本文介绍了智能高通量抗菌药物敏感性检测/噬菌体筛选系统的原理、结构及操作方法。以中国山东地区家禽分离的沙门氏菌（Salmonella）为例，说明该系统的应用。计算了Lar指数，并全面讨论了其在评估抗菌药物耐药性中的意义。
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本文内容
摘要
摘要
为提高抗菌药物敏感性试验（AST）和针对耐药菌的噬菌体高通量筛选的效率，并降低检测成本，依据美国临床实验室标准化协会（CLSI）制定的AST标准及耐药（R）折点，研制了一套智能化高通量AST/噬菌体筛选系统，该系统包括96点矩阵接种仪、图像采集转换器及配套软件。 & 美国临床与实验室标准协会（CLSI）。1,500 株菌的最低抑菌浓度（MIC）分布（从 R/8 至 8R）的抗菌药物敏感性试验及统计结果 沙门氏菌 中国山东家禽分离的菌株对10种抗菌药物的药敏试验，通过智能高通量AST/噬菌体筛选系统进行。Lar指数（“低抑菌、低耐药、残留直至极低抑菌”的缩写）通过计算各MIC的加权平均值并除以R获得。与使用耐药率来表征高耐药菌株的抗菌耐药性（AMR）程度相比，该方法提高了准确性。对于这些菌株 沙门氏菌 通过该系统，从噬菌体文库中高效筛选出对高耐药性（AMR）菌株具有裂解活性的噬菌体，并对裂解谱进行了计算与分析。结果表明，该智能高通量抗菌药物敏感性试验（AST）/噬菌体筛选系统操作可行、准确、高效、成本低廉且易于维护。结合山东省兽用抗菌药物耐药性监测系统，该系统适用于与耐药性（AMR）相关的科学研究及临床检测。
引言
由于抗菌剂已被广泛用于预防细菌感染性疾病，抗菌素耐药性（AMR）已成为一项全球公共卫生问题1。应对AMR的当前主要任务是监测流行病学病原体的抗菌素耐药性，以及开展敏感抗菌剂与裂解性噬菌体的协同治疗2。
体外抗菌药物敏感性试验（AST）是监测治疗效果和检测抗菌药物耐药性（AMR）水平的主要手段，是抗菌药物药理学的重要组成部分，也是临床用药的关键依据。美国临床与实验室标准协会（CLSI）和欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）已制定并修订了AST的国际标准，持续改进和补充AST方法及折点，以确定特定“病原体-抗菌药物”组合的最低抑菌浓度（MIC），并将其判定为敏感（S）、耐药（R）或中介（I）3,4。
从20世纪80年代到90年代，自动微量肉汤稀释仪器迅速发展并应用于临床实践，例如Alfred 60AST、VITEK System、PHOENIXTM和Cobasbact5,6,7。然而，这些仪器价格昂贵，需....
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方案
的 沙门氏菌 本研究中使用的菌株采自中国山东省的家禽，在获得中国农业科学院山东省家畜科学院生物安全委员会批准后进行收集。
1. 智能高通量药敏试验系统的应用8
- 接种物制备
- 孵育质控菌株 大肠杆菌 和 93 沙门氏菌 在 Mueller-Hinton 琼脂（MHA）平板上于 35 °C 培养 16–18 小时用于药敏试验的待测菌株 37 °C3.
- 根据CLSI标准中规定的方法，将每种菌株的接种物制备至0.5麦氏浊度标准3然后稀释10倍。
- 放置 200 µL 将无菌生理盐水注入水平 1st 96 孔板的 A1 孔作为阴性对照，将两种质控菌悬液加入水平方向的 2nd 和 3rd 分别将 A2 孔设为阳性对照，A3 孔设为质控孔。添加 200 µL 将每种测试菌株的稀释接种液分别加入96孔种子板中对应的93个孔内。
- 抗菌琼脂平板的制备
- 根据Lar指数的计算范围（0.125R至8R）设定所测试的不同抗菌剂的浓度范围。浓度范围从质控范....
