细胞培养技术与实践：研究用细胞培养实验室中避免真菌和细菌污染的方法

摘要

本方案介绍了在科研细胞培养实验室中为防止真菌和细菌污染所需的基本细胞培养技术和操作规范。在细菌类别中，将特别强调预防支原体污染。

摘要

细胞培养是一项精细的技术，用于在受控环境中培养人类、动物和昆虫细胞或其他组织。本实验方案的目的是强调在研究实验室中为防止真菌和细菌污染所采用的正确技术。特别强调避免支原体污染，由于其体积微小且对细胞培养中常用的大多数抗生素具有抗性，因此在细胞培养室中支原体污染是一个主要问题。这些技术同样可确保细胞持续生长并维持细胞健康。对于新手和有经验的细胞培养使用者而言，持续遵循这些最佳实践至关重要，以降低污染风险。实验室应每年回顾一次细胞培养的最佳操作规范，并在必要时进行讨论或补充培训。从一开始就采取积极措施预防污染，相比污染发生后再进行清理，能够节省时间和经费。通用的最佳实践可保持细胞培养的健康状态，从而减少频繁复苏新细胞、购买昂贵的细胞培养基的需要，并降低培养箱去污染频率和停机时间。 

引言

细胞培养在科研实验室中有多种用途。自20世纪初细胞培养技术诞生以来，细胞系已推动了科学的进步。细胞系具有多种优势；不同类型的细胞系可帮助研究人员研究细胞生物学、生产用于进一步研究的杆状病毒，或大量生产目标蛋白等¹。其他用途还包括研究组织生长、促进疫苗研发、毒理学研究、探究基因在健康生物体和疾病模型中的作用，以及杂交细胞系的制备^2,3。细胞系还可用于药物生产³。在操作细胞系时，必须采用正确的无菌技术；本文所述的操作方法和技术适用于开展细胞培养工作的科研实验室，其他类型的实验室环境不在本文讨论范围内。

污染通常是进行细胞培养操作时最关注的问题。在本文语境中，污染一般指真菌和细菌的污染。本文所述方法的总体目标是全面描述避免污染的最佳实践。所有实验室成员在科研实验室的细胞培养室工作时，都应遵守这些操作规范。实验室应确保所有工作人员积极参与并采用这些最佳实践，以防止污染的发生。掌握正确的操作知识与技术，有助于确保细胞培养物保持活性、健康且无污染。该技术方法的建立基于文献研究、七年细胞培养工作经验，以及一种可供新手和有经验的细胞培养操作人员每年参考的方法学需求。

所有细胞培养实验室都需要遵循一种清晰且标准化的技术流程。目前关于细胞培养污染的文献大多讨论支原体检测、无菌技术、污染来源、污染物清除以及使用抗生素和定期检测进行预防^4,5,6,7,8。尽管这些信息具有参考价值，但现有文献中尚无视频资料能够演示应遵循的正确细胞培养技术。相较于其他方法，本研究所展示的操作技术的优势在于强调在污染发生前主动预防，而非事后检测和纠正错误。此外，对无菌技术的系统演示、关于防止真菌和细菌生长的讨论，以及生物安全柜气流原理的相关知识，对于初学者和经验丰富的细胞培养工作人员均具有重要价值。

细菌和真菌是最常见的两类污染物。在细菌类别中，支原体因其体积微小且能在未被察觉的情况下大量增殖而成为主要问题。支原体是能够自我复制的生物体，无刚性细胞壁，依赖真核细胞生长。其代谢能力较弱，在常规的细胞培养肉眼观察和普通显微镜检查中难以被识别，但仍可大量繁殖；尽管透射电子显微镜能够检测到支原体^9,10。此外，支原体能够穿过微生物过滤器¹⁰。细胞培养基为支原体提供了营养物质，但遗憾的是，在培养基中添加抗生素并不能有效抑制支原体¹⁰。需要注意的是，通常情况下无需在培养基中添加抗生素；采用规范的操作技术即可有效防止污染。支原体感染不会导致细胞立即死亡，但会影响实验数据的可重复性和质量，因此引起研究人员的关注。 

