本文介绍一种用于实时检测水稻组织在病原体相关分子模式触发的免疫反应中胞外空间活性氧（ROS）产生的方法。该方法操作简便、标准化程度高，在受控条件下可获得高度可重复的实验结果。
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本文内容
摘要
摘要
活性氧（ROS）在多种生物过程中发挥着关键作用，包括对非生物和生物胁迫的感知。当植物受到病原体侵染或病原体相关化学物质（即病原体相关分子模式 [PAMPs]）刺激时，会迅速诱导一系列免疫反应，其中包括活性氧的爆发，这一过程被称为PAMP触发的免疫（PTI）。活性氧爆发是PTI反应的标志性特征，由定位于质膜上的一类NADPH氧化酶——RBOH家族蛋白——催化产生。绝大多数活性氧为过氧化氢（H2O2），可通过基于鲁米诺的化学发光法方便且稳定地检测。化学发光是一种产生光子的反应，其中鲁米诺或其衍生物（如L-012）在催化剂作用下与活性氧发生氧化还原反应。本文介绍了一种优化的基于L-012的化学发光方法，用于实时检测水稻组织在PAMP诱导后胞外空间（apoplast）中活性氧的生成。该方法操作简便、结果稳定、标准化程度高，在严格控制的条件下具有高度可重复性。
引言
活性氧（ROS）是一类化学性质活泼的氧衍生物，包括超氧阴离子自由基（O2-）及其衍生物、羟基自由基（OH-）、过氧化氢，以及单线态氧或氧化还原反应的产物，这些物质在质体和叶绿体、线粒体、过氧化物酶体及其他亚细胞区域中持续产生1。活性氧在多种生物过程中发挥重要作用，对所有植物的正常生理功能至关重要2,3,4。活性氧的功能谱广泛，从调控植物生长发育到感知非生物和生物胁迫均有参与5,6,7,8。
在植物免疫系统中，定位于植物细胞质膜的受体——即模式识别受体（PRRs）——可识别病原体来源的化学物质——病原体相关分子模式（PAMPs）。这种识别会触发一系列快速免疫反应，包括钙离子内流、活性氧爆发以及MAPK级联反应；因此，这一层次 免疫的一种形式被称为PAMP触发的免疫（PTI）。活性氧爆发是PTI的标志性反应，其检测被广泛应用于与PTI相关的研究中9,10由PAMPs触发的ROS产生归因于定位于质膜的NADPH氧化酶，即呼吸爆发氧化酶同源物（RBOH）家族蛋白，这类蛋白将细胞质中的NADPH或NADH的电子转移至胞外氧气，从而生成超氧阴离子（O₂⁻）2-），可自发转化为过氧化氢（H₂O₂）2O2) 由超氧化物歧化酶8PAMP诱导的ROS爆发非常迅速，通常在PAMP处理后仅几分钟内出现，并在约10–12分钟时达到峰值。绝大多数ROS分子为过氧化氢（H₂O₂）。2O2），可通过化学发光检测法轻松且稳定地检测。
在化学发光过程中，化学发光试剂在催化剂作用下与活性氧反应，生成激发态中间产物。随后，产物中的电子通过非辐射跃迁返回基态，并释放出光子。常见的化学发光试剂包括鲁米诺（luminol）和L-012，其中鲁米诺应用最为广泛11,12,13。然而，越来越多的研究人员选择使用L-012来检测活性氧（ROS）的产生，因为在中性或接近中性的pH条件下，L-012的发光效率远高于鲁米诺。
本文介绍了一种基于L-012的优化化学发光法，用于实时检测水稻（Oryza sativa）组织——叶片圆片和叶鞘——在PAMPs诱导后活性氧（ROS）的产生。该方法操作简便、稳定且标准化，能够高度灵活地适应不同的实验需求。在严格控制的条件下，采用该方法获得的数据具有高度可重复性。
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方案
注意：该实验方案适用于不同的植物组织。本方案中使用水稻叶鞘和叶片圆片进行PAMP诱导后的ROS检测。由于差异主要源于取样方法的不同，下文仅描述通用步骤，必要时会注明具体操作。
1. 植物培养
- 用70%乙醇对去壳的水稻种子进行1分钟的灭菌处理，然后用40%次氯酸钠（NaClO）处理1小时。随后用无菌水冲洗种子5次，以去除残留的氯。
- 将种子无菌接种于1/2 MS培养基（2.37 g/L Murashige和Skoog（MS）培养基，30 g/L蔗糖，2.1 g/L植胶，pH 5.7，经高压灭菌）上。
- 在水稻叶鞘法中，将种子直接接种于含MS培养基的无菌玻璃容器中。
- 在叶盘法中，将种子接种于MS平板上培养5–7天，然后移栽至生长基质或土壤中（图1A）。
- 将幼苗置于光照培养室中，在12小时光照/12小时黑暗的光周期条件下培养。
2. 组织制备与预处理
- 水稻叶鞘
- 在活性氧检测前1天，用锋利的剃须刀片或外科刀片将10日龄水稻幼苗的叶鞘切成3 mm长的片段（图1B）。
