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方法文章

智能高通量抗菌药物敏感性检测/噬菌体筛选系统的应用及抗菌耐药性幼虫指数

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DOI：

10.3791/64785

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2023年7月21日

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1Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding, Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, P.R. China, Key Laboratory of Livestock and Poultry Multi-omics of MARA, 2Department of Genetic and Genomes Biology, University of Leicester, 3College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University

本文内容

摘要

本文介绍了智能高通量抗菌药物敏感性检测/噬菌体筛选系统的原理、结构及操作方法。以中国山东地区家禽分离的沙门氏菌（Salmonella）为例，说明该系统的应用。计算了Lar指数，并全面讨论了其在评估抗菌药物耐药性中的意义。

摘要

为提高抗菌药物敏感性试验（AST）和针对耐药菌的噬菌体高通量筛选的效率，并降低检测成本，依据美国临床实验室标准化协会（CLSI）制定的AST标准及耐药（R）折点，研制了一套智能化高通量AST/噬菌体筛选系统，该系统包括96点矩阵接种仪、图像采集转换器及配套软件。 & 美国临床与实验室标准协会（CLSI）。1,500 株菌的最低抑菌浓度（MIC）分布（从 R/8 至 8R）的抗菌药物敏感性试验及统计结果 沙门氏菌 中国山东家禽分离的菌株对10种抗菌药物的药敏试验，通过智能高通量AST/噬菌体筛选系统进行。Lar指数（“低抑菌、低耐药、残留直至极低抑菌”的缩写）通过计算各MIC的加权平均值并除以R获得。与使用耐药率来表征高耐药菌株的抗菌耐药性（AMR）程度相比，该方法提高了准确性。对于这些菌株 沙门氏菌 通过该系统，从噬菌体文库中高效筛选出对高耐药性（AMR）菌株具有裂解活性的噬菌体，并对裂解谱进行了计算与分析。结果表明，该智能高通量抗菌药物敏感性试验（AST）/噬菌体筛选系统操作可行、准确、高效、成本低廉且易于维护。结合山东省兽用抗菌药物耐药性监测系统，该系统适用于与耐药性（AMR）相关的科学研究及临床检测。

引言

由于抗菌剂已被广泛用于预防细菌感染性疾病，抗菌素耐药性（AMR）已成为一项全球公共卫生问题1。应对AMR的当前主要任务是监测流行病学病原体的抗菌素耐药性，以及开展敏感抗菌剂与裂解性噬菌体的协同治疗2。

体外抗菌药物敏感性试验（AST）是监测治疗效果和检测抗菌药物耐药性（AMR）水平的主要手段，是抗菌药物药理学的重要组成部分，也是临床用药的关键依据。美国临床与实验室标准协会（CLSI）和欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）已制定并修订了AST的国际标准，持续改进和补充AST方法及折点，以确定特定“病原体-抗菌药物”组合的最低抑菌浓度（MIC），并将其判定为敏感（S）、耐药（R）或中介（I）3,4。

从20世纪80年代到90年代，自动微量肉汤稀释仪器迅速发展并应用于临床实践，例如Alfred 60AST、VITEK System、PHOENIXTM和Cobasbact5,6,7。然而，这些仪器价格昂贵，需要使用高成本的耗材，且其检测范围主要针对临床患者的用药需求5,6,7。由于这些原因，它们不适用于兽医临床检测以及大量高耐药菌株的筛查。本研究开发了一种智能高通量AST/噬菌体筛选系统，包括96点矩阵接种仪（图1）、图像采集转换器（图2）及配套软件8，可通过琼脂稀释法一次性对一批细菌菌株进行多种抗菌药物的药敏试验（AST）。此外，该系统还可用于检测和分析噬菌体对耐药菌的裂解模式9，并能从噬菌体库中高效筛选出裂解性噬菌体。该系统被证实具有高效、经济且操作简便的优点。

使用移液器吸头和对齐系统的电泳凝胶加样实验室装置示意图。
图1：96点矩阵接种器的结构示意图。 1：接种针板；2：移动载体；3：种子块；4：培养板；5：底座；6：操作手柄；7：限位针。 请点击此处查看该图的放大版本。

光谱分析装置示意图：光学分析、DNA分离、荧光测量、实验设备。
图2：图像采集转换器的结构示意图。 1：外壳；2：显示屏；3：图像采集室；4：检测板底座；5：检测板出入仓；6：控制板；7：图像采集转换装置；8：光源；9：图像扫描仪。 请点击此处查看此图的放大版本。