所有实验室人员都应严格遵守良好的细胞培养操作规范。细胞培养物在新购买后、正在培养期间、冷冻保存前以及从液氮中复苏后，均应进行支原体检测^2,10。目前市场上有多种检测方法，包括聚合酶链式反应（PCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫染色法³。文献指出，“在细胞培养中发现的支原体污染物中，来源于人类的分离株占很大比例”⁵。尽管已描述的支原体物种超过200种，但其中约有六种导致了大多数感染。这六种物种为 M. arginini、M. fermentans、M. hominis、M. hyorhinis、M. orale 和 Acholeplasma laidlawii¹⁰。与其他类型的污染一样，空气和气溶胶可将这些微生物带入细胞培养体系中⁵。其他研究论文也印证了这一点，认为“人类操作者可能是实验室中最大的污染源”⁷。尽管污染通常由人为失误引起，但若遵循标准操作程序，则可消除此类风险。人员携带造成的污染不仅限于支原体；某一实验室内的细胞培养物通常被同一种支原体感染，表明由于细胞培养技术不当，污染会从一个培养瓶传播到另一个培养瓶¹⁰。

防止交叉污染也是必须遵循正确细胞培养技术的另一个原因。据记载，全球至少有15%–18%的细胞系可能存在交叉污染或错误鉴定^11,12。除了检测细胞系是否被支原体污染外，还应检测是否存在交叉污染¹⁰。对于人源细胞系，目前国际参考标准是采用一种经济的基于DNA的技术——短串联重复序列（short tandem repeat, STR）分型，因其可简便地确认细胞系的身份^2,10,13,14。STR技术可识别标签错误或交叉污染的细胞系，但无法检测组织来源是否正确^10,13,14。如果细胞系标签错误、鉴定错误或受到污染，研究数据的可靠性将受到影响¹³ 。与其他类型的污染类似，交叉污染可能由于操作不当产生气溶胶而传播、操作失误导致错误的细胞类型进入培养瓶，或在不同细胞系之间共用同一瓶培养基和试剂而发生¹⁰。严禁共用培养基瓶；在两种不同细胞系之间共用一瓶培养基可能导致细胞群体混合，使生长较快的细胞类型完全取代另一类细胞。这种替代过程不易察觉，最终导致标签错误和错误鉴定²。在操作或标记过程中若发生培养物混淆，也可能将一种细胞系误认为另一种¹⁰。应特别注意将试剂、培养基和培养瓶彼此分开存放。每位实验室成员应拥有各自的培养基瓶，禁止成员之间共用。细胞系本身应从合格的细胞库或供应商处购买，实验室之间不应共享细胞。研究表明，尽管STR和支原体检测已被常规使用，但已有大量发表的研究论文使用了错误鉴定或受污染的细胞系¹⁵。在已发表的研究中筛选出这些存在问题的论文，并事后向读者通报情况，过程十分繁琐。预防才是避免此类问题发生的最佳方式。

使用70%乙醇（EtOH）喷洒物品这一简单操作即可杀死微生物；70%乙醇通过使最常见污染物（包括细菌和真菌）中的蛋白质变性并溶解其脂质成分发挥作用¹⁶。研究表明，70%是乙醇最有效的浓度；70%乙醇不会使表面蛋白质迅速凝固，因而能够进入细胞内部，其所含水分也是蛋白质变性过程所必需的。由于细胞壁两侧水和乙醇存在浓度差，70%乙醇可进入细胞内，使酶蛋白和结构蛋白均发生变性。若在培养瓶中观察到霉菌生长，必须对整个培养箱进行去污染处理：首先用70%乙醇喷洒内表面并擦拭干燥，随后在60 °C下孵育16小时（过夜）¹⁷。此方法可杀死大多数霉菌及细菌。

