利用改良酶联免疫吸附测定法检测和定量人血浆中降钙素基因相关肽（CGRP） 关键词：降钙素基因相关肽，CGRP，酶联免疫吸附测定，ELISA，人血浆，肽检测，定量分析

摘要

关于人血浆中降钙素基因相关肽（CGRP）浓度的已发表数据存在不一致。这种不一致可能是由于缺乏标准化且经过验证的定量该神经肽的方法学所致。本文中，我们描述了一种经过验证的酶联免疫吸附测定（ELISA）方案，用于纯化和定量人血浆中的CGRP。

摘要

降钙素基因相关肽（CGRP）是一种具有血管活性的神经肽，在偏头痛的病理生理过程中可能发挥重要作用，并有望成为潜在的生物标志物。当神经纤维被激活时，CGRP从神经末梢释放，引发三叉神经传出支配血管区域的无菌性神经源性炎症和动脉血管扩张。由于CGRP存在于外周血管系统中，研究者已着手采用蛋白组学检测方法（如酶联免疫吸附测定，ELISA）在人血浆中检测并定量该神经肽。然而，由于CGRP半衰期较短（约6.9分钟），且不同实验室检测方案的技术细节存在差异，而这些细节往往未被充分描述，导致文献中CGRP的ELISA检测结果不一致。本文介绍一种改良的ELISA方法，用于人血浆中CGRP的纯化与定量。该方法包括样本采集与制备、利用极性吸附剂进行提取以实现纯化、抑制非特异性结合的附加步骤，以及最终的定量分析 通过 ELISA。此外，该方案已通过加标回收率和稀释线性实验得到验证。此经过验证的方案理论上可用于定量偏头痛患者以及其他可能涉及CGRP作用的疾病患者的血浆中CGRP浓度。

引言

降钙素基因相关肽（CGRP）是一种含有37个氨基酸的神经肽，存在于具有血管周围定位的神经纤维以及非神经组织中。CGRP有两种形式，即α-CGRP和β-CGRP，二者具有超过90%的同源性，并共享生理功能；然而，α-CGRP主要分布于中枢和外周神经系统，而β-CGRP则存在于肠神经系统^1,2。当伤害性感受器被激活并发生钙依赖性胞吐时，CGRP从神经元释放，引发无菌性神经源性炎症，表现为动脉血管扩张和血浆蛋白外渗^3,4,5,6,7。随后，CGRP出现在毛细血管后微静脉中，可能作为导致传入性伤害性激活的疾病的生物标志物，例如偏头痛^8,9,10,11。值得注意的是，CGRP还通过参与血管生成和免疫调节在COVID-19中发挥作用，并可能预测不良疾病进展^12,13。因此，建立一种准确测定人血浆中CGRP含量的实验方案具有广泛的应用价值。

目前，CGRP 在偏头痛中的作用可能受到了最多的关注。根据临床前和临床研究，CGRP 被提出作为偏头痛的潜在生物标志物以及治疗靶点^{3,4,5,6,7,8,9,10}。一些研究发现，与对照组参与者相比，发作性偏头痛患者群体中 CGRP 水平升高^10,14,15。CGRP 抑制剂在偏头痛治疗的临床试验中取得的成功，似乎表明 CGRP 水平升高是引发偏头痛的因果因素。然而，并非所有研究者都证实了这些结果^16,17,18,19。此外，CGRP 在偏头痛非头痛症状中的作用仍有待阐明；本研究的开展正是出于理解 CGRP 在偏头痛前庭症状中所起作用的目的。

文献中降钙素基因相关肽（CGRP）免疫测定数据的不一致可能由多种原因造成。首先，CGRP在外周血管中的半衰期为6.9分钟²⁰，这是由于丝氨酸蛋白酶²¹、胰岛素降解酶及其他金属蛋白酶²²、中性内肽酶²³以及内皮素转化酶-1²⁴的活性所致。其次，用于定量CGRP的免疫测定方法在技术细节上存在差异，而这些研究中往往未对这些细节进行充分描述。最后，免疫测定方法缺乏标准化，进一步加剧了数据解读的复杂性。