- 将五个叶鞘片段放入96孔微孔板的单个孔中，每孔加入100 µL ddH2O，在25 °C黑暗条件下孵育10–12小时，以使伤口损伤相关的离子渗漏和防御反应减弱（图2）。
注意：切割时应确保切口垂直，以保证各片段暴露于诱导溶液的表面积一致，这是获得高度可重复结果的重要步骤。操作时应轻柔移动片段，避免在片段上制造额外切口或损伤，以免引起数据变异。原则上，每次实验至少应设置五个重复，因为活性氧数值的变异较大；重复数量越多，数据越可靠。
- 叶圆片
- 使用带推杆的活检打孔器，从4–6周龄水稻植株上切取直径为4 mm的叶圆片。为减少数据变异，应始终从主茎第二片叶（从顶部数起）的中部三分之一区域切取叶圆片（图1C）。
- 将一个叶圆片放入含100 µL ddH2O的96孔微孔板单个孔中，进行10–12小时的预处理，以消除伤口相关反应，防止其干扰PAMPs诱导的活性氧产生（图2）。
注意：操作时应轻柔处理叶圆片，避免在实验过程中造成额外切割或损伤，以防引起数据变异。活性氧的诱导主要发生在切缘细胞，因为水稻组织（叶片或叶鞘）表面覆盖有疏水层，只有切缘细胞能与诱导溶液接触（参见讨论部分）。 - 在微孔板孔中进行水预处理时，应使所有叶圆片漂浮，且背面朝上，以避免因叶片正反面差异导致的实验变异。
图 1：用于鞘组织取样的水稻幼苗生长条件与生长阶段，以及实验中所用的水稻叶鞘和叶片部位示意图。（A）在无菌条件下于1/2 MS培养基中培养10天的水稻幼苗可用于活性氧（ROS）检测。无菌处理的水稻种子接种于1/2 MS培养基上，在透明玻璃试管（直径8.5 cm，高15 cm）中按12小时光照/12小时黑暗的光周期培养。（B）叶鞘取样部位的示意图。叶鞘取自培养10天的水稻幼苗，位于根部上方、第一片叶下方。（C）叶圆片取样位置的示意图。叶圆片可取自健康水稻植株主茎第二片叶（从顶部计数）的中间三分之一区域，适用于任意生长阶段的植株。缩写：ROS = reactive oxygen species（活性氧）；MS = Murashige and Skoog（Murashige与Skoog培养基）。请点击此处查看该图的高清版本。
图2：使用不同细胞系测量ROS产生的培养板设置示意图 Oryza sativa. 使用96孔板对水稻组织进行预处理与检测。第1行、第2行和第3行（每块板最多可设八行）可为任意感兴趣的材料，如不同品种、突变体或转基因株系。组织分别用含PAMP的诱导溶液（PAMP，白色）或不含PAMP的溶液（ddH₂O，蓝色）进行处理。2O，灰色）来检测ROS反应。需要注意的是，待测样本越多，读数之间的时间间隔就越长。缩写：ROS = 活性氧；PAMP = 病原体相关分子模式；ddH₂O = 双蒸水2O = 双蒸水。 请点击此处查看此图的放大版本。
3. 准备诱导溶液
- 用 ddH2O 将 L-012 粉末溶解配制成 20 mM（6.23 mg/mL）的水溶液，制备成储存液。然后用 50 mM Tris HCl 缓冲液（pH 7.5）将储存液稀释，得到终浓度为 500 µM L-012 的工作液。储存液应冷冻保存，使用前再稀释成工作液。
- 配制含有 PAMP、L-012 和辣根过氧化物酶（HRP；10 mg/mL 溶于 ddH2O）的诱导溶液。对于 10 mL 诱导溶液，混合 9.4 mL 的 50 mM Tris HCl（pH 7.5）溶液、400 µL L-012 溶液、100 µL HRP 和 100 µL flg22（PAMP；10 mM 溶于 ddH2O）。对于阴性对照，用 100 µL ddH2O 替代 PAMP。
注意：配制好的诱导溶液应置于室温下，以避免对水稻组织造成冷应激。根据需要也可使用其他 PAMP 进行处理，例如几丁质（终浓度为 20 ng/mL）。由于 L-012 对光敏感，所有含有 L-012 溶液的管子均需用铝箔包裹避光。
4. 启动软件并使用参考的酶标仪设置实验方案（参见材料表）
注意：设置微孔板读数仪软件的参数需要一定时间。建议在加入诱导溶液前，提前准备好仪器和程序（可一键启动）。
- 启动软件。点击 实验 单击按钮以创建新方案或使用现有方案。
- 点击 步骤 在弹出窗口中设置酶标板。选择需要监测的孔位。
- 点击 开始动力学 建立总量 运行时间 和 读取间隔. 设置 运行时间 35分钟或更长时间，具体取决于实验要求。为了尽可能频繁地获取读数，请选择 最短间隔根据信号强度，选择1 s或更长的积分时间。
注：读数间隔取决于样本数量和信号积分持续时间。 - 点击 验证 | 确定 以确认设置。
