小鼠卵巢表观基因组与转录组的细胞特异性成对解析

摘要

在本实验方案中，利用 Cyp17a1-Cre 小鼠品系与 NuTRAP 小鼠模型杂交，优化了翻译核糖体亲和纯化（TRAP）方法和特定细胞类型标记核分离（INTACT）方法，以实现对细胞特异性卵巢转录组和表观基因组的联合分析。

摘要

评估细胞类型特异性的表观基因组和转录组变化对于理解卵巢衰老至关重要。为此，本研究优化了核糖体亲和纯化（TRAP）方法和特定细胞类型标记核分离（INTACT）方法，并利用一种新型的转基因NuTRAP小鼠模型，对卵巢中特定细胞的转录组和表观基因组进行配对分析。NuTRAP等位基因的表达受一个两侧带有loxP位点的STOP盒调控，可通过启动子特异性的Cre小鼠品系靶向特定的卵巢细胞类型。由于近期研究提示卵巢间质细胞在驱动早衰表型中发挥重要作用，本研究采用Cyp17a1-Cre驱动子将NuTRAP表达系统靶向至间质细胞。结果表明，NuTRAP构建体的诱导表达特异性地局限于卵巢间质成纤维细胞，并且从单个卵巢中即可获得足够量的DNA和RNA用于测序分析。本文所描述的NuTRAP模型及方法可与任何已有Cre品系的卵巢细胞类型联用，以开展相关研究。

引言

卵巢在体细胞衰老过程中起着关键作用¹，其中特定细胞群体具有各自独特的贡献。由于卵巢具有高度的细胞异质性，因此难以解释来自整体卵巢组织批量检测的分子结果。明确特定细胞群体在卵巢衰老中的作用，是识别导致老年女性生育力下降及健康状况恶化的分子驱动因素的关键。传统上，对特定卵巢细胞类型的多组学评估依赖于激光显微切割²、单细胞技术³或细胞分选⁴等方法。然而，显微切割成本较高且操作困难，而细胞分选可能改变细胞的表型特征⁵。

一种评估卵巢细胞类型特异性表观基因组和转录组谱的新方法利用了核标记与翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP）小鼠模型。NuTRAP模型能够在无需细胞分选的情况下，通过亲和纯化技术——翻译核糖体亲和纯化（TRAP）和特定细胞类型中标记细胞核的分离（INTACT）⁶，实现细胞类型特异性核酸的分离。NuTRAP等位基因的表达受一个两侧带有loxP位点的终止盒（floxed STOP cassette）调控，并可通过启动子特异性的Cre小鼠品系靶向特定的卵巢细胞类型。通过将NuTRAP小鼠与特定细胞类型的Cre小鼠杂交，可在Cre依赖的方式下移除STOP盒，从而使核糖体复合物被eGFP标记，细胞核被生物素/ mCherry标记⁶。随后可利用TRAP和INTACT技术从目标细胞类型中分离mRNA和核DNA，并进一步进行转录组和表观基因组分析。

NuTRAP 模型已应用于多种组织，如脂肪组织⁶、脑组织^7,8,9和视网膜¹⁰，以揭示在全组织匀浆样本中可能无法检测到的细胞类型特异性表观基因组和转录组变化。与传统细胞分选技术相比，NuTRAP 方法具有以下优势：1）避免了离体（ex vivo）操作引起的激活假象⁸；2）减少了对专用设备（如细胞分选仪）的需求；3）提高了细胞类型特异性分析的通量并降低了成本。此外，从单只小鼠中分离出细胞类型特异性的 DNA 和 RNA，可实现配对分析，从而增强统计效能。鉴于近期研究提示卵巢间质细胞在驱动早衰表型中发挥重要作用^11,12,13，我们利用 Cyp17a1-Cre 驱动系统将 NuTRAP 表达系统靶向定位于间质细胞和膜细胞。本文证明，NuTRAP 构建体的诱导表达特异性地发生在卵巢间质细胞和膜细胞中，并且从单侧卵巢即可获得足够用于测序研究的 DNA 和 RNA。本文所展示的 NuTRAP 模型及方法可与任何现有的 Cre 工具小鼠品系联用，以研究任意类型的卵巢细胞。