本文介绍了一种改良的酶联免疫吸附测定（ELISA）方案，可用于纯化并准确定量人血浆中的α-和βCGRP。该试剂盒的抗体不与胰淀素（amylin）、降钙素（calcitonin）或P物质（substance P）发生交叉反应。本方案已进行必要的验证实验，包括加标回收率和稀释线性实验，相关数据在本文中予以展示。此前文献中尚未完整描述过经过此类验证的CGRP ELISA检测方法。该方案可用于偏头痛以及多种疾病背景下人血浆中CGRP的定量分析，这些疾病包括心血管疾病^2,25、皮肤病学疾病²⁶、妇产科疾病²⁷、风湿性疾病^28,29、肌肉骨骼系统疾病^30,31、内分泌疾病^32,33以及病毒性疾病^12,13，在这些疾病中CGRP已被证实具有相关作用。

方案

本方案使用经约翰斯·霍普金斯大学机构审查委员会批准（编号：NA_00092491）并获得知情同意的个体提供的血浆样本开发而成。

1. 样本采集与制备

1. 从肘前静脉采集 5 mL 全血 通过 标准静脉穿刺方法³⁴ 加入6 mL真空采血管（含乙二胺四乙酸，EDTA）中。
2. 加入0.5 mL抑肽酶（10,000 KIU/mL）——一种竞争性丝氨酸蛋白酶抑制剂——至采集后的试管中，以阻止目标肽的裂解。轻轻倒置试管10次，使抑肽酶与血液充分混匀。随后将试管置于冰上保存，直至进行下一步操作。
3. 将离心管在 604 x g 在采集血液后60分钟内，4 °C条件下离心4分钟。
4. 用移液器吸除血浆组分，并转移至2 mL圆底无菌冻存管中。
5. 立即将冻存管置于 -80 °C 保存，可保存长达 2 周。

2. 血浆样本的提取

1. 将提取柱放入15 mL锥形离心管中，使提取柱的外侧凸缘由离心管的外侧凸缘支撑。
2. 通过柱子依次加入5 mL 100%甲醇和10 mL超纯水以活化小柱。
   1. 当液体流经滤芯时 通过 重力驱动的液体流动，会收集到试管中。
   2. 随着液体积聚，及时弃去多余液体，以确保液体不会淹没滤芯。
   3. 确保实验过程中 cartridge 不干燥。
3. 将250 µL血浆用750 µL 4%乙酸稀释。
4. 将1 mL血浆与乙酸溶液缓慢通过层析柱。
   注意：此步骤应耗时约30秒 通过 每毫升流体通过时的重力驱动流。
5. 用10 mL的4%乙酸洗涤柱。与之前操作相同，当废液积累时及时弃去，以确保液体不会淹没柱子。
6. 在从卡盒中释放出最后一滴乙酸后，将卡盒从管中取出，并放入一个新的15 mL圆锥形离心管中。
7. 配制甲醇与4%乙酸的10:1溶液，将2.7 mL的4%乙酸与0.3 mL的100%甲醇混合。使用该溶液以每次1 mL的量通过萃取柱洗脱CGRP。每通过1 mL溶液后暂停25分钟。切勿丢弃洗脱液。
8. 25 分钟后，当甲醇和乙酸溶液的最后 1 毫升完全通过，收集管中将含有 3 mL 洗脱液。将每 1 mL 洗脱液分装至 1.7 mL 微型离心管中。
   注意：每个 cartridge 应得到三个微量离心管。
9. 将每个离心管放入微型离心机中离心1秒，以确保所有洗脱液均位于管底。
10. 在4 °C下通过真空离心干燥所有样品（设置为浓缩功能，适用于水溶液，转速1,400 rpm；由于离心管位置不同，相对离心力范围为130–250 × g） g).
    注意：真空离心机干燥样品所需的时间取决于所用微量离心管的类型。
11. 在进行检测步骤（4.1）之前，立即用酶免疫分析（EIA）缓冲液重新溶解先前干燥的样品（参见 材料表室温（RT）或 20 °C 解冻
    ​注意：用于重新溶解干燥样品的EIA缓冲液体积应等于原始样品体积，或250 µL。

