小鼠卵巢表观基因组与转录组的细胞特异性成对解析

摘要

在本实验方案中，利用 Cyp17a1-Cre 小鼠品系与 NuTRAP 小鼠模型杂交，优化了翻译核糖体亲和纯化（TRAP）方法和特定细胞类型标记核分离（INTACT）方法，以实现对细胞特异性卵巢转录组和表观基因组的联合分析。

摘要

评估细胞类型特异性的表观基因组和转录组变化对于理解卵巢衰老至关重要。为此，本研究优化了核糖体亲和纯化（TRAP）方法和特定细胞类型标记核分离（INTACT）方法，并利用一种新型的转基因NuTRAP小鼠模型，对卵巢中特定细胞的转录组和表观基因组进行配对分析。NuTRAP等位基因的表达受一个两侧带有loxP位点的STOP盒调控，可通过启动子特异性的Cre小鼠品系靶向特定的卵巢细胞类型。由于近期研究提示卵巢间质细胞在驱动早衰表型中发挥重要作用，本研究采用Cyp17a1-Cre驱动子将NuTRAP表达系统靶向至间质细胞。结果表明，NuTRAP构建体的诱导表达特异性地局限于卵巢间质成纤维细胞，并且从单个卵巢中即可获得足够量的DNA和RNA用于测序分析。本文所描述的NuTRAP模型及方法可与任何已有Cre品系的卵巢细胞类型联用，以开展相关研究。

引言

卵巢在体细胞衰老过程中起着关键作用¹，其中特定细胞群体具有各自独特的贡献。由于卵巢具有高度的细胞异质性，因此难以解释来自整体卵巢组织批量检测的分子结果。明确特定细胞群体在卵巢衰老中的作用，是识别导致老年女性生育力下降及健康状况恶化的分子驱动因素的关键。传统上，对特定卵巢细胞类型的多组学评估依赖于激光显微切割²、单细胞技术³或细胞分选⁴等方法。然而，显微切割成本较高且操作困难，而细胞分选可能改变细胞的表型特征⁵。

一种评估卵巢细胞类型特异性表观基因组和转录组谱的新方法利用了核标记与翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP）小鼠模型。NuTRAP模型能够在无需细胞分选的情况下，通过亲和纯化技术——翻译核糖体亲和纯化（TRAP）和特定细胞类型中标记细胞核的分离（INTACT）⁶，实现细胞类型特异性核酸的分离。NuTRAP等位基因的表达受一个两侧带有loxP位点的终止盒（floxed STOP cassette）调控，并可通过启动子特异性的Cre小鼠品系靶向特定的卵巢细胞类型。通过将NuTRAP小鼠与特定细胞类型的Cre小鼠杂交，可在Cre依赖的方式下移除STOP盒....

方案

所有动物实验程序均获得俄克拉荷马医学研究基金会（OMRF）机构动物护理和使用委员会的批准。亲代小鼠购自杰克逊实验室（缅因州巴尔港），并在OMRF的高效微粒空气（HEPA）屏障环境中，于14小时光照/10小时黑暗循环（光照开启时间为早上6:00）的无特定病原体（SPF）条件下饲养和繁殖。

注意：在本实验中，我们使用雄性 Cyp17iCre^+/−（品系编号 #028547，杰克逊实验室）与雌性 NuTRAP 小鼠（品系编号 #029899，杰克逊实验室）进行配对。目标子代 Cyp17-NuTRAP 小鼠（Cyp17iCre^+/−; NuTRAP^flox/WT）将在卵巢间质细胞中，在Cyp17a1 启动子的调控下表达 NuTRAP 等位基因。本研究使用 4 月龄的雌性 Cyp17-NuTRAP 小鼠（n = 4）。从小鼠耳组织样本中提取 DNA 进行基因型鉴定，以确认 Cyp17iCre 和 NuTRAP 转基因的遗传，并通过 PCR 检测：1）通用 Cre，2）Cyp17iCre，以及 3）NuTRAP floxed 等位基因，所用引物列于材料表中，方法如前所述^7,8。

