智能高通量抗菌药敏检测/噬菌体筛选系统及Lar耐药性指数的应用

Summary

在这里，我们介绍了智能高通量抗菌药敏检测/噬菌体筛选系统的原理、结构和说明。以中国山东省家禽中分离的 沙门氏菌 为例，说明了其应用。计算Lar指数，并全面讨论其在评估抗菌素耐药性方面的意义。

Abstract

为了提高耐药菌药敏试验（AST）和噬菌体高通量筛选的效率，降低检测成本，根据AST标准和临床与实验室标准协会（CLSI）制定的耐药性断点（R），开发了一种智能高通量AST/噬菌体筛选系统，包括96点阵接种器、图像采集转换器和相应的软件。采用智能高通量AST/噬菌体筛选系统，对山东省家禽中分离的1500株 沙门氏 菌菌株的AST和最小抑菌浓度（MIC）分布（R/8-8R）进行统计。Lar指数，即"较少的抗生素，较少的耐药性和残留，直到很少的抗生素"，是通过计算每个MIC的加权平均值并除以R得到的。与使用耐药性流行率来表征高度耐药菌株的抗菌素耐药性 （AMR） 程度相比，这种方法提高了准确性。对于AMR高的 沙门氏 菌菌株，利用该系统从噬菌体文库中高效筛选裂解噬菌体，并计算分析裂解谱图。结果表明，智能高通量AST/噬菌体筛选系统具有可操作性、准确性、高效、成本低廉、易于维护等特点。该系统与山东省兽用抗菌素耐药性监测系统相结合，适用于与AMR相关的科学研究和临床检测。

Introduction

随着抗菌药物被广泛用于预防细菌性传染病，抗菌素耐药性（AMR）已成为全球公共卫生问题¹。抗击抗微生物药物耐药性是目前监测流行病病原体抗微生物药物耐药性以及敏感抗菌剂和溶菌噬菌体的协同治疗的主要^任务2。

体外 抗菌药物敏感性试验 （AST） 是监测治疗和检测 AMR 水平的主要方法。它是抗菌药理学的重要组成部分，也是临床用药的重要基础。美国临床和实验室标准协会（CLSI）和欧洲药敏试验委员会（EUCAST）制定和修订了AST的国际标准，并不断修改和补充AST方法和断点，以确定某种"生物体-抗菌剂"组合的MIC为敏感（S）、耐药（R）或中间（I）^3，4.

从 1980 年代到 1990 年代，自动微量肉汤稀释仪器迅速发展并应用于临床实践，例如 Alfred 60AST、VITEK System、FISTM 和 Cobasbact⁵、^6、7。然而，这些仪器价格昂贵，需要高成本的耗材，并且它们的检测范围是为临床患者用药设计的^5,6,7。由于这些原因，它们不适合兽医临床检查和大量高耐药菌株的检测。本研究开发了一种智能高通量AST/噬菌体筛选系统，包括96点基质接种器（图1）、图像采集转换器（图2）和相应的软件⁸，通过琼脂稀释法对一批细菌菌株同时对多种抗菌剂进行AST。此外，该系统还用于检测和分析噬菌体对抗菌耐药菌的裂解模式⁹，并从噬菌体库中高效筛选裂解噬菌体。该系统被发现高效、经济且易于操作。

图 1:96 点阵接种器的结构图。 1:接种针板;2:移动运营商;3:种子块;4:孵育板;5:底座;6:操作手柄;7:限位销。请点击这里查看此图的较大版本.

图2:图像采集转换器的结构图。 1:外壳;2:显示屏;3:图像采集室;4:检测板底座;5:出入库检测板;6:控制板;7:图像采集转换装置;8:光源;9:图像扫描仪。请点击这里查看此图的较大版本.