3. ELISA 板的准备——封闭以减少非特异性结合

1. 向板的每个孔中加入 250 µL 的 Tris 缓冲盐水（TBS）/鱼胶原封闭缓冲液。
2. 用封板膜覆盖板子，在室温下孵育 2 小时。
3. 移去封板膜，通过倒置或使用多通道移液器抽吸弃去液体。然后将板子在纸巾上轻拍，去除残留的液体痕迹。
4. 将板子置于超净工作台中干燥 10 分钟。
5. 当板子明显干燥后，将其放入带有硅胶干燥剂小包的压封铝箔袋中，并于 -20 °C 保存 24 小时。
   ​注意：板子应在孵育后 4 周内使用。

4. 检测程序之前的准备

1. 根据试剂盒说明书配制试剂（EIA 缓冲液、CGRP 标准品、CGRP 质控品、CGRP 示踪剂、洗涤缓冲液）。仅在 16–20 小时孵育期结束后配制 Ellman 试剂。
2. 在进行后续操作前，将所有样品和试剂恢复至室温。

5. 检测步骤

1. 用试剂盒提供的洗涤缓冲液（300 µL/孔）将已封闭的板各孔洗涤五次。每次洗涤时，在向孔中加入洗涤缓冲液后静置30秒，然后弃去液体或使用多通道移液器抽吸去除。
2. 最后一次洗涤后，通过倒置平板（将平板倒置以排出孔内液体）或使用多通道移液器抽吸，彻底去除孔中的缓冲液。将残留的液滴在纸巾上吸干，并轻敲倒置的平板，直至孔内无可见液体残留。
3. 预留至少两个孔，不加任何试剂或缓冲液，作为空白（"Blank"）孔。另预留至少两个孔用于非特异性结合（NSB）检测。
4. 向每个NSB孔中加入100 µL EIA缓冲液。
5. 将CGRP标准品以复孔形式分别加入指定孔中，每孔100 µL。
6. 将样品（用EIA缓冲液重悬）和质控品以复孔形式分别加入指定孔中，每孔100 µL。
7. 向含有NSB、CGRP标准品、样品和质控品的各孔中加入100 µL CGRP示踪剂（与乙酰胆碱酯酶偶联的抗CGRP抗体）。空白（"Blank"）孔中不加示踪剂。
8. 用透明封板膜覆盖平板，确保各孔密封，防止样品和试剂蒸发。在4 °C条件下孵育16–20小时。
9. 孵育结束后，按照试剂盒说明书配制Ellman's试剂。
10. 将平板倒置以去除所有液体。用300 µL洗涤缓冲液按上述方法洗涤各孔三次。
11. 第三次洗涤后，去除孔内液体，将平板置于摇床上，以120 rpm振荡2分钟。
12. 再额外洗涤三次。最后一次洗涤后，通过倒置平板或使用多通道移液器抽吸，彻底去除孔内缓冲液。将残留液滴在纸巾上吸干，并轻敲倒置的平板，直至孔内无可见液体残留。
    注意：若使用ELISA洗板机，本步骤中所述额外三次洗涤可能无需进行。
13. 向各孔（空白（"Blank"）孔除外）加入200 µL Ellman's试剂。
14. 用新的封板膜覆盖平板，并用铝箔包裹，避免光照。在室温下避光孵育1小时。
15. 用干燥的纸巾擦拭平板底部，确保无液体残留，以免干扰分光光度计读数。
16. 在405 nm波长处读取吸光度（黄色显色）。