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方案

的 沙门氏菌 本研究中使用的菌株采自中国山东省的家禽，在获得中国农业科学院山东省家畜科学院生物安全委员会批准后进行收集。

1. 智能高通量药敏试验系统的应用8

  1. 接种物制备
    1. 孵育质控菌株 大肠杆菌 和 93 沙门氏菌 在 Mueller-Hinton 琼脂（MHA）平板上于 35 °C 培养 16–18 小时用于药敏试验的待测菌株 37 °C3.
    2. 根据CLSI标准中规定的方法，将每种菌株的接种物制备至0.5麦氏浊度标准3然后稀释10倍。
    3. 放置 200 µL 将无菌生理盐水注入水平 1st 96 孔板的 A1 孔作为阴性对照，将两种质控菌悬液加入水平方向的 2nd 和 3rd 分别将 A2 孔设为阳性对照，A3 孔设为质控孔。添加 200 µL 将每种测试菌株的稀释接种液分别加入96孔种子板中对应的93个孔内。
  2. 抗菌琼脂平板的制备
    1. 根据Lar指数的计算范围（0.125R至8R）设定所测试的不同抗菌剂的浓度范围。浓度范围从质控范围或0.0625R（以较低范围为准）至8R。
      注意：如果未计算Lar指数，可根据药敏试验（AST）的需求设定抗生素浓度范围。
    2. 根据 CLSI 标准中规定的琼脂稀释法，从合适的抗生素储备液浓度开始，进行 log2 倍比稀释。3.
    3. 对含有18 mL Mueller-Hinton 琼脂培养基的50 mL玻璃瓶进行灭菌。将2 mL适当稀释的抗菌溶液加入已冷却至45–50 °C的18 mL熔融培养基中50 °C，充分混匀后，在生物安全柜中倒入培养皿。
    4. 在室温（RT）下使琼脂凝固，培养皿盖下留出缝隙，接种前吹干琼脂表面。
    5. 在培养皿背面标记抗菌剂的种类及浓度。将每种抗菌剂的多个培养皿按2倍稀释梯度顺序叠放成组。
    6. 为每种抗菌剂准备两个不含药物的琼脂平板作为对照。
  3. 96点矩阵接种器的接种步骤
    1. 在生物安全柜中，将已灭菌的接种针板安装到96点矩阵接种器的支架上。
    2. 将含有待测菌株的预制种子块和已孵育的琼脂平板放置于移动载体上，两块平板保持相同的定位角度。
    3. 推动移动载体，使种子块位于接种针板正下方。
    4. 按下操作手柄，将接种针板向下移动，使96根针准确插入种子板的96个孔中的菌液中。
    5. 在弹簧作用下，有控制地松开操作手柄，然后复位接种针板。
    6. 按压操作手柄 2-3 次，充分混匀每种接种物并浸入。推动并移动载体板，使培养后的平板位于接种针板正下方。
    7. 按下操作手柄，将接种针板下移，停留1-2秒，使接种针充分接触培养平板表面。
    8. 松开操作手柄，完成一次接种。更换另一个已培养的平板，继续循环操作，直至完成一组抗菌琼脂平板的接种。
    9. 更换另一个接种针平板和菌种块，接种另一组待测菌株。重复此步骤，直至完成全部接种。
      注意：先接种一个对照琼脂平板（不含抗菌剂），然后按照药物浓度从低到高的顺序接种平板，最后再接种第二个对照琼脂平板，以确保无污染或抗菌剂残留。接种量取决于每根接种针自然沉降的液体体积，约为 2 µL.
  4. 孵育抗菌琼脂平板
    1. 将接种后的抗菌琼脂平板在室温下孵育，直至接种液滴中的水分被琼脂吸收。
    2. 倒置平板，在37 °C下孵育16–20小时 37 °C 以确保受试菌株中的未受抑制细菌能够形成菌落。
  5. 图像采集与数据统计
    1. 双击 96点阵AST图像采集系统 打开程序。
    2. 点击 测试信息 在任务栏中。单击 新 创建一个新的测试任务，并根据提示填写相关信息，包括代码、名称、来源、细菌、菌株数量、抗生素及梯度。
    3. 点击 数据采集 > 拍摄照片 > 测试 选择新创建的任务。单击 抗生素 选择抗生素名称，然后单击 梯度 以选择该抗生素的初始浓度。
    4. 点击 连接 连接到图像采集转换器。
    5. 将相应的孵育平板放置在检测板底座上，缺角朝向右前方以定位，然后推入图像采集转换器中。
    6. 点击 样本采集 以获取图像。抗生素梯度将自动跳转至下一个梯度。依次放置下一块平板，并继续点击 样本采集 直到收集到该抗生素的平板为止。
    7. 点击 抗生素，然后选择下一组已孵育的培养板。点击 梯度 选择起始梯度并进入下一轮图像采集。
    8. 完成所有采集后，点击 提交程序将自动识别图像中每个接种点处的白色像素数量，判断是否存在菌落形成，并将图像转换为MIC值。
    9. 点击 查询 以获得各菌株对测试抗生素的最小抑菌浓度（MIC）结果。
      注意：智能高通量药敏试验系统适用于大批量细菌菌株的最小抑菌浓度（MIC）测定。检测过程包括制备、接种、孵育和结果读取，共需3天。抗生素种类和MIC检测范围可根据实际需求进行设置，主要耗材可重复使用。
  6. Lar指数的计算
    1. 使用以下公式准确计算Lar指数： 静力平衡方程，Σ MCi/R，Σ 2ifi，物理动力学中的数学公式。，其中：
      MICi最低抑菌浓度
      MIC分布范围从MIC-3 至 MIC3 表示以 R 为中心的连续两倍浓度梯度：0.125R、0.25R、0.5R、R、2R、4R 和 8R。
      MICi 除以 R 的方程符号，数学公式，静力平衡计算，用于教学 是 2i，i 的取值范围为 -3 到 3。
      R：美国临床和实验室标准协会（CLSI）制定的细菌对抗菌药物的耐药性折点。
      f：MIC 频率分布。
      注意：总Lar指数为所有Lar指数的算术平均值。计算Lar指数后，将最终结果保留小数点后两位有效数字。