为了构建细胞类型特异性的卵巢 NuTRAP 小鼠品系，核标记与翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP）等位基因包含一个两侧带有 loxP 位点的终止密码子（floxed STOP codon），用于调控 BirA、生物素连接酶识别肽（BLRP）标记的 mCherry/mRANGAP1 以及 eGFP/L10a 的表达。当该品系与特定细胞类型的 Cre 小鼠品系杂交后，NuTRAP 表达盒将以 Cre 依赖的方式，用生物素和 mCherry 标记核蛋白 mRANGAP1，同时用 eGFP 标记核糖体蛋白 L10a。这种方法使得无需细胞分选即可从特定细胞类型中分离出细胞核和 mRNA。通过将 NuTRAP^flox/flox 与适用于卵巢细胞类型的细胞特异性 Cre 品系配对，可实现对这类细胞的特异性分析。

方案

所有动物实验程序均获得俄克拉荷马医学研究基金会（OMRF）机构动物护理和使用委员会的批准。亲代小鼠购自杰克逊实验室（缅因州巴尔港），并在OMRF的高效微粒空气（HEPA）屏障环境中，于14小时光照/10小时黑暗循环（光照开启时间为早上6:00）的无特定病原体（SPF）条件下饲养和繁殖。

注意：在本实验中，我们使用雄性 Cyp17iCre^+/−（品系编号 #028547，杰克逊实验室）与雌性 NuTRAP 小鼠（品系编号 #029899，杰克逊实验室）进行配对。目标子代 Cyp17-NuTRAP 小鼠（Cyp17iCre^+/−; NuTRAP^flox/WT）将在卵巢间质细胞中，在Cyp17a1 启动子的调控下表达 NuTRAP 等位基因。本研究使用 4 月龄的雌性 Cyp17-NuTRAP 小鼠（n = 4）。从小鼠耳组织样本中提取 DNA 进行基因型鉴定，以确认 Cyp17iCre 和 NuTRAP 转基因的遗传，并通过 PCR 检测：1）通用 Cre，2）Cyp17iCre，以及 3）NuTRAP floxed 等位基因，所用引物列于材料表中，方法如前所述^7,8。

1. 小鼠卵巢解剖

1. 根据机构的动物护理指南和批准程序实施小鼠安乐死，随后收集卵巢。
2. 解剖卵巢，去除可能附着在卵巢组织上的脂肪组织或输卵管部分，然后将卵巢放入含有缓冲液的离心管中。立即进行TRAP或INTACT实验操作。
   注意：本方案尚未针对冷冻组织进行优化。建议同一小鼠的两个卵巢分别用于两种不同技术，以便后续进行统计学分析。