- 点击 检测新培养板 在弹出窗口中等待软件提示加载板对话框。将待测板放置在载体上。
- 在此暂停，等待诱导系统的建立（见下一节）。一旦诱导系统准备就绪，立即点击 运行 开始读数。
5. 建立诱导系统并实时测定活性氧的产生
- 小心移除含有预处理组织的孔中 ddH2O，避免对组织造成损伤或干燥。
- 使用多通道移液器向含有组织的孔中加入 200 µL 诱导溶液。
- 轻轻振荡混匀。点击 运行 开始检测。
注意：经 PAMP 处理后，植物组织会迅速响应并产生活性氧（ROS）。因此，当存在多种处理时，建议先处理不含 PAMP 的阴性对照，以缩短操作时间。应尽可能快速操作，以减少不同处理之间的诱导延迟。从加入诱导溶液到开始检测的时间越短，越有利于捕获重要的实验数据。
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结果
此处以水稻材料为例，检测经flg22处理后产生的活性氧（ROS）。诱导后ROS的生成呈瞬时性。在水稻中，ROS产量的增加最早在1-2分钟时被检测到，10-12分钟达到峰值，约30-35分钟后恢复至基础水平（图3）。与未添加PAMP的对照实验（诱导溶液中不含PAMP，未引起明显的ROS诱导）相比，仅在含有flg22或其他PAMP（如几丁质）的诱导溶液中才会特异性地引发ROS爆发。同时，ROS的总产量可通过曲线计算得出（图4）。
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讨论
本研究旨在建立一种高效的方法，用于定量检测水稻组织在PAMP处理后早期活性氧（ROS）的产生。该方法为实时测定经处理水稻组织中质外体ROS的生成提供了标准化操作流程。该方法操作简便、成本低廉、组分明确，且不依赖商业试剂盒。利用该方法，研究人员可研究植物在遭受生物或非生物胁迫时质外体ROS的实时生成情况。
在本实验方案中，选择L-012作为化学发光试剂，因为它是一种无毒的化合物。鲁米诺（luminol）被广泛用于化学发光检测以测定活性氧（ROS）的产生。然而，鲁米诺在用于水稻及其他植物组织中活性氧检测时存在三个缺点：水溶性差、发光反应持续时间短以及反应所需的pH条件较为剧烈。鲁米诺仅在碱性条件下发光，最适pH为9.5，该条件对植物细胞过于严苛，会引发非特异性反应。此外，鲁米诺的发光效率远低于L-012；而L-012在中性或接近中性的生理条件下具有最高的发光灵敏度。因此，L-012正越来越多地被应用于活体组织或细胞系统中检测活性氧的产生。
PTI反应中的活性氧产生受到多种内外因素的影响，因此PTI反应中活性氧诱导的变异性较大。为了...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了以下资助：上海市自然科学基金（项目编号：21ZR1429300/BS1500016）， 上海交通大学（农业交叉项目，项目编号：AF1500088/002）、上海市农业种子协同创新中心（项目编号：ZXWH2150201/001） 对范江波的资助， 以及上海交通大学医工交叉合作项目（项目编号：21X010301734）对李灿的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔微孔板 | WHB | WHB-96-01 | |
| 无水乙醇 | Innochem | A43543 | |
| flg22 | 生工生物 | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | 软件 | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-氨基-5-氯-7-苯基-2,3-二氢吡啶并[3,4-d]吡嗪-1,4-二酮，CAS编号：143556-24-5 |
| 酶标仪 | BioTek | Synergy 2 | |
| MS培养基 | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | 阿拉丁 | S101636 | |
| 辣根过氧化物酶（HRP） | Sigma | P8375 | |
| 植物凝胶 | Sigma | P8169 | |
| 取样器 | Miltex | 15110-40 | |
| 蔗糖 | 生工生物 | A502792 | |
| Tris | 生工生物 | A610195 |
参考文献
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重印与许可