2. 智能高通量噬菌体筛选系统9

  1. 准备噬菌体种子块和含细菌的双层培养平板。
    1. 采用双层琼脂法10或液体培养法11制备不同的噬菌体。将噬菌体稀释至适宜的平行浓度，滴度为 1 × 104-5 pfu/mL，并向96孔种子块中每孔加入 200 µL 噬菌体接种物。
    2. 制备含测试细菌的双层平板（底层琼脂培养基 10 mL [琼脂 12 g/L]，上层半固体琼脂培养基 6 mL [琼脂 6 g/L]，加入 100 µL 细菌悬液 [0.5 McFarland]）。
    3. 为每种待测菌株制备一块双层培养平板，在平板盖下留出缝隙，并在生物安全柜中吹干琼脂表面。
  2. 筛选试验
    1. 将已准备好的噬菌体种子块和双层平板放置于96点阵接种仪的移动载体上，将所有噬菌体接种物转移至半固体琼脂表面。重复此操作，直至完成全部待测菌株的接种。
    2. 将接种后的双层平板置于室温下，直至接种点中的液体完全被半固体琼脂吸收。
    3. 将平板倒置，并在适合待测菌株生长的条件下培养 4–6 小时，以确保形成清晰的溶菌斑。
  3. 数据分析
    1. 使用图像采集转换器（步骤 1.5.4–1.5.6）获取并保存每块双层平板实验结果的图像。
    2. 根据所获得的图像，记录不同形态噬菌斑的数量和形态特征至电子表格中，并计算各类噬菌体的相应比例。

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结果

根据智能高通量药敏试验系统的操作规程，通过以下方式展示了其应用： 沙门氏菌 以中国山东的家禽为例。

生长 沙门氏菌 含氨苄青霉素的琼脂平板上的菌株（R抗性） 32 µg/mL2至 256 µg/mL 由图像采集转换器确定的结果如图所示 图3水平的 1st A1 孔为阴性对照，未见菌落生长；A2 和 A3 为质控菌株，具有 MIC 4 µg/mL （在琼脂平板上形成菌落） 2 µg/mL 氨苄青霉素，但不影响 4 µg/mL），在CLSI标准化的质量控制范围内（2-8 µg/mL）。该 MIC 的 沙门氏菌 A4中的菌株 64 µg/mL，而A5的 16 µg/mL93 株菌的 MIC 分布 沙门氏菌 软件自动计算了各菌株对氨苄青霉素的抗性。

