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方法文章

研究去卵巢小鼠模型中子宫对妊娠建立作用的方法

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DOI：

10.3791/64763

⸱

2023年4月7日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, 2Gynaecology Research Centre, Royal Women’s Hospital and Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Melbourne, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute for Medical Research and Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

妊娠建立是一个动态过程，涉及胚胎与子宫之间复杂的相互作用。母体子宫环境在这些过程中的确切作用仍是当前研究的活跃领域。本文提供了详细的实验方案，以协助设计 体内 用于回答这些研究问题的动物模型。

摘要

要成功建立妊娠，一个具有活力的胚泡必须与容受性的子宫内膜成功相互作用，以促进着床和胎盘形成，并维持妊娠的持续发展。由胚胎缺陷导致的妊娠成功率限制问题早已被充分认识，并且随着近年来辅助生殖技术的进步，在很大程度上已得到克服。 体外 体外受精（IVF）与辅助生殖技术。然而迄今为止，该领域尚未克服因子宫内膜容受性不足所导致的局限性，从而造成体外受精成功率停滞不前。卵巢功能与子宫内膜功能密切相关，因为卵巢分泌的激素调控着子宫内膜的月经周期性变化。因此，在使用啮齿类动物妊娠模型时，往往难以确定所观察到的结果究竟是源于卵巢功能缺陷还是子宫功能缺陷。为解决这一问题，研究人员建立了去卵巢小鼠模型，并结合胚胎移植或人工诱导蜕膜化，以专门研究子宫在妊娠过程中的特异性作用。本文将详细介绍去卵巢手术的操作步骤，并深入探讨多种外源性激素补充技术，以支持来自健康供体的胚胎移植后实现成功的人工蜕膜化或妊娠。这些技术包括皮下注射、缓释颗粒植入以及渗透压微型泵给药。文章还将分析每种方法的主要优缺点，帮助研究人员根据其具体科学问题选择最适宜的实验设计。

引言

近年来，随着辅助生殖技术的广泛应用，许多生育障碍已被克服，使许多面临不孕问题的夫妇得以建立家庭1。卵子或精子缺乏通常可通过体外受精（in vitro fertilization）或卵胞浆内单精子注射技术解决；然而，与子宫及子宫内膜容受性相关的问题仍然是生殖潜能中一个难以捉摸的"黑箱"领域2。

当优质胚胎与容受性良好的子宫内膜（子宫内壁）成功相互作用时，妊娠得以建立。在任何一个月经周期中，成功妊娠的几率较低，约为30%3,4。在成功妊娠的案例中，仅有50%至60%能够维持到妊娠20周以上，而未能达到20周的妊娠中，75%是由于着床失败所致3。尽管这些数据最早可追溯至20世纪90年代末期，但该领域至今仍未克服子宫内膜容受性不足所带来的限制。这导致近年来体外受精（IVF）的成功率停滞不前，甚至在某些情况下出现下降5,6。

不明原因不孕的女性常出现接受性时间窗偏移，或因未知原因无法达到接受状态。近年来开发了子宫内膜接受性分析技术，该技术通过检测数百个基因的表达情况，旨在根据个体的接受性时间窗个性化调整胚胎移植时机7,8,9。然而，目前学术界仍缺乏对胚胎着床完成后出现的妊娠并发症发病机制的理解。

女性生殖系统具有高度动态性，并受到严格的激素调控。下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴控制黄体生成素和卵泡刺激素的释放，这两种激素调节卵巢周期的多个方面，包括卵泡成熟以及雌激素和孕激素的活性。反过来，子宫的月经周期则由雌激素和孕激素调控10,11。因此，卵巢的影响使子宫生物学机制的研究变得复杂。例如，在研究癌症治疗对子宫可能产生的影响时，很难区分所观察到的子宫表型（如妊娠丢失或月经周期紊乱）是由于对子宫的直接损伤所致，还是继发于卵巢受损的间接效应。