2. 从特定卵巢细胞类型中分离细胞核

1. 缓冲液配制
   1. 核纯化缓冲液（NPB）：配制100 mL NPB，需混合2 mL 1 M HEPES（终浓度：20 mM HEPES）、0.8 mL 5 M NaCl（40 mM NaCl）、4.5 mL 2 M KCl（90 mM KCl）、0.4 mL 0.5 M EDTA（2 mM EDTA）、0.1 mL 0.5 M EGTA（0.5 mM EGTA）以及92.2 mL无核酸酶水。在核分离当天加入1×蛋白酶抑制剂。
      注意：NPB可提前配制（不含蛋白酶抑制剂），于4 °C保存，最长可稳定3周。
   2. 核裂解缓冲液（完全型）：在核分离当天向核裂解缓冲液中加入1×蛋白酶抑制剂。
2. 制备核悬液
   注意：除非另有说明，样品应始终置于冰上。
   1. 取一只Cyp17-NuTRAP小鼠（或其他相关Cre-NuTRAP小鼠）的卵巢，置于500 µL完全型核裂解缓冲液中。使用自开式显微剪刀在缓冲液中将卵巢剪成八份。
   2. 使用宽口移液吸头将剪碎的卵巢组织及500 µL裂解缓冲液转移至冰上的玻璃Dounce匀浆器中。用松散研杵A匀浆10–20次。向Dounce匀浆器中加入400 µL裂解缓冲液，冲洗研杵A。
   3. 用紧密研杵B匀浆10–20次。加入1,000 µL裂解缓冲液，冲洗研杵B。将匀浆液（共1.9 mL）转移至2 mL圆底离心管中。
   4. 在4 °C下以200 × g离心1.5分钟，以去除未解离的组织和血管¹⁴。上清液中含有细胞核；弃去未解离组织的沉淀。
   5. 用100 µL裂解缓冲液预润湿30 µm细胞筛网，将上清液过滤至15 mL锥形管中。随后将含核混合物转移至2 mL圆底离心管中。
   6. 在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。沉淀即为细胞核。
   7. 通过涡旋振荡（中高速，短时间）将核沉淀重悬于250 µL冰冻裂解缓冲液中。再加入1.5 mL裂解缓冲液，使总体积达到1.75 mL。轻轻混匀，将核悬液置于冰上静置5分钟。
   8. 在4 °C下以500 × g离心5分钟使核沉淀。小心弃去上清液，避免扰动核沉淀。将沉淀重悬于200 µL冰冻保存缓冲液中，并短暂涡旋振荡，确保核沉淀完全重悬。
   9. 保留重悬后沉淀的10%（20 µL）作为输入核样品，用于后续分析。
   10. 取重悬的核沉淀，用冰冻NPB定容至2.0 mL。随后采用INTACT亲和纯化法分离标记的细胞核。
3. 特定细胞类型中标记核的分离（INTACT）
   1. 将链霉亲和素磁珠在原瓶中以中速涡旋振荡30秒，确保充分重悬。每份样品取30 µL重悬磁珠加入2 mL圆底离心管中（最多10份样品的磁珠可在同一管中洗涤），加入1 mL NPB，通过移液充分重悬。
   2. 将离心管置于磁力架上1分钟，使磁珠分离。弃去上清液，将离心管从磁力架上取下。用1 mL NPB重悬洗涤后的磁珠。
   3. 重复洗涤步骤，共洗涤三次。最后一次洗涤后，将磁珠重悬于初始体积的NPB中（每份样品30 µL）。
   4. 将30 µL洗涤后的磁珠加入第2.2.10步所得的2 mL核悬液中。通过移液和轻柔倒置离心管，充分重悬磁珠-核混合物。
   5. 将离心管置于冷室或冰箱中的旋转混合仪上，低速旋转孵育30分钟。同时将输入样品（不含磁珠）在相同条件下孵育。
   6. 将含核悬液和磁珠的离心管置于磁力架上，使与链霉亲和素磁珠结合的生物素化核（阳性组分）与未结合的核（阴性组分）分离。在磁力架上静置3分钟，使磁珠充分分离。
   7. 弃去上清液，将阴性组分转移至新的2.0 mL离心管中，置于冰上保存。对于每管阳性组分，将离心管从磁力架上取下，用1 mL NPB重悬其中内容物。
   8. 将离心管置于磁力架上1分钟，弃去上清液。将离心管从磁力架上取下，用1 mL NPB重悬洗涤后的磁珠-核混合物。
   9. 重复第2.3.8步，共洗涤三次。完成三次洗涤后，将阳性组分的磁珠-核混合物重悬于30 µL NPB中。
   10. 对于每管阴性组分，将第2.3.7步所得的核悬液在4 °C下以500 × g离心7分钟。小心吸除并弃去上清液。将阴性组分的核沉淀重悬于30 µL NPB中。
   11. 将输入样品（第2.2.9步）、阴性组分（第2.3.10步）和阳性组分（第2.3.9步）的核样品置于−80 °C冰箱中保存，直至进行核DNA或RNA提取。
       注意：若后续实验需使用完整细胞核作为起始材料（如转座酶可及染色质检测、染色质免疫沉淀实验），则不应冷冻保存细胞核。