与发生污染后再消除污染的替代技术相比，预防措施的主要优势在于：通过及早预防污染，实验室工作人员可以确保细胞培养物的健康，避免因清除培养箱污染或丢弃受污染的细胞培养物而产生高昂费用。例如，支原体污染一旦发生，其清除过程效率低下⁷。在初期投入时间确保实验室人员经过适当培训、细胞培养室为独立封闭空间，并采用标准化操作流程，将节省大量时间和成本。

方案

1. 准备工作

1. 常规操作
   1. 穿戴一件专用于细胞培养室的洁净实验服，不得在实验室其他区域穿着。
      注：实验服无需无菌。
   2. 佩戴未接触过任何其他表面的全新手套。确保手套贴合紧密。推荐使用无粉丁腈手套。
      注：手套无需无菌。
   3. 开始操作前，用70%乙醇喷洒手套、实验服袖口以及生物安全柜内部。再用无绒纸巾将工作台面和玻璃面板擦拭干燥。
      注：使用70%乙醇可最高效地杀灭细菌¹⁶. 纸巾无需无菌。
   4. 将水浴锅置于细胞培养室内，仅用于预热培养基或解冻细胞。每周排空并清洗水浴锅一次，并遵循制造商提供的清洁说明。
2. 在生物安全柜内操作
   1. 尽量减少带入柜内的物品数量。避免遮挡生物安全柜前部或后部的通风格栅，以免干扰内部气流。
      注：有关柜内气流方向的说明，请参见图1。
   2. 将所有放入柜内的物品用70%乙醇喷洒后擦干。从培养基瓶顶部开始向下喷洒。同样地，使用一张洁净纸巾从上往下逐步擦拭至瓶底，切勿再向上返回擦拭瓶盖区域。
   3. 若生物安全柜空间足够容纳移液管，则可将其直接放置于柜内；否则可将其存放于柜体外侧安装的容器中。使用前应检查移液管包装两侧是否有孔洞、撕裂或穿刺。切勿撕开包装，而应轻轻剥离包装末端，将移液管插入移液器辅助装置，并以连贯动作取出移液管。
   4. 不得在敞口瓶或烧瓶上方悬停、跨越敞口容器操作，或在已打开的容器上方开启其他物品。
      注：柜内气流为垂直向下吹拂工作台面，因此若袖子等部位存在污染，可能落入细胞培养物中。
   5. 禁止倾倒液体。应使用移液管添加液体。补充培养基后，需充分混匀内容物并对瓶子进行标记。同时，应标明所添加的补充成分。

2. 贴壁细胞系的操作

1. 如果需要使用塑料培养瓶，请先将整个袋子喷洒消毒，然后放入超净工作台内。
2. 使用经高压灭菌的玻璃移液管或一次性无菌塑料移液管吸取培养基或洗涤液。小心取下储存容器的金属盖。通过轻轻倾斜并晃动容器，分离出一根玻璃移液管。伸手进入容器时，避免触碰其他移液管。
   注意：仅从一端持握所选移液管。 
3. 吸取液体后应尽快重新盖好瓶盖。将瓶盖倒置放在工作台面上，确保瓶口边缘不接触台面。不要从顶部或底部抓取瓶盖，而应从侧面接触瓶盖。
4. 吸取液体时，应使用位于超净工作台外、放置于地面次级容器中的真空抽滤瓶。
   注意：切勿将任何液体废弃物倒入生物危害废物袋中，以免发生泄漏。在超净台内操作时会产生废弃物，频繁将手伸进或伸出超净台会干扰气流。可暂时将废弃物留在超净台内，放置于一侧，以免影响操作。
5. 一旦手套变干，应立即用70%乙醇充分喷洒。双手相互揉搓，使手套表面湿润但不滴液。
6. 若血清移液管不慎接触到超净台内的其他物品，请立即丢弃，不要犹豫。应更换新的无菌血清移液管，切勿使用可能已被污染的移液管。