为了全面理解生育能力，必须明确子宫对妊娠的贡献。尤为重要的是，这种理解必须超越卵巢调控下的子宫功能。这一问题无法在人类中进行研究，因此常采用动物模型。其中，卵巢切除术（OVX）被广泛用于通过外源性给予激素来调控啮齿类动物的动情周期（类似于月经周期）。此外，OVX 可使研究人员在排除卵巢影响的情况下独立研究子宫的反应12。然而，若在 OVX 后未立即给予激素，将出现类似更年期的表型，研究人员需对此予以充分考虑。

卵巢切除术（OVX）在啮齿类动物模型中被广泛使用13,14,15,16,17，经过充分培训后操作相对简便。具体方法因仅切除卵巢或同时切除卵巢和输卵管而异，也取决于动物的年龄（成年、处于动情周期的动物卵巢较大，表面可见黄体，因此更易于识别卵巢）。同样，激素补充的方法也有多种，包括皮下注射14、缓释颗粒15、渗透压微型泵18以及卵巢移植。

本文详细介绍了如何进行卵巢切除术，并制备三种类型的激素补充方式，包括皮下注射、缓释颗粒和渗透压微型泵。文中提供了两项详细的实验方案，适用于在卵巢切除术后进行外源性激素补充的实验终点（胚胎移植和人工脱膜化）。本文讨论了每种方法的优缺点，旨在指导研究人员开展研究，以分离和评估对子宫的影响，特别是在妊娠和生育力研究领域。

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方案

所有动物均饲养于温度可控的高屏障设施中（莫纳什大学动物研究实验室），自由获取食物和水，光照周期为12小时明/12小时暗。所有实验程序均经莫纳什动物研究平台伦理委员会批准（#21908，17971），并遵循澳大利亚国家卫生与医学研究委员会《动物护理与使用实践规范》进行。

1. 手术准备

  1. 将手术所需的所有手术器械、纱布和纸巾在121 °C条件下，使用干燥程序进行高压灭菌，保温30分钟，干燥30分钟。
  2. 铺设无菌手术台垫作为手术工作区，并准备镇痛药物。
    1. 用无菌生理盐水将卡洛芬稀释至1 mg/mL，将布比卡因稀释至0.5%（w/v）溶液。
    2. 在400 mL笼用饮水瓶中加入3.5 mL美洛昔康。
  3. 预先加热恢复笼的加热垫，并设置加热灯，使光线间接照射恢复中的动物。
  4. 确保穿戴所有适当的个人防护装备（PPE），包括发网、口罩、防护服和手套。
  5. 严格执行无菌操作技术，包括定期用乙醇喷洒手套，并在接触动物或手术器械前待其完全挥发，以避免乙醇污染。