3. 从特定卵巢细胞类型中分离 mRNA

1. 缓冲液的制备
   1. TRAP缓冲液基础液：通过混合78.8 mL无RNase水、5 mL 1 M Tris-HCl（终浓度：50 mM Tris [pH 7.5]）、5 mL 2 M KCl（100 mM KCl）、1.2 mL 1 M MgCl₂ （12 mM MgCl₂）和10 mL 10% NP-40（1% NP-40），配制100 mL TRAP缓冲液基础液。4 °C保存，可保存最多1个月。
   2. 高盐缓冲液基础液：通过混合68.8 mL无RNase水、5 mL 1 M Tris-HCl（终浓度：50 mM Tris [pH 7.5]）、15 mL 2 M KCl（300 mM KCl）、1.2 mL 1 M MgCl₂ （12 mM MgCl₂）和10 mL 10% NP-40（1% NP-40），配制100 mL高盐缓冲液基础液。4 °C保存，可保存最多1个月。
   3. TRAP匀浆缓冲液（完全）：在组织采集当天，每份样品配制1.5 mL。通过将10 mL TRAP缓冲液基础液（来自步骤3.1.1）与10 µL 100 mg/mL环己酰亚胺（终浓度：100 µg/mL环己酰亚胺）、10 mg肝素钠（1 mg/mL肝素钠）、20 µL 0.5 M DTT（1 mM DTT）、50 µL 40 U/µL RNase抑制剂（200 U/mL RNase抑制剂）、200 µL 0.1 M亚精胺（2 mM亚精胺）以及一片无EDTA蛋白酶抑制剂片剂（1×）混合，配制10 mL TRAP匀浆缓冲液。
   4. 低盐洗涤缓冲液（完全）：在组织采集当天，每份样品配制1.5 mL。通过将10 mL TRAP缓冲液基础液（来自步骤3.1.1）与10 µL 100 mg/mL环己酰亚胺（100 µg/mL环己酰亚胺）和20 µL 0.5 M DTT（1 mM DTT）混合，配制10 mL低盐洗涤缓冲液。
   5. 高盐洗涤缓冲液（完全）：在TRAP分离的第二天，每份样品配制1.5 mL。通过将10 mL高盐缓冲液基础液（来自步骤3.1.2）与10 µL 100 mg/mL环己酰亚胺和20 µL 0.5 M DTT混合，配制10 mL高盐洗涤缓冲液。
2. 进行翻译核糖体亲和纯化（TRAP）
   1. 从Cyp17-NuTRAP小鼠（或其他相应的Cre-NuTRAP小鼠）中取出另一侧卵巢，放入含有100 µL冰上预冷的TRAP匀浆缓冲液（来自步骤3.1.3）的1.5 mL无RNase管中。在缓冲液内使用自开式显微剪刀将卵巢切成八部分。
   2. 使用宽口吸头将卵巢和100 µL匀浆缓冲液转移至玻璃Dounce匀浆器中。用松散的杵A匀浆10–20次。加入400 µL TRAP匀浆缓冲液，冲洗杵A。
   3. 将匀浆液转移至2 mL圆底管中。用额外1 mL TRAP匀浆缓冲液冲洗Dounce匀浆器，并将冲洗液转移至2 mL圆底管中。
