本文介绍一种用于实时检测水稻组织在病原体相关分子模式触发的免疫反应中胞外空间活性氧（ROS）产生的方法。该方法操作简便、标准化程度高，在受控条件下可获得高度可重复的实验结果。
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本文内容
摘要
摘要
活性氧（ROS）在多种生物过程中发挥着关键作用，包括对非生物和生物胁迫的感知。当植物受到病原体侵染或病原体相关化学物质（即病原体相关分子模式 [PAMPs]）刺激时，会迅速诱导一系列免疫反应，其中包括活性氧的爆发，这一过程被称为PAMP触发的免疫（PTI）。活性氧爆发是PTI反应的标志性特征，由定位于质膜上的一类NADPH氧化酶——RBOH家族蛋白——催化产生。绝大多数活性氧为过氧化氢（H2O2），可通过基于鲁米诺的化学发光法方便且稳定地检测。化学发光是一种产生光子的反应，其中鲁米诺或其衍生物（如L-012）在催化剂作用下与活性氧发生氧化还原反应。本文介绍了一种优化的基于L-012的化学发光方法，用于实时检测水稻组织在PAMP诱导后胞外空间（apoplast）中活性氧的生成。该方法操作简便、结果稳定、标准化程度高，在严格控制的条件下具有高度可重复性。
引言
活性氧（ROS）是一类化学性质活泼的氧衍生物，包括超氧阴离子自由基（O2-）及其衍生物、羟基自由基（OH-）、过氧化氢，以及单线态氧或氧化还原反应的产物，这些物质在质体和叶绿体、线粒体、过氧化物酶体及其他亚细胞区域中持续产生1。活性氧在多种生物过程中发挥重要作用，对所有植物的正常生理功能至关重要2,3,4。活性氧的功能谱广泛，从调控植物生长发育到感知非生物和生物胁迫均有参与5,6,7,8。
在植物免疫系统中，定位于植物细胞质膜的受体——即模式识别受体（PRRs）——可识别病原体来源的化学物质——病原体相关分子模式（PAMPs）。这种识别会触发一系列快速免疫反应，包括钙离子内流、活性氧爆发以及MAPK级联反应；因此，这一层次 免疫的一种形式被称为PAMP触发的免疫（PTI）。....
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方案
注意：该实验方案适用于不同的植物组织。本方案中使用水稻叶鞘和叶片圆片进行PAMP诱导后的ROS检测。由于差异主要源于取样方法的不同，下文仅描述通用步骤，必要时会注明具体操作。
1. 植物培养
- 用70%乙醇对去壳的水稻种子进行1分钟的灭菌处理，然后用40%次氯酸钠（NaClO）处理1小时。随后用无菌水冲洗种子5次，以去除残留的氯。
- 将种子无菌接种于1/2 MS培养基（2.37 g/L Murashige和Skoog（MS）培养基，30 g/L蔗糖，2.1 g/L植胶，pH 5.7，经高压灭菌）上。
- 在水稻叶鞘法中，将种子直接接种于含MS培养基的无菌玻璃容器中。
- 在叶盘法中，将种子接种于MS平板上培养5–7天，然后移栽至生长基质或土壤中（图1A）。
- 将幼苗置于光照培养室中，在12小时光照/12小时黑暗的光周期条件下培养。
2. 组织制备与预处理
- 水稻叶鞘
- 在活性氧检测前1天，用锋利的剃须刀片或外科刀片将10日龄水稻幼苗的叶鞘切成3 mm长的片段（图1B
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结果
此处以水稻材料为例，检测经flg22处理后产生的活性氧（ROS）。诱导后ROS的生成呈瞬时性。在水稻中，ROS产量的增加最早在1-2分钟时被检测到，10-12分钟达到峰值，约30-35分钟后恢复至基础水平（图3）。与未添加PAMP的对照实验（诱导溶液中不含PAMP，未引起明显的ROS诱导）相比，仅在含有flg22或其他PAMP（如几丁质）的诱导溶液中才会特异性地引发ROS爆发。同时，ROS的总产量可通过曲线计算得出（图4）。
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讨论
本研究旨在建立一种高效的方法，用于定量检测水稻组织在PAMP处理后早期活性氧（ROS）的产生。该方法为实时测定经处理水稻组织中质外体ROS的生成提供了标准化操作流程。该方法操作简便、成本低廉、组分明确，且不依赖商业试剂盒。利用该方法，研究人员可研究植物在遭受生物或非生物胁迫时质外体ROS的实时生成情况。
在本实验方案中，选择L-012作为化学发光试剂，因为它是一种无毒的化合物。鲁米诺（luminol）被广泛用于化学发光检测以测定活性氧（ROS）的产生。然而，鲁米诺在用于水稻及其他植物组织中活性氧检测时存在三个缺点：水溶性差、发光反应持续时间短以及反应所需的pH条件较为剧烈。鲁米诺仅在碱性条件下发光，最适pH为9.5，该条件对植物细胞过于严苛，会引发非特异性反应。此外，鲁米诺的发光效率远低于L-012；而L-012在中性或接近中性的生理条件下具有最高的发光灵敏度。因此，L-012正越来越多地被应用于活体组织或细胞系统中检测活性氧的产生。
PTI反应中的活性氧产生受到多种内外因素的影响，因此PTI反应中活性氧诱导的变异性较大。为了.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了以下资助：上海市自然科学基金（项目编号：21ZR1429300/BS1500016）， 上海交通大学（农业交叉项目，项目编号：AF1500088/002）、上海市农业种子协同创新中心（项目编号：ZXWH2150201/001） 对范江波的资助， 以及上海交通大学医工交叉合作项目（项目编号：21X010301734）对李灿的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔微孔板 | WHB | WHB-96-01 | |
| 无水乙醇 | Innochem | A43543 | |
| flg22 | 生工生物 | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | 软件 | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-氨基-5-氯-7-苯基-2,3-二氢吡啶并[3,4-d]吡嗪-1,4-二酮，CAS编号：143556-24-5 |
| 酶标仪 | BioTek | Synergy 2 | |
| MS培养基 | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | 阿拉丁 | S101636 | |
| 辣根过氧化物酶（HRP） | Sigma | P8375 | |
| 植物凝胶 | Sigma | P8169 | |
| 取样器 | Miltex | 15110-40 | |
| 蔗糖 | 生工生物 | A502792 | |
| Tris | 生工生物 | A610195 |
参考文献
- Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
- Mittler, R. ROS are good. Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19....
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