2. 进行卵巢切除术

  1. 使用异氟烷气体麻醉机，将诱导箱以4 L/min的流速预充3-5分钟，异氟烷浓度设为5%。
  2. 将小鼠放入诱导箱中，待其失去意识后，转移至鼻罩，并将流速降低至0.4 L/min，异氟烷挥发罐设置为约2.5%。
    注意：在后续操作过程中所使用的异氟烷浓度应根据小鼠品系、年龄以及是否接受过治疗（如化疗）进行调整，并需密切观察每只动物的呼吸模式。呼吸应保持规律的腹式呼吸。若出现快速的胸式呼吸，可能提示未达到或维持足够的外科麻醉深度；此时应根据需要调整异氟烷挥发罐的浓度。
  3. 通过挤压眼膏管，将眼用润滑剂充分涂抹于眼球表面，并轻轻点涂。
  4. 在脊柱隆起处及其下方剃除一块约2 cm × 2 cm的小区域毛发。
  5. 从浓度为1 mg/mL的稀释液中皮下注射5 mg/kg的卡洛芬，注射部位为颈背部皮肤皱褶处。
  6. 通过夹捏小鼠后肢脚趾测试麻醉深度。若无脚趾回缩反应，则表明动物已进入深外科麻醉状态，可继续进行手术操作。
  7. 用聚维酮碘对术区进行消毒，并覆盖手术洞巾（可用一块中央剪出2 cm × 2 cm窗口的纱布代替）。
  8. 使用齿状镊向上提起背部脊柱隆起处的皮肤，做一条长约5 mm的纵向切口。
    注意：在动物背部较高位置做皮肤切口有利于手术夹的固定，从而减少动物自行拆除夹子的可能性，降低夹子修复需求。
  9. 使用钝头镊子将皮肤与下方肌肉层进行钝性分离，向下方及一侧方向推进至肾脏区域。
  10. 通过肌肉壁肉眼辨识肾脏、卵巢及卵巢脂肪垫。
    注意：肾脏呈深红色，脂肪垫呈亮白色；若可见，卵巢表现为脂肪垫内一个微小的粉红色小点。
  11. 用镊子夹住并提起肌肉层，使用锐利的手术剪做一条长约0.5–1 cm的切口。继续用镊子固定肌肉壁，然后换用钝头镊子将卵巢脂肪垫从切口中拉出。
  12. 使用弯头持针器，在子宫角远端下方夹住卵巢和输卵管。
    注意：也可仅切除卵巢而保留输卵管完整。但此操作需使用解剖显微镜以准确区分卵巢与输卵管。
  13. 使用手术剪或手术刀切除卵巢。夹闭持续30秒，以防止出血过多。
  14. 松开止血夹，必要时用无菌纱布轻拭止血。
  15. 缝合肌肉层切口时，使用镊子提起切口上缘，使切口自然对合。
  16. 使用丝线缝合线（规格3-0）以外科结方式缝合肌肉层 切口。
  17. 使用1 mL无针头注射器在切口局部滴加2–3滴布比卡因，并在对侧重复步骤2.9–2.17。
  18. 缝合皮肤切口前，用纱布吸干多余的布比卡因，使皮肤切口两侧对合并压紧。
  19. 施加1–2个7 mm的外科缝合夹，预留适当空间以容纳愈合过程中的组织肿胀。
  20. 将小鼠转移至恢复笼中，并密切观察15分钟。
    注意：动物应迅速苏醒，需特别注意监测其是否恢复正常的胸式呼吸节律。

3. 激素制备：皮下注射

  1. 制备1 mg/mL的雌二醇储备液。
    1. 将0.001 g（1 mg）雌二醇粉末称量至1.5 mL无菌离心管中。
    2. 向管中加入1 mL 100%乙醇，涡旋震荡数秒。
      注意：乙醇将保持澄清，但可见雌二醇粉末的微小颗粒。
    3. 用封口膜包裹管口，防止乙醇挥发。
    4. 再用铝箔纸包裹离心管，并置于摇床上过夜，以彻底溶解雌二醇粉末。
    5. 用芝麻油将该1 mg/mL储备液稀释至所需终浓度。
      注意：在人工蜕膜化前进行预处理时，需连续3天给予100 ng剂量；当给予孕酮时，还需额外给予25 ng的低剂量。这是为了对抗调控孕酮受体表达的反馈环路。对于胚胎移植，需在移植前第1天和第3天各给予一次100 ng剂量，并在胚胎移植当天同时给予25 ng的低剂量。
    6. 用1 mL注射器吸取所需量的油中雌二醇溶液，然后安装26 G针头。
    7. 按照所需频率进行皮下注射（可注射于颈背部或侧腹部；用于胚胎移植前预处理或人工蜕膜化或胚胎移植时的剂量分别为100 ng/100 µL或25 ng/100 µL）。
      注意：油剂黏度较高，因此注射时应缓慢推注，并在拔出针头前暂停数秒，以尽量减少注射部位的油剂渗漏。
  2. 制备200 mg/mL的孕酮储备液。
    1. 将0.4 g（400 mg）孕酮粉末称量至5 mL无菌离心管中。
    2. 向管中加入2 mL 100%乙醇，涡旋震荡数秒。
      注意：乙醇将变为白色。
    3. 重复步骤3.1.3–3.1.4。
    4. 用芝麻油将200 mg/mL储备液稀释至所需终浓度。
      注意：为支持胚胎移植，需每日给予2 mg剂量。
    5. 按照步骤3.1.6–3.1.7的方法进行皮下注射适当剂量（例如，每日100 µL中含2 mg以支持妊娠）。