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结果
根据智能高通量药敏试验系统的操作规程，通过以下方式展示了其应用： 沙门氏菌 以中国山东的家禽为例。
生长 沙门氏菌 含氨苄青霉素的琼脂平板上的菌株（R抗性） 32 µg/mL2至 256 µg/mL 由图像采集转换器确定的结果如图所示 图3水平的 1st A1 孔为阴性对照，未见菌落生长；A2 和 A3 为质控菌株，具有 MIC 4 µg/mL （在琼脂平板上形成菌落） 2 µg/mL 氨苄青霉素，但不影响 4 µg/mL），在CLSI标准化的质量控制范围内（2-8 µg/mL）。该 MIC 的 沙门氏菌 A4中的菌株 64 µg/mL，而A5的 16 µg/mL93 株菌的 MIC 分布 沙门氏菌 软件自动计算了各菌株对氨苄青霉素的抗性。
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讨论
琼脂稀释法已得到充分建立并被广泛应用。高通量药敏试验（AST）系统的基本原理即基于琼脂稀释法。该实验方案中的一个关键步骤是同时准确地高通量转移96个接种物，并需连续多次完成此操作。为实现这一关键步骤，96点阵接种器的针头必须均匀且极为光滑。每根针头自然沉降的液体体积约为2 µL，这些液滴在琼脂培养基表面聚集成微小液滴后可迅速被琼脂吸收，不会流动或飞溅，从而避免交叉污染。第二个关键步骤是对大量AST数据进行统计学处理。由于采用高通量接种，需要确定的测试数据量巨大，工作负荷极高。由智能图像采集转换器及其配套软件生成的智能化分析与统计结果，为此问题提供了完美的解决方案。AST结果可自动直接上传至Varms数据库，显著提高了结果判读的效率与准确性，并减少了人为因素导致的误差13。
第三个关键步骤是提出AMR的Lar指数。目前，全球范围内关于AMR的综合性评价指标较少。根据文献报道，Laxminarayan和Klugman提出了一种耐药指数（drug resistance index, DRI），用于衡量抗生素有效性的变化
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披露
刘玉清等人已就96点矩阵接种仪、图像采集转换器及其应用在中国申请了专利（专利号 ZL 201610942866.3 和专利号 ZL 201910968255.X）。
致谢
本工作得到了国家重点研发计划项目（2019YFA0904003）；山东省现代农业产业技术体系（SDAIT-011-09）；国际合作平台优化项目（CXGC2023G15）；中国山东省农业科学院农业科技协同创新重大任务（CXGC2023G03）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96 孔 培养板 | 北京兰杰科技术有限公司 | 11510 | |
| 96 点阵药敏图像采集系统 | 山东省农业科学院动物科学与兽医研究所 | 自主研发软件著作权 | |
| 96 点阵接种仪 | 山东省农业科学院动物科学与兽医研究所 | N/A | 专利产品 |
| 琼脂 | 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司 | HB8274-1 | |
| 阿米卡星 | 上海麦克林生化科技有限公司 | A857053 | |
| 阿莫西林 | 上海麦克林生化科技有限公司 | A822839 | |
| 氨苄西林 | 上海麦克林生化科技有限公司 | A830931 | |
| 分析天平 | Sartorius | BSA224S | |
| 动物源耐药性 Lar 指数自动计算软件 | 山东省农业科学院动物科学与兽医研究所 | 自主研发软件著作权 | |
| 细菌 Salmonella 菌株 | 山东省农业科学院动物科学与兽医研究所 | N/A | 动物源 |
| 细菌耐药 Lar 指数认证管理系统 V1.0 | 山东省农业科学院动物科学与兽医研究所 | 自主研发软件著作权 | |
| 头孢噻呋 | 上海麦克林生化科技有限公司 | C873619 | |
| 环丙沙星 | 上海麦克林生化科技有限公司 | C824343 | |
| 克拉维酸 | 上海麦克林生化科技有限公司 | C824181 | |
| 洁净工作台 | 苏州净化设备有限公司 | SW-CJ-2D | |
| 硫酸黏菌素 | 上海麦克林生化科技有限公司 | C805491 | |
| 培养板 | 山东省农业科学院动物科学与兽医研究所 | N/A | 专利产品 |
| 多西环素 | 上海麦克林生化科技有限公司 | D832390 | |
| 恩诺沙星 | 上海麦克林生化科技有限公司 | E809130 | |
| 滤膜 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| 氟苯尼考 | 上海麦克林生化科技有限公司 | F809685 | |
| 庆大霉素 | 上海麦克林生化科技有限公司 | G810322 | |
| 50 mL 玻璃瓶 | 徐州千星玻璃科技有限公司 | QX-7 | |
| 高通量耐药检测系统 V1.0 | 山东省农业科学院动物科学与兽医研究所 | 自主研发软件著作权 | |
| 图像采集转换器 | 山东省农业科学院动物科学与兽医研究所 | N/A | 专利产品 |
| 美罗培南 | 上海麦克林生化科技有限公司 | M861173 | |
| 穆勒-欣顿琼脂（Mueller-Hinton 琼脂） | 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司 | HB6232 | |
| 培养皿 60 mm × 15 mm | 青岛金典生化设备有限公司 | 16021-1 | |
| 培养皿 90 mm × 15 mm | 青岛金典生化设备有限公司 | 16001-1 | |
| Salmonella 噬菌体 | 山东省农业科学院动物科学与兽医研究所 | N/A | |
| 摇床培养箱 | 上海民权仪器有限公司 | MQD-S2R | |
| 浊度计 | 上海兴百生物技术有限公司 | F-TC2015 | |
| Varms 基础类型库系统 V1.0 | 山东省农业科学院动物科学与兽医研究所 | 自主研发软件著作权 | |
| 立式高压蒸汽灭菌器 | 上海申安医疗器械厂 | LDZX-75L | |
| 兽医病原耐药性检测管理系统 | 山东省农业科学院动物科学与兽医研究所 | 自主研发软件著作权 | |
| 兽医耐药性云监测与噬菌体防控平台 V1.0 | 山东省农业科学院动物科学与兽医研究所 | 自主研发软件著作权 |
参考文献
- Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
- Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C.
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重印与许可