   4. 在4 °C下以12,000 × g离心匀浆液10分钟。将澄清的上清液转移至新的2 mL圆底管中。弃去沉淀。
   5. 将100 µL澄清匀浆液转移至新的2 mL圆底管中，作为输入样品置于冰上保留。
   6. 将剩余的澄清匀浆液（来自步骤3.2.4）与抗GFP抗体（5 µg/mL）在4 °C下旋转孵育1小时（端对端旋转）。输入样品在相同条件下孵育。
   7. 在孵育的最后15分钟内，使用以下步骤（3.2.8–3.2.11）用低盐洗涤缓冲液洗涤蛋白G磁珠。
   8. 将蛋白G磁珠小瓶涡旋振荡30秒，使其完全重悬。每份样品取50 µL蛋白G磁珠（最多10份样品可在同一管中洗涤），转移至2 mL圆底管中。
   9. 向磁珠中加入500 µL低盐洗涤缓冲液，轻轻吹打混匀。将管子放入磁力架中1分钟，使磁珠吸附至管壁。吸弃上清液。
   10. 将管子从磁力架中取出，向管中加入1 mL低盐洗涤缓冲液，轻轻吹打混匀。将管子放入磁力架中1分钟，使磁珠吸附至管壁。吸弃上清液。
   11. 重复步骤3.2.10，共洗涤三次。最后一次洗涤后，将管子从磁力架中取出，用初始体积的低盐洗涤缓冲液（每份样品50 µL）重悬磁珠。
   12. 将重悬后的洗涤磁珠（50 µL）转移至抗原样品/抗体混合物中，在4 °C下过夜孵育，同时在端对端旋转混合器中旋转。输入样品同样在4 °C下端对端旋转过夜，以保持条件一致。
   13. 过夜孵育后，将管子从旋转器中取出，使用磁力架静置2.5–3分钟，分离结合目标核糖体/RNA的磁珠（阳性组分）与上清液（阴性组分）。吸弃阴性组分，将其转移至新的2 mL圆底管中，置于冰上备用，同时处理阳性组分。
   14. 向含有阳性组分的管中加入500 µL高盐洗涤缓冲液（来自步骤3.1.5），轻轻吹打混匀。将管子置于冰上的磁力架中1分钟，使磁珠分离。弃去上清液，将管子从磁铁上取下。
   15. 重复步骤3.2.14，共洗涤三次。最后一次洗涤后，用350 µL RNA裂解缓冲液（补充3.5 µL 2-巯基乙醇（BME））重悬磁珠。在室温下以900 rpm在数字摇床中混匀10分钟。
   16. 在室温下使用磁力架静置1分钟，将磁珠与含有目标核糖体/RNA的溶液分离。将洗脱的阳性组分（上清液）收集至新的1.5 mL离心管中，加入350 µL 100%乙醇。颠倒混匀。进行RNA提取。
   17. 可选：为从输入样品（步骤3.2.5）和阴性组分（步骤3.2.13）中提取RNA，将100 µL输入样品和阴性组分分别转移至新的1.5 mL离心管中。向每个样品中加入350 µL RNA裂解缓冲液（补充3.5 µL BME），颠倒混匀。向每管中加入250 µL 100%乙醇，颠倒混匀。进行RNA提取。
3. RNA提取
   1. 将700 µL阳性组分以及可选的输入组分和/或阴性组分转移至RNA离心柱中。按照制造商说明书操作，从离心柱中提取RNA。