4. 激素制备：缓释颗粒

  1. 在超净工作台或II级生物安全柜表面铺上一层铝箔。
  2. 将所有设备（手套、培养皿、1 mL注射器、精细镊子）放入生物安全柜中，并开启紫外灯照射20分钟。
    注意：密封剂不得暴露于紫外灯下，否则会固化。
  3. 用100%乙醇清洗硅胶管，然后在生物安全柜中自然晾干。干燥后，沿管壁每隔约1 cm做标记，并用手术刀切割。
  4. 取下注射器的活塞，挤入约200 μL密封剂，重新插入活塞，并推动少量密封剂排出注射器前端。
  5. 取少量密封剂涂抹于管段一端，并用戴着手套的手指将其抹平。
  6. 在生物安全柜内避光过夜干燥，或在紫外灯下照射20–30分钟使其固化。
  7. 将适量孕酮倒入已灭菌的培养皿中。用镊子夹取管段，将其开口端浸入孕酮粉末中以填充内容物。
    1. 轻敲管段已封口的一端，使孕酮粉末沉降压实；也可使用灭菌镊子末端将孕酮压紧。注意预留足够空间以便后续添加密封剂。
  8. 参照步骤3.4–3.5的方法，用密封剂封闭管段的开口端。
  9. 用铝箔包裹含有孕酮缓释颗粒的培养皿，避免光照。
  10. 在皮下植入前，将颗粒置于37 °C、1%活性炭处理胎牛血清（cs-FCS: PBS）中孵育至少72小时以激活释放。
    注意：可预先批量制备仅单端封口的空颗粒，并保存备用。但每次使用时应填充新鲜孕酮粉末。填充前须确保预制颗粒已通过紫外灭菌。每颗颗粒可持续释放约500 µg/天的孕酮，维持6–10天，足以支持人工蜕膜化及胚胎移植操作；然而，若需维持孕酮受体活性超过4–5天，可能需额外注射低剂量雌激素。超过10天后，可能需要更换新的孕酮缓释颗粒。

5. 激素制备：渗透压微型泵

  1. 将黄体酮配制成所需浓度的水溶液，并选择合适的微型渗透泵型号（参见材料表）。
    注意：在第7节（实验步骤：胚胎移植）中，需要持续12天每天释放2 mg黄体酮。因此，每只动物需将28 mg黄体酮溶于约100 µL无菌水中（请根据制造商说明调整具体体积）。可能需要进行系列稀释。在第8节（实验步骤：人工蜕膜化）中，需要连续3天每天释放500 µg黄体酮。因此，每只动物需将1,500 µg黄体酮溶于约100 µL无菌水中。准备额外的溶液以补偿填充过程中的体积损失。
  2. 在II级生物安全柜内准备好设备（手套、低纤维擦拭纸、培养皿、无菌生理盐水、1 mL注射器、小型称量舟、铝箔和精度为0.01 g的天平），然后开启紫外灯照射20分钟。
  3. 用1 mL注射器吸取激素溶液，然后连接无菌填充管，小心操作以确保无气泡存在。
  4. 将泵体及其流量调节器置于无菌称量舟中称重。
  5. 将填充管从泵顶部的开口插入，直至无法继续推进为止。
  6. 保持泵体直立，缓慢推动注射器活塞以填充管道。
    注意：应避免快速填充，否则可能导致气泡进入泵体内。
  7. 当溶液从泵顶部溢出时，轻轻拔出填充管，并用无菌低纤维擦拭纸擦去多余液体。
  8. 将流量调节器从泵顶部开口插入，直至完全进入。完全插入后，用力将泵体与流量调节器压紧。
  9. 对已填充溶液并安装好流量调节器的泵进行称重。
    注意：步骤5.3和步骤5.8所得重量之差即为所加载溶液的净重（例如，重量增加0.1 g相当于加入了100 µL溶液）。
  10. 将填充完毕的泵放入盛有无菌生理盐水的无菌培养皿中。
  11. 所有泵填充完成后，用铝箔包裹培养皿，并置于37 °C培养箱中至少预平衡4–6小时（或直至准备使用为止）。