6. 数据分析

1. 计算每个"空白"、非特异性结合（NSB）、标准品、质控品及样品的平均吸光度。
2. 从标准品、质控品和样品的吸光度值中减去NSB的平均吸光度值。
3. 以吸光度为纵坐标（y轴），浓度为横坐标（x轴），使用四参数逻辑回归模型绘制标准曲线。
4. 标准曲线建立后，利用曲线方程计算质控品和样品的插值浓度，该浓度可在x轴上读取。
   注意：只有当质控品的实测插值浓度与预期浓度（通常为125 pg/mL，具体请参见质控品瓶签）相比偏差在25%以内时，标准曲线才被视为有效。

结果

该实验方案中有几个关键步骤需要特别强调。首先，抑肽酶（aprotinin）作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，必须在采集全血样本后立即加入，以防止降钙素基因相关肽（CGRP）发生进一步的酶解降解。已有研究表明，丝氨酸蛋白酶参与了CGRP的代谢过程，先前也有研究在定量人源CGRP时使用了抑肽酶^21,35。如果未使用蛋白酶抑制剂，且样本处理时间超过60分钟，则在进行ELISA检测时可观察到CGRP水平下降。其次，在ELISA检测前进行固相萃取，可将CGRP富集于洗脱液中，并去除血浆基质中可能产生干扰的分子。该萃取步骤在加标回收实验中可提高CGRP的回收率（将在下一节进一步讨论）。萃取后在低温房间内进行真空离心，可进一步减少CGRP的损失。第三，在进行ELISA检测前，必须使用封闭缓冲液对微孔板进行封闭。这一步骤可使缓冲液中的非特异性蛋白被动吸附至微孔板上剩余的结合位点，从而降低背景信号。封闭有助于避免出现不切实际的高CGRP回收率。

加标回收实验用于确定降钙素基因相关肽（CGR...

讨论

本文介绍了一种经过验证的方案，可用于检测和定量人血浆中的降钙素基因相关肽（CGRP）。该方案是在发现商用CGRP ELISA试剂盒无法准确测定该分子后建立的。在确定样本处理流程和有效的标准曲线后，加标回收率和稀释线性实验显示，回收率远低于预期。使用另一种商用CGRP ELISA试剂盒也获得了类似结果（表4）。作为参考，广泛接受的标准回收率为80–120%³⁶。这些结果可能提示存在蛋白酶活性导致CGRP降解^21,22,23,24，或有其他分子与CGRP结合，从而限制其与酶标板上抗体的结合能力，亦或存在非靶蛋白与酶标板抗体之间的竞争性结合。

为了控制这些可能的混杂因素，优化了一种提取方案，在进行ELISA之前，使用一种专有吸附剂对血浆进行纯化。该吸附剂...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.7 mL Safeseal 微量离心管	Sorenson Bioscience, Inc.	11510
99% 甲醇	ThermoFisher Scientific	L13255.0F
15 mL 圆锥形离心管	Falcon	14-959-49B
2 mL 圆底无菌冻存管	CRYO.S	122263
4% 乙酸	ThermoFisher Scientific	035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA 采血管	BD	367863
Allegra 64R 台式离心机	Beckman Coulter, Inc.	367586
抑肽酶	VWR	76344-814
人 CGRP ELISA 试剂盒	Bertin Bioreagent	A05481
CGRP 储存液	Bertin Bioreagent
EIA 缓冲液	Bertin Bioreagent	A07000
Ellman 试剂	Bertin Bioreagent	A09000_49+1
多通道移液器	ThermoFisher Scientific	4661180N
Oasis HLB 3 cc 真空固相萃取柱	Waters	WAT094226
轨道摇床	Bellco	7744-01010
精密微量移液器	ThermoFisher Scientific	F144055MG
SpectraMax M 系列多功能微孔板读板仪	Molecular Devices	Part Number M2
TBS/鱼明胶	Bioworld, 来自 Fischer Scientific	50-199-167
超纯水 ELISA 级	Bertin Bioreagent	A07001
Vacufuge plus - 真空离心浓缩仪	Eppendorf	22820109
洗涤缓冲液	Bertin Bioreagent	A17000