结果

TRAP 和 INTACT 实验流程的示意图见图1。此处通过免疫荧光成像以及从 TRAP 分离的 RNA 进行 RNA-Seq，展示了 Cyp17-NuTRAP 小鼠模型对卵巢间质/膜细胞的特异性。首先，对卵巢中的 eGFP 信号进行免疫荧光成像，并确定 eGFP 信号定位于膜细胞和间质细胞。简言之，将 5 µm 厚的组织切片用二甲苯和梯度乙醇脱蜡。为了获得更强的 eGFP 信号，使用山羊抗 GFP 一抗和 Alexa 488 标记的驴抗山羊二抗对 eGFP 蛋白进行染色，细胞核则用 DAPI 染色¹⁵。在荧光显微镜下以 20 倍放大倍数采集图像（图2A）。接下来，对 4 月龄 Cyp17-NuTRAP 小鼠的卵巢进行 TRAP 操作，以特异性分离来自膜细胞/间质细胞的核糖体结合 RNA。将 TRAP 分离得到的 RNA（阳性组分）和全组织 RNA（输入组分）用于构建链特异性 RNA 测序文库，并在新一代测序仪上进行测序。RNA-Seq 数据的修剪、比对和标准化（DESe...

讨论

NuTRAP 小鼠模型⁶ 是一种强大的转基因标记方法，可用于成对分析特定细胞类型的转录组和表观基因组，该方法可适应用于任何具有可用 Cre 驱动器的细胞类型。本文中，我们展示了 Cyp17-NuTRAP 小鼠模型在靶向卵巢鞘细胞和间质细胞方面的特异性。Cyp17-NuTRAP 模型可用于进一步阐明与卵巢衰老、癌症及疾病相关的鞘细胞和间质细胞特异性表观遗传机制。

在选择Cre驱动小鼠品系时，建议采用多种正交方法验证Cre介导的NuTRAP表达的细胞特异性。Cyp17a1-Cre为组成型表达。NuTRAP模型也可与可诱导型Cre品系杂交，以避免发育过程中非靶细胞内基因的瞬时表达。由于大多数卵巢细胞对激素波动高度敏感，还应考虑动情周期的分期¹⁷。

与传统细胞分选技术相比，NuTRAP 方法具有多种优势。首先，细胞分选技术依赖于单细胞悬液的制备，这可能导致细胞应激反应的诱导 离体 激活伪影

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 M 亚精胺	Sigma-Aldrich	05292-1ML-F
1 M MgCl2	赛默飞世尔科技	AM9530G
10% NP-40	赛默飞世尔科技	85124
100 mg/mL 放线菌酮	Sigma-Aldrich	C4859-1ML
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148
30 µm细胞滤器	Miltenyi Biotec	130-098-458
All Prep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204
抗GFP抗体	Abcam	Ab290	用于TRAP和免疫组化（兔多克隆抗GFP）
Buffer RLT	Qiagen	79216	方案中的RNA裂解缓冲液
cOmplete，mini，无EDTA蛋白酶抑制剂片剂	罗氏	11836170001	TRAP 匀浆缓冲液
Cyp17iCre 小鼠模型	杰克逊实验室	28547	B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 磁力架	Invitrogen	12321D
基因分型引物	IDT	自定义	通用 Cre - 杰克逊实验室方案 22392，引物：oIMR1084、oIMR1085、oIMR7338、oIMR7339
			Cyp17iCre - 杰克逊实验室方案 30847，引物：21218、31704、31705、35663
			NuTRAP - 杰克逊实验室方案 21509，引物：21306、24493、32625、32626
Halt蛋白酶抑制剂混合物（100X）	赛默飞世尔科技	1861278	NPB缓冲液
M-280 链霉亲和素 Dynabeads	Invitrogen	11205D	2.8 µm 微珠直径
MixMate	Eppendorf	5353000529
细胞核分离试剂盒：Nuclei EZ Prep	Sigma-Aldrich	Nuc101	包含细胞核裂解缓冲液和细胞核储存缓冲液
1 M HEPES	Gibco	15630-080
5 M NaCl	赛默飞世尔科技	AM9760G
2M KCl	赛默飞世尔科技	AM9640G
0.5 M EDTA	赛默飞世尔科技	AM9260G
0.5 M EGTA	Fisher Scientific	50-255-956
NuTRAP 小鼠模型	杰克逊实验室	29899	B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT 无需称量格式	赛默飞世尔科技	A39255
Protein G Dynabeads	赛默飞世尔科技	10004D	用于TRAP
RNaseOUT	Invitrogen	10777019
钠肝素	Fisher Scientific	BP2425
超纯 1 M Tris-HCl，pH 7.5	Invitrogen	15567-027
VWR 试管旋转仪	Fisher Scientific	NC9854190