4. 检查与储存细胞

1. 将细胞放入培养箱前，需在显微镜下观察细胞状态。若细胞已充分悬浮，则应观察到单个细胞。
2. 切勿在培养箱附近说话、打喷嚏、咳嗽或用力呼吸。开启和关闭培养箱门应迅速。长时间开启箱门可能导致空气中的污染物进入培养箱。
   注意：在细胞培养室操作时佩戴口罩有助于防止支原体污染，因为支原体可能存在于人口腔中。避免在细胞培养室内使用手机，因交谈并不被推荐。
3. 从超净台中取出培养瓶前，应确保所有瓶盖均已拧紧。
4. 细胞培养基在不使用时应避光保存于4 °C环境中，因其对光敏感。
5. 细胞培养操作完成后，再次使用70%乙醇喷洒超净台内部，并用纸巾将表面擦拭干燥。清空生物危害垃圾桶中的废弃物。更换不同细胞系时，需重复此清洁流程并更换手套。

5. 悬浮细胞系的操作

1. 对于在玻璃培养瓶中培养的悬浮细胞，确保手套已用70%乙醇充分喷洒，然后用湿润的手套接触铝箔，并仅在将培养瓶放入超净台前对其底部进行喷洒消毒。
2. 取样进行细胞计数时，仅从容器中取出一个1.5 mL离心管，不得触碰其他离心管。将管盖倒置放在工作台面上，切勿接触内缘。操作时仅从侧面拿取，并在使用完毕后立即盖回。
3. 小心移除覆盖培养瓶整个瓶口的双层铝箔。一旦铝箔被移除，仅能从底部持握玻璃培养瓶，切勿触碰瓶口部位。使用1 mL刻度移液管取样用于细胞计数。
4. 避免培养基沿培养瓶壁滴落；若发生滴漏，立即用70%乙醇喷湿纸巾并及时清理。
5. 在将瓶子或培养瓶移出生物安全柜之前，确保瓶盖和铝箔均已拧紧。

6. 细胞孵育

1. 使用独立的培养箱分别培养不同类型的细胞，以防止不同类型细胞之间的交叉污染。

7. 液体废物收集

1. 在生物安全柜外地面的次级容器中收集液体废弃物，次级容器上应标记为“废弃物”。
   注意：软管连接至高效微粒空气（HEPA）过滤器，该过滤器每月更换一次。

8. 清理

1. 尽快移除生物危害废物袋并清洗玻璃烧瓶。在水槽旁保留一份玻璃器皿清洗规程。清洗规程详见补充文件1。
2. 将细胞培养用玻璃器皿进行高压灭菌处理，而非送至玻璃器皿清洗中心。应将其与实验室主要区域的玻璃器皿分开存放。
   注意：若未彻底刷洗玻璃器皿，SF-9细胞会在烧瓶壁留下一圈死亡细胞残留物。高压灭菌规程详见补充文件1。

9. 组织结构

1. 合理规划细胞培养室，将所有耗材集中放置在同一个区域，从而最大限度减少实验室成员因寻找耗材而离开房间的需要。
2. 对用于收获细胞并在后续细胞培养中重复使用的塑料瓶进行标记，注明“仅限细胞培养使用”。指定用于特定细胞类型的细胞培养瓶应专瓶专用。将这些瓶子存放在细胞培养室内，以便取用。