6. 手术操作：皮下激素丸剂和微型泵的植入

  1. 按照第1节（手术准备）进行区域准备。
  2. 按照步骤2.1–2.3对动物进行麻醉。
  3. 剃除颈部背侧小块区域的毛发（约1 cm × 1 cm）。
  4. 从1 mg/mL的稀释溶液中皮下注射5 mg/kg卡洛芬 ，注射部位为腿部侧腹 。
  5. 测试脚趾夹捏反射。若无反射，表明动物已进入深度手术麻醉状态，可开始操作。
  6. 用聚维酮碘对术区进行消毒，并覆盖手术洞巾（一块中央剪有2 cm × 2 cm窗口的纱布）。
  7. 使用鼠齿镊向上提起颈部背侧皮肤（位于颈背部正中与背部隆起之间的中点处），做一条约5 mm的纵向切口。
  8. 使用钝头镊子向下钝性分离皮肤与下方肌肉层。
    注意：若植入渗透压微型泵，应沿动物一侧创建皮下囊袋，以避免泵体限制动物活动或压迫切口部位。
  9. 当为激素丸或微型泵创建足够空间后，使用无菌镊子夹取丸剂或微型泵，并将其插入钝性分离形成的皮下囊袋中。
  10. 在闭合皮肤切口前，确保激素丸或微型泵已充分置入囊袋内，以免手术夹损伤装置。
  11. 按照步骤2.17局部应用布比卡因。
  12. 使用一个手术夹闭合伤口。将小鼠转移至恢复笼中，密切观察15分钟。由于该操作时间较短，动物通常在数分钟内即可恢复自主活动。

7. 实验步骤：胚胎移植

  1. 对于卵巢切除的动物，在胚胎移植前3天，通过皮下注射100 ng/100 µL雌二醇进行激素预处理（步骤3.1）。
  2. 在胚胎移植前一天，通过皮下注射2 mg/100 µL醋酸甲羟孕酮对动物进行激素预处理（步骤3.2）。
  3. 按照第1节（手术准备）准备操作区域。
  4. 按照步骤2.1–2.3对动物进行麻醉。
  5. 按照步骤2.4–2.10开始操作。
  6. 在解剖显微镜下，使用26 G针头尖端在子宫内创建注射位点。
  7. 用移液器将五个囊胚转移至M2培养基液滴中，然后将其注入子宫角。
  8. 关闭肌层切口时，用镊子提起切口上缘，使切口自然闭合。
  9. 使用丝线缝合肌层切口，并打外科结。局部涂抹布比卡因滴剂。
  10. 在另一侧重复步骤7.5–7.8。
  11. 关闭皮肤切口时，用纱布轻轻吸干多余的布比卡因，然后将皮肤两侧压合在一起。
  12. 使用一到两个外科夹闭合切口，预留足够空间以适应愈合过程中的肿胀。
    注意：若动物已进行卵巢切除，则在胚胎移植时需外源性激素支持。可选择皮下注射黄体酮（2 mg），或植入皮下黄体酮缓释丸或渗透压微型泵。为对抗过量黄体酮，需在胚胎移植时皮下注射低剂量雌激素（25 ng/100 µL）。
  13. 小心将小鼠转移至恢复笼中，并密切观察15分钟。
    注意：动物应迅速苏醒；务必密切观察其呼吸，确保胸式呼吸模式正常。

