冷却器和模块调整尺寸
Zoo Med Repti Temp 可变电阻恒温器	Chewy.com		额定功率 150 W，已重新布线以直接向加热元件供电，用于控制热量输出速率