本方案介绍了在科研细胞培养实验室中为防止真菌和细菌污染所需的基本细胞培养技术和操作规范。在细菌类别中，将特别强调预防支原体污染。
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本文内容
摘要
摘要
细胞培养是一项精细的技术，用于在受控环境中培养人类、动物和昆虫细胞或其他组织。本实验方案的目的是强调在研究实验室中为防止真菌和细菌污染所采用的正确技术。特别强调避免支原体污染，由于其体积微小且对细胞培养中常用的大多数抗生素具有抗性，因此在细胞培养室中支原体污染是一个主要问题。这些技术同样可确保细胞持续生长并维持细胞健康。对于新手和有经验的细胞培养使用者而言，持续遵循这些最佳实践至关重要，以降低污染风险。实验室应每年回顾一次细胞培养的最佳操作规范，并在必要时进行讨论或补充培训。从一开始就采取积极措施预防污染，相比污染发生后再进行清理，能够节省时间和经费。通用的最佳实践可保持细胞培养的健康状态，从而减少频繁复苏新细胞、购买昂贵的细胞培养基的需要，并降低培养箱去污染频率和停机时间。
引言
细胞培养在科研实验室中有多种用途。自20世纪初细胞培养技术诞生以来，细胞系已推动了科学的进步。细胞系具有多种优势；不同类型的细胞系可帮助研究人员研究细胞生物学、生产用于进一步研究的杆状病毒，或大量生产目标蛋白等1。其他用途还包括研究组织生长、促进疫苗研发、毒理学研究、探究基因在健康生物体和疾病模型中的作用，以及杂交细胞系的制备2,3。细胞系还可用于药物生产3。在操作细胞系时，必须采用正确的无菌技术；本文所述的操作方法和技术适用于开展细胞培养工作的科研实验室，其他类型的实验室环境不在本文讨论范围内。
污染通常是进行细胞培养操作时最关注的问题。在本文语境中，污染一般指真菌和细菌的污染。本文所述方法的总体目标是全面描述避免污染的最佳实践。所有实验室成员在科研实验室的细胞培养室工作时，都应遵守这些操作规范。实验室应确保所有工作人员积极参与并采用这些最佳实践，以防止污染的发生。掌握正确的操作知识与技术，有助于确保细胞培养物保持活性、健康且无污染。该技术方法的建立基于文献研究、七年细胞培养工作经验，以及一种可供新手和有经验的细胞培养操作人员每年参考的方法学需求。
所有细胞培养实验室都需要遵循一种清晰且标准化的技术流程。目前....
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方案
1. 准备工作
- 常规操作
- 穿戴一件专用于细胞培养室的洁净实验服，不得在实验室其他区域穿着。
注：实验服无需无菌。 - 佩戴未接触过任何其他表面的全新手套。确保手套贴合紧密。推荐使用无粉丁腈手套。
注：手套无需无菌。 - 开始操作前，用70%乙醇喷洒手套、实验服袖口以及生物安全柜内部。再用无绒纸巾将工作台面和玻璃面板擦拭干燥。
注：使用70%乙醇可最高效地杀灭细菌16. 纸巾无需无菌。 - 将水浴锅置于细胞培养室内，仅用于预热培养基或解冻细胞。每周排空并清洗水浴锅一次，并遵循制造商提供的清洁说明。
- 穿戴一件专用于细胞培养室的洁净实验服，不得在实验室其他区域穿着。
- 在生物安全柜内操作
- 尽量减少带入柜内的物品数量。避免遮挡生物安全柜前部或后部的通风格栅，以免干扰内部气流。
注：有关柜内气流方向的说明，请参见图1。 - 将所有放入柜内的物品用70%乙醇喷洒后擦干。从培养基瓶顶部开始向下喷洒。同样地，使用一张洁净纸巾从上往下逐步擦拭至瓶底，切勿再向上返回擦拭瓶盖区域。
- 若生物安全柜空间足够容纳移液管，则可将其直接放置于柜内；否则可将其存放于柜体外侧安装的容器中。使用前应检查移液管包装....
- 尽量减少带入柜内的物品数量。避免遮挡生物安全柜前部或后部的通风格栅，以免干扰内部气流。
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结果
如果不遵循本文所述的正确细胞培养技术和操作规范，研究用细胞培养实验室中可能会发生真菌和细菌污染。图2展示了悬浮培养和贴壁培养中均存在污染的培养瓶。
若未遵循无菌操作技术，可能在2–3天后出现霉菌污染。悬浮细胞中可见培养基中漂浮的圆形绒毛状团块，而贴壁细胞中的霉菌生长则表现为大块、不规则、白色或绿色的斑块。
对于细菌污染，通常在第二天即可观察到。培养基变得浑浊、呈白色且不透明。这种白色是细菌细胞的典型特征，因为细菌的增殖速度远快于细胞系。有经验的操作者能够区分未污染与已污染的培养基。对于贴壁细胞，可通过比较一瓶未开封的培养基与培养瓶中的培养基，来检查培养瓶中是否出现浑浊现象。
在生物安全柜内，应尽量减少放置的物品数量。避免将物品放置在前后通风栅格上（见 图3）。本安全柜内仅放置了一套移液器、枪头、经高压灭菌的玻璃移液管、移.......
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讨论
尽管污染是进行细胞培养操作时的主要关注问题之一，但本文所述的实践方法与技术有助于降低相关风险。关键步骤包括：穿戴仅在细胞培养室使用的洁净实验服；佩戴洁净且无粉的手套，并经常用70%乙醇喷洒，在更换细胞系时及时更换手套；鼓励每位实验人员不共用培养基瓶；在开始和结束操作前后彻底清洁生物安全柜；有序地拆开血清移液管包装；避免长时间近距离接触敞口的瓶子或培养瓶；不将培养基瓶在不同细胞系之间共用；快速开关培养箱门。此外，自行清洗并高压灭菌玻璃器皿可确保质量控制，从而降低引入外来污染物的可能性。质量控制方法包括使用高压灭菌指示胶带以确认灭菌器是否达到121 °C的适当温度、定期对设备进行预防性维护，以及目视检查培养瓶是否已彻底刷洗干净18。另一个重要要点是为不同类型的细胞使用独立的培养箱，以确保一种细胞的污染不会传播至其他细胞，并防止细胞间的交叉污染。
细菌和真菌感染是细胞培养中最常见的两种污染源。M. orale 是人类口腔中最常见的支原体物种，也是细胞培养中“所有支原体感染中最常见的单一分离株，占全部支原体感染的20%–40.......
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披露
作者不存在任何利益冲突。
致谢
本工作的完成得益于霍华德·休斯医学研究所（HHMI）的资金支持。我们感谢实验室负责人 Jue Chen 对本文手稿的审阅以及持续的支持，感谢 Donna Tallent 提供的有益修改和意见，同时感谢洛克菲勒大学信息技术部门的 Jeff Hennefeld 在本手稿视频部分提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DPBS | Gibco | 14-190-144 | |
| DMEM F-12 培养基 | ATCC | 30-2006 | |
| 带导流片的玻璃烧瓶 | Pyrex | 09-552-40 | |
| 玻璃移液管 | Fisher | 13-678-6B | |
| 移液器辅助器 | Drummond | 13-681-15A | |
| 血清学移液管 | Corning | 07-200-573 | |
| T75 培养瓶 | Corning | 07-202-004 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25-300-054 | |
| *由于本视频介绍的是通用的细胞培养技术，所列物品可能有所不同 |
参考文献
- Johnson, Z. L., Chen, J. Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1. Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: practical steps for more reliable resea....
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