8. 实验步骤：人工蜕膜化

  1. 在人工蜕膜化前8天，按照第3节（激素处理：皮下注射）的方法，在第1、2、3天每天对动物进行100 ng/100 µL雌二醇的激素预处理。
  2. 在人工蜕膜化前2天，按照第3节（激素处理：皮下注射）的方法，在第7、8、9天每天对动物进行5 ng/100 µL雌二醇的激素预处理。
    注意：最后一次注射必须在人工蜕膜化操作前至少3小时（最多4小时）完成。
  3. 在人工蜕膜化前2天，按照第4、5和第8节的方法，对动物植入皮下孕酮缓释丸或微型渗透泵（500 µg/天）进行激素预处理。
  4. 按照第1节（手术准备）准备操作区域。
  5. 按照步骤2.1–2.2对动物进行麻醉。
  6. 通过脚趾夹捏反射测试麻醉深度。若无脚趾回缩反应，则表明动物已进入深度外科麻醉状态，可继续操作。
  7. 将小鼠置于俯卧位，提起尾巴，缓慢将直径为6 mm的阴道扩张器插入阴道。
  8. 保持动物鼻部处于麻醉鼻罩中，将动物下半身置于非优势手的食指与中指之间，用拇指轻轻向上推起尾巴，以保持阴道开口视野清晰。
  9. 使用非手术胚胎移植枪（连接20 µL移液器）将20 µL芝麻油注入一侧子宫角。
    1. 保持移液器与阴道口水平，将枪头插入阴道并通过宫颈进入子宫角。当枪头进入子宫角后，轻轻将其抵住子宫内膜表面（若采用上述操作手法，此动作可通过中指感知），然后缓慢推出油液。
      注意：保持移液器按钮压下状态，等待10秒以确保油液完全扩散，同时在保持按钮压下的情况下缓慢撤出移植枪头。
  10. 从阴道中取出扩张器。
  11. 小心将小鼠转移至恢复笼中，并密切观察15分钟。
    注意：动物应迅速苏醒。需密切观察其呼吸，确保为正常的胸式呼吸模式。
  12. 尽量减少对动物的干扰，并在术后96小时内将其置于安静环境中饲养。
    注意：噪音或光暗周期的剧烈变化会影响操作成功率。在组织解剖时，可通过子宫重量与体重的比值评估蜕膜化成功的程度。人工蜕膜化操作的成功率约为80%。因此，应排除未成功蜕膜化的动物，并在确定实验样本量时考虑此因素。

9. 手术操作：术后恢复、监测及夹子修复

  1. 术后让动物在加热垫上半覆盖、半暴露的条件下过夜恢复，然后再将其放回原饲养笼具中。
  2. 术后每天观察动物5天，密切注意伤口部位是否有感染迹象。
  3. 必要时进行手术夹重置。
    1. 按照第1节（手术准备）的方法准备手术区域。
    2. 按照步骤2.1–2.3的方法对动物进行麻醉。
    3. 如果原有手术夹仍然存在，使用取夹器将其移除。
    4. 按照步骤2.19–2.21的方法安装新的手术夹。
  4. 术后7天时按照步骤9.3.1–9.3.3的方法拆除手术夹，或在动物下一次接受麻醉时拆除（例如进行胚胎移植、人工蜕膜化操作或术后皮下注射时）。

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结果

本方案论文描述了一种经过充分表征的人工蜕膜化模型（图1A）。在此，使用8周龄的年轻成年雌性小鼠，按照第1节和第2节所述进行手术切除卵巢。随后，小鼠休养2周，以确保内源性卵巢激素完全消退，之后按照第3–7节和第9节所述给予外源性激素支持。通过阴道内注射芝麻油诱导人工蜕膜化，随后动物继续休养直至组织采集，具体操作见第9节。本研究在C57BL6/J小鼠中进行人工蜕膜化，该品系为常用的小鼠品系。在组织采集时记录小鼠体重，并完整剥离子宫组织，修整后称重（图1B）。通过将子宫重量与体重的比值表示，以评估蜕膜反应的程度。本研究中，80%的C57BL6/J小鼠成功蜕膜化（0.01012 ± 0.001515，n = 15），而20%的小鼠子宫未发生蜕膜化（0.002108 ± 0.0001764，n = 3）（图1C）。