10. 鉴定细菌、真菌和支原体污染

注意：不遵循上述操作流程可能导致细菌、真菌和支原体污染。

1. 每次开始工作前，均应观察培养瓶中是否存在明显的浑浊、呈绒球状的额外生长物，以及细胞在瓶壁上形成致密聚集，这些均为污染的迹象。
   注意：有经验的操作者能够区分由微生物污染引起的浑浊与由实际细胞生长导致的浑浊。细胞会使原本澄清的培养基变得浑浊，而细菌污染则会导致严重浑浊，并呈现白色。
   1. 通过观察培养基中是否出现圆形、绒毛状的漂浮球状物，可直观识别霉菌污染（见图2）。
   2. 若培养基呈现浑浊、白色或扰动状，可直观识别为细菌污染（见图2）。
   3. 通过每月进行一次支原体检测来识别支原体污染。一种基于PCR的检测方法要求使用者取1.5 mL细胞样品，用10 μL进行细胞计数，稀释至0.08 × 10⁶ cells/mL，离心收集细胞，使用试剂盒中的裂解缓冲液裂解细胞，再进行最后一次离心。将上清液与可扩增多种支原体物种的引物共同孵育，随后进行DNA凝胶电泳以观察条带。无条带表明未检出支原体。
      注意：这种主要污染物可能存在于人口腔中。建议在细胞复苏后、用于实验前进行支原体检测。此后，应每月监测一次细胞是否存在支原体污染。目前多家公司提供支原体检测试剂盒，应选择适合的一种。

结果

如果不遵循本文所述的正确细胞培养技术和操作规范，研究用细胞培养实验室中可能会发生真菌和细菌污染。图2展示了悬浮培养和贴壁培养中均存在污染的培养瓶。

若未遵循无菌操作技术，可能在2–3天后出现霉菌污染。悬浮细胞中可见培养基中漂浮的圆形绒毛状团块，而贴壁细胞中的霉菌生长则表现为大块、不规则、白色或绿色的斑块。

对于细菌污染，通常在第二天即可观察到。培养基变得浑浊、呈白色且不透明。这种白色是细菌细胞的典型特征，因为细菌的增殖速度远快于细胞系。有经验的操作者能够区分未污染与已污染的培养基。对于贴壁细胞，可通过比较一瓶未开封的培养基与培养瓶中的培养基，来检查培养瓶中是否出现浑浊现象。

在生物安全柜内，应尽量减少放置的物品数量。避免将物品放置在前后通风栅格上（见 图3）。本安全柜内仅放置了一套移液器、枪头、经高压灭菌的玻璃移液管、移...

讨论

尽管污染是进行细胞培养操作时的主要关注问题之一，但本文所述的实践方法与技术有助于降低相关风险。关键步骤包括：穿戴仅在细胞培养室使用的洁净实验服；佩戴洁净且无粉的手套，并经常用70%乙醇喷洒，在更换细胞系时及时更换手套；鼓励每位实验人员不共用培养基瓶；在开始和结束操作前后彻底清洁生物安全柜；有序地拆开血清移液管包装；避免长时间近距离接触敞口的瓶子或培养瓶；不将培养基瓶在不同细胞系之间共用；快速开关培养箱门。此外，自行清洗并高压灭菌玻璃器皿可确保质量控制，从而降低引入外来污染物的可能性。质量控制方法包括使用高压灭菌指示胶带以确认灭菌器是否达到121 °C的适当温度、定期对设备进行预防性维护，以及目视检查培养瓶是否已彻底刷洗干净¹⁸。另一个重要要点是为不同类型的细胞使用独立的培养箱，以确保一种细胞的污染不会传播至其他细胞，并防止细胞间的交叉污染。

细菌和真菌感染是细胞培养中最常见的两种污染源。M. orale 是人类口腔中最常见的支原体物种，也是细胞培养中“所有支原体感染中最常见的单一分离株，占全部支原体感染的20%–40...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 培养基	ATCC	30-2006
带导流片的玻璃烧瓶	Pyrex	09-552-40
玻璃移液管	Fisher	13-678-6B
移液器辅助器	Drummond	13-681-15A
血清学移液管	Corning	07-200-573
T75 培养瓶	Corning	07-202-004
胰蛋白酶	Gibco	25-300-054
*由于本视频介绍的是通用的细胞培养技术，所列物品可能有所不同