Protocol

本研究中使用的 沙门氏菌菌 株是在获得中国山东省农业科学院畜牧兽医研究所生物安全委员会的批准后从中国山东家禽中采集的。

1. 智能高通量AST系统的应用⁸

1. 接种物制备
   1. 将质量控制微生物 大肠杆 菌和93种 沙门氏菌 菌株在37^°C下在Mueller-Hinton琼脂（MHA）平板上检测AST16-18小时3。
   2. 根据CLSI标准³中规定的方法制备每种菌株的接种物以匹配0.5McFarland浊度标准品，然后稀释10倍。
   3. 将 200 μL 无菌生理盐水放入 96 孔板的水平^第 1 孔 （A1） 中作为阴性对照，将两个质控生物悬浮液分别放入水平第 2 和第 3^孔（A2 和 A3）中作为阳性对照和质量控制。将每种测试染色剂的 200 μL 稀释接种悬浮液加入 96 孔种子块中的相应 93 孔中。
2. 抗菌琼脂平板的制备
   1. 根据Lar指数的计算范围（从0.125R到8R）设置不同抗菌剂的浓度范围。浓度范围从质量控制范围或0.0625R（以较低范围为准）到8R。
      注:如果不计算Lar指数，可根据AST的需要设置抗生素浓度范围。
   2. 根据CLSI标准³中规定的琼脂稀释方法，从合适的储备液浓度开始，对抗生素溶液执行log2加倍稀释方案。
   3. 对含有 18 mL Mueller-Hinton 琼脂培养基的 50 mL 玻璃瓶进行灭菌。将2 mL适当稀释的抗菌溶液加入冷却至45-50°C的18 mL熔融培养基中，充分混合，然后倒入生物安全柜中的板中。
   4. 让琼脂在室温（RT）下凝固，在孵育平板的盖子下留出间隙，并在接种前吹干琼脂表面。
   5. 在孵育板的反面标记抗菌剂的类型和浓度。将每种抗菌剂的多个孵育板按 log2 倍稀释顺序排列在堆栈中。
   6. 准备两个无药物琼脂平板作为每种抗菌剂的对照。
3. 96点阵接种仪的接种步骤
   1. 将高压灭菌的接种针板安装在生物安全柜中96点基质接种器的支架上。
   2. 将制备的种子块与测试菌株和琼脂孵育板放在移动载体上，两个板的定位角度相同。
   3. 推动移动载体，使种子块位于接种针板的正下方。
   4. 按下操作手柄，向下移动接种针板，将96针对准种子块96孔中的接种物。
   5. 用控制松开操作手柄，然后在弹簧的作用下复位接种针板。
   6. 按压操作手柄 2-3 次，充分搅拌每个接种物并浸泡。推动并移动载板，使孵育板位于接种针板的正下方。
   7. 按下操作手柄，将接种针板向下移动，停止1-2秒，使接种针与培养板表面充分接触。
   8. 松开操作手柄。这样就完成了一次接种。更换另一个孵育的平板并继续循环，直到一组抗菌琼脂平板完成。
   9. 更换另一个接种针板和种子块，接种另一组供试菌株。循环直到所有接种完成。
      注意:首先接种对照琼脂平板（无抗菌剂），然后按药物浓度从低到高的顺序接种平板，最后接种第二个对照琼脂平板，以确保没有污染或抗菌剂残留。接种体积取决于每个引脚的自然沉积体积约为 2 μL。
4. 孵育抗菌琼脂平板
   1. 在室温下孵育接种的抗菌琼脂平板，直到接种斑点中的水分被吸收到琼脂中。
   2. 倒置平板并在37°C下为测试菌株孵育16-20小时，以确保不受抑制的细菌形成菌落。
5. 图像采集和数据统计
   1. 双击 96点阵AST图像采集系统 打开程序。
   2. 单击任务栏中的 "测试信息 "。点击新建， 新建 测试任务，根据提示填写信息，包括代号、名称、来源、菌株、菌株数、抗生素、梯度等。
   3. 单击" 数据收集">"照片>测试 "项以选择创建的新任务。单击 "抗生素 "以选择抗生素的名称，然后单击" 梯度 "以选择该抗生素的初始浓度。
   4. 单击 "连接 "以连接图像采集转换器。
   5. 将相应的孵育板放在检测板底座上，缺失角度在右前方进行定向，然后推入图像采集转换器。
   6. 单击 "集合 "以获取图像。抗生素梯度将自动跳转到下一个梯度。依次放置下一个培养皿，然后继续单击 "收集 "，直到收集完该抗生素的培养皿。
   7. 单击 "抗生素"，然后选择下一组孵育板。单击" 渐 变"以选择起始渐变，然后继续进行下一轮图像收集。
   8. 完成所有收集后，单击 "提交"。该程序将自动识别图像中每个接种点格式化的白色像素数，确定是否有菌落形成并将图像转换为MIC值。
   9. 单击 "查询 "以获取针对测试抗生素的菌株的所有 MIC 结果。
      注:智能高通量AST系统适用于测定大批量细菌菌株的MIC。测试过程，包括准备、接种、孵育和结果读取，需要 3 天。抗生素种类和MIC检测范围可根据各自需要设置，主要耗材可重复使用。
6. Lar指数的计算
   1. 使用以下公式准确确定 Lar 指数: ，其中:
      MIC_i:最低抑菌浓度。
      从 _MIC-3 到 MIC₃ 的 MIC 分布范围表示以 R 为中心的连续两倍浓度:0.125R、0.25R、0.5R、R、2R、4R 和 8R。
      是 2^i，i 的范围是 -3 到 3。
      R:CLSI标准化的细菌对抗菌剂耐药性的断点。
      f:MIC频率分布。
      注:一般 Lar 指数是所有 Lar 指数的算术平均值。计算 Lar 索引后，将最终值四舍五入到小数点后两位有效数字。