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讨论

本文提供了关于如何进行卵巢切除术（OVX）并给予外源性激素的分步操作指南，适用于研究子宫在妊娠和生育能力中作用的相关研究。文中详细介绍了这两种方法的两个实验应用方案，包括胚胎移植操作和人工诱导蜕膜化。

尽管最初进行卵巢切除术（OVX）可能具有挑战性——尤其是对于刚接触啮齿类动物模型的研究人员而言——但经过适当的培训和练习后，这是一项相对简单的手术。该手术的关键步骤包括在动物处于麻醉状态时密切监测其生命体征，并确保彻底清除所有卵巢组织。在某些动物模型中，可选择保留输卵管。然而需要注意的是，输卵管是一种激素响应性组织，富含雌激素和孕激素受体19。与仅切除卵巢而保留输卵管的手术相比，同时切除卵巢和输卵管的外科操作更为简便，前者仅凭肉眼即可完成。若需仅切除卵巢而保留输卵管，则必须使用解剖显微镜，因为该操作更为精细复杂。因此，手术时间可能延长，因为在手术过程中需要将动物在解剖显微镜载物台与手术区域之间反复移动，以完成诸如缝合腹壁内层等不同步骤。

此处详述的镇痛方案为莫纳什大学动物伦理委员会...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务或其他利益冲突。

致谢

本研究得益于维多利亚州政府运营基础设施支持以及澳大利亚政府国家卫生与医学研究理事会（NHMRC）独立研究机构基础设施支持计划（IRIISS）的资助。本研究还获得了莫纳什大学医学、护理与健康科学学部平台访问资助（Winship-PAG18-0343）的支持，该资助授予A.L.W.，用于访问莫纳什生殖服务技术平台。A.L.W. 获得了澳大利亚研究理事会（ARC）DECRA项目基金（DE21010037）的支持。J.N.H. 和 L.R.A. 获得了澳大利亚政府研究培训计划奖学金的支持。L.R.A. 还获得了莫纳什大学研究生卓越奖学金的支持。K.J.H. 获得了澳大利亚研究理事会未来研究员项目（FT190100265）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ALZET 1002 型微型渗透泵BioScientific1002递送 0.25 µL/h，持续14天。用于第7节（实验步骤—胚胎移植）。
ALZET 1003D 微型渗透泵BioScientific1003D递送 1 µL/h，持续14天。用于第8节（实验步骤 - 人工蜕膜化）。
ALZET Reflex 7 mm 夹子BioScientific0009971可根据个人偏好选择使用 Reflex缝合夹或Michel缝合夹进行伤口闭合
ALZET Reflex 夹钳式施用器BioScientific0009974可根据个人偏好选择使用 Reflex缝合夹或Michel缝合夹进行伤口闭合
ALZET Reflex 夹移除器BioScientific0009976可根据个人偏好选择使用 Reflex缝合夹或Michel缝合夹进行伤口闭合
布比卡因注射液辉瑞NA储存液浓度0.5%，使用时用生理盐水稀释至0.05%
雌二醇SigmaE8875
美洛昔康髂骨NA活性成分为 0.5 mg/mL。每 400 mL 笼具饮水瓶中使用 3.5 mL，或按机构兽医的处方使用。
米歇尔夹丹尼尔斯NS-000242
多功能密封剂道康宁732
非手术胚胎移植（NSET）装置ParaTechs60010含6 mm窥器。仅限一次性使用。
孕酮SigmaP0130可溶于乙醇。用于  第3部分（激素制备——皮下注射）以及  第4节（激素制备——缓释颗粒）
孕酮SigmaP7556溶于水。用于第5节（激素制备—渗透微型泵）
更新眼膏AllerganNA42.5% w/v 液体石蜡，57.3% w/v 软白石蜡
Rimadyl 卡洛芬硕腾NA储备液 50 mg/mL。使用浓度为 1 mg/mL（对应剂量为 5 mg/kg）
橡胶管道康宁508-008用100%乙醇洗涤并切成1 cm的片段。内径1.57 mm ±  0.23 mm；外径 3.18 mm ± 0.23 mm；壁厚 0.81 mm。
芝麻油SigmaS3547
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参考文献

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