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讨论

琼脂稀释法已得到充分建立并被广泛应用。高通量药敏试验（AST）系统的基本原理即基于琼脂稀释法。该实验方案中的一个关键步骤是同时准确地高通量转移96个接种物，并需连续多次完成此操作。为实现这一关键步骤，96点阵接种器的针头必须均匀且极为光滑。每根针头自然沉降的液体体积约为2 µL，这些液滴在琼脂培养基表面聚集成微小液滴后可迅速被琼脂吸收，不会流动或飞溅，从而避免交叉污染。第二个关键步骤是对大量AST数据进行统计学处理。由于采用高通量接种，需要确定的测试数据量巨大，工作负荷极高。由智能图像采集转换器及其配套软件生成的智能化分析与统计结果，为此问题提供了完美的解决方案。AST结果可自动直接上传至Varms数据库，显著提高了结果判读的效率与准确性，并减少了人为因素导致的误差13。

第三个关键步骤是提出AMR的Lar指数。目前，全球范围内关于AMR的综合性评价指标较少。根据文献报道，Laxminarayan和Klugman提出了一种耐药指数（drug resistance index, DRI），用于衡量抗生素有效性的变化

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披露

刘玉清等人已就96点矩阵接种仪、图像采集转换器及其应用在中国申请了专利（专利号 ZL 201610942866.3 和专利号 ZL 201910968255.X）。

致谢

本工作得到了国家重点研发计划项目（2019YFA0904003）；山东省现代农业产业技术体系（SDAIT-011-09）；国际合作平台优化项目（CXGC2023G15）；中国山东省农业科学院农业科技协同创新重大任务（CXGC2023G03）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96 孔 培养板北京兰杰科技术有限公司11510
96 点阵药敏图像采集系统山东省农业科学院动物科学与兽医研究所自主研发软件著作权
96 点阵接种仪 山东省农业科学院动物科学与兽医研究所N/A专利产品
琼脂青岛高科技工业园海博生物技术有限公司HB8274-1
阿米卡星 上海麦克林生化科技有限公司A857053
阿莫西林上海麦克林生化科技有限公司A822839
氨苄西林上海麦克林生化科技有限公司A830931
分析天平SartoriusBSA224S
动物源耐药性 Lar 指数自动计算软件山东省农业科学院动物科学与兽医研究所自主研发软件著作权
细菌 Salmonella 菌株山东省农业科学院动物科学与兽医研究所N/A动物源
细菌耐药 Lar 指数认证管理系统 V1.0山东省农业科学院动物科学与兽医研究所自主研发软件著作权
头孢噻呋上海麦克林生化科技有限公司C873619
环丙沙星上海麦克林生化科技有限公司C824343
克拉维酸上海麦克林生化科技有限公司C824181
洁净工作台苏州净化设备有限公司SW-CJ-2D
硫酸黏菌素上海麦克林生化科技有限公司C805491
培养板山东省农业科学院动物科学与兽医研究所N/A专利产品
多西环素上海麦克林生化科技有限公司D832390
恩诺沙星上海麦克林生化科技有限公司E809130
滤膜 0.22 μmMilliporeSLGP033RB
氟苯尼考上海麦克林生化科技有限公司F809685
庆大霉素上海麦克林生化科技有限公司G810322
50 mL 玻璃瓶徐州千星玻璃科技有限公司QX-7
高通量耐药检测系统 V1.0山东省农业科学院动物科学与兽医研究所自主研发软件著作权
图像采集转换器山东省农业科学院动物科学与兽医研究所N/A专利产品
美罗培南上海麦克林生化科技有限公司M861173
穆勒-欣顿琼脂（Mueller-Hinton 琼脂）青岛高科技工业园海博生物技术有限公司HB6232
培养皿 60 mm × 15 mm青岛金典生化设备有限公司16021-1
培养皿 90 mm × 15 mm青岛金典生化设备有限公司16001-1
Salmonella 噬菌体山东省农业科学院动物科学与兽医研究所N/A
摇床培养箱上海民权仪器有限公司MQD-S2R
浊度计上海兴百生物技术有限公司F-TC2015
Varms 基础类型库系统 V1.0山东省农业科学院动物科学与兽医研究所自主研发软件著作权
立式高压蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂LDZX-75L
兽医病原耐药性检测管理系统山东省农业科学院动物科学与兽医研究所自主研发软件著作权
兽医耐药性云监测与噬菌体防控平台 V1.0山东省农业科学院动物科学与兽医研究所自主研发软件著作权

参考文献

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