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结果

TRAP 和 INTACT 方案的示意图见图1。此处通过 TRAP 分离 RNA 的免疫荧光成像和 RNA-Seq 结果，展示了 Cyp17-NuTRAP 小鼠模型对卵巢间质/膜细胞的特异性。首先，对卵巢中的 eGFP 信号进行免疫荧光成像，并确定 eGFP 信号定位于膜细胞和间质细胞。简言之，将 5 µm 厚的组织切片用二甲苯和乙醇梯度脱蜡。为了获得更强的 eGFP 信号，使用山羊抗 GFP 一抗和 Alexa 488 标记的驴抗山羊二抗对 eGFP 蛋白进行染色，细胞核则用 DAPI 染色¹⁵。在荧光显微镜下以 20 倍放大倍数采集图像（图2A）。接下来，对 4 月龄 Cyp17-NuTRAP 小鼠的卵巢进行 TRAP 操作，以特异性分离来自膜细胞/间质细胞的核糖体结合 RNA。将 TRAP 分离得到的 RNA（阳性组分）和全组织 RNA（输入样本）用于构建链特异性 RNA 测序文库，并在新一代测序仪上进行测序。RNA-Seq 数据的修剪、比对和标准化（DESeq2）.......

讨论

NuTRAP 小鼠模型⁶ 是一种强大的转基因标记方法，可用于成对分析特定细胞类型的转录组和表观基因组，该方法可适应用于任何具有可用 Cre 驱动器的细胞类型。本文中，我们展示了 Cyp17-NuTRAP 小鼠模型在靶向卵巢鞘细胞和间质细胞方面的特异性。Cyp17-NuTRAP 模型可用于进一步阐明与卵巢衰老、癌症及疾病相关的鞘细胞和间质细胞特异性表观遗传机制。

在选择Cre驱动小鼠品系时，建议采用多种正交方法验证Cre介导的NuTRAP表达的细胞特异性。Cyp17a1-Cre为组成型表达。NuTRAP模型也可与可诱导型Cre品系杂交，以避免发育过程中非靶细胞内基因的瞬时表达。由于大多数卵巢细胞对激素波动高度敏感，还应考虑动情周期的分期¹⁷。

与传统细胞分选技术相比，NuTRAP 方法具有多种优势。首先，细胞分选技术依赖于单细胞悬液的制备，这可能导致细胞应激反应的诱导 离体 激活伪影

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 M 亚精胺	Sigma-Aldrich	05292-1ML-F
1 M MgCl2	赛默飞世尔科技	AM9530G
10% NP-40	赛默飞世尔科技	85124
100 mg/mL 放线菌酮	Sigma-Aldrich	C4859-1ML
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148
30 µm细胞滤器	Miltenyi Biotec	130-098-458
All Prep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204
抗GFP抗体	Abcam	Ab290	用于TRAP和免疫组化（兔多克隆抗GFP）
Buffer RLT	Qiagen	79216	方案中的RNA裂解缓冲液
cOmplete，mini，无EDTA蛋白酶抑制剂片剂	罗氏	11836170001	TRAP 匀浆缓冲液
Cyp17iCre 小鼠模型	杰克逊实验室	28547	B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 磁力架	Invitrogen	12321D
基因分型引物	IDT	自定义	通用 Cre - 杰克逊实验室方案 22392，引物：oIMR1084、oIMR1085、oIMR7338、oIMR7339
			Cyp17iCre - 杰克逊实验室方案 30847，引物：21218、31704、31705、35663
			NuTRAP - 杰克逊实验室方案 21509，引物：21306、24493、32625、32626
Halt蛋白酶抑制剂混合物（100X）	赛默飞世尔科技	1861278	NPB缓冲液
M-280 链霉亲和素 Dynabeads	Invitrogen	11205D	2.8 µm 微珠直径
MixMate	Eppendorf	5353000529
细胞核分离试剂盒：Nuclei EZ Prep	Sigma-Aldrich	Nuc101	包含细胞核裂解缓冲液和细胞核储存缓冲液
1 M HEPES	Gibco	15630-080
5 M NaCl	赛默飞世尔科技	AM9760G
2M KCl	赛默飞世尔科技	AM9640G
0.5 M EDTA	赛默飞世尔科技	AM9260G
0.5 M EGTA	Fisher Scientific	50-255-956
NuTRAP 小鼠模型	杰克逊实验室	29899	B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT 无需称量格式	赛默飞世尔科技	A39255
Protein G Dynabeads	赛默飞世尔科技	10004D	用于TRAP
RNaseOUT	Invitrogen	10777019
钠肝素	Fisher Scientific	BP2425
超纯 1 M Tris-HCl，pH 7.5	Invitrogen	15567-027
VWR 试管旋转仪	Fisher Scientific	NC9854190