2. 智能高通量噬菌体筛选系统9

1. 制备噬菌体种子块和含有细菌的双层培养板。
   1. 使用双层琼脂法¹⁰ 或液体培养法¹¹ 制备不同的噬菌体。以 1 x 10^4-5 pfu/mL 的滴度稀释至合适的平行浓度，并将 200 μL 噬菌体接种物加入 96 孔种子块中。
   2. 用细菌（10 mL 底部琼脂培养基 [琼脂 12 g/L] 和 6 mL 上半琼脂培养基 [6 g/L] 和 100 μL 细菌 [0.5 McFarland]）制作双层平板进行测试。
   3. 为要测试的每种菌株制作双层孵育板。在双层板的盖子下留出一个间隙，然后吹干生物安全柜中的琼脂表面。
2. 筛选试验
   1. 将制备好的噬菌体种子块和双层板放在96点基质接种器的移动载体上，并将所有噬菌体接种物转移到半琼脂表面。继续循环，直到所有测试菌株完成。
   2. 让接种的双层板保持在室温下，直到接种点中的水分完全吸收到半琼脂中。
   3. 倒置平板并在合适的条件下为测试菌株孵育4-6小时，以确保形成清晰的裂解点。
3. 分析数据
   1. 通过图像采集转换器获取并保存每个双层板的实验结果的图像（步骤1.5.4-1.5.6）。
   2. 根据获得的图像，将不同形状斑点的数量和形态记录到电子表格中，并计算不同种类噬菌体的各自比例。

Results

遵循智能高通量AST系统的方案，以中国山东家禽 沙门氏菌 为例说明其应用。

沙 门氏菌 菌株在含有氨苄青霉素（R为32μg/ mL）的琼脂平板上生长，浓度为2至256μg/ mL，由图像采集转换器确定，如图 3所示。水平1^号 井A1为阴性对照，未显示菌落生长;A2和A3为CLSI标准化的质控范围（2-8 μg/mL）为质控菌株，MIC为4 μg/mL（用2 μg/mL氨苄青霉素在琼脂平板上形成菌落，但未在4 μg/mL的琼脂平板上形成菌落）。 沙门氏菌 菌株在A4中的MIC为64 μg/mL，而A5的MIC为16 μg/mL。软件自动计算93种 沙门氏菌 菌株对氨苄青霉素的MIC分布。

Discussion

琼脂稀释法已经得到广泛应用。高通量AST系统的原理是琼脂稀释法。该协议中的关键步骤之一是一次准确高通量转移 96 个接种物，该转移连续多次进行。为了完成这一关键步骤，96点阵接种器的引脚均匀且非常光滑。每个引脚的自然沉积体积约为 2 μL，在琼脂培养基表面聚集成小液滴，迅速吸收到琼脂中，不会流动或飞溅以造成交叉污染。第二个关键步骤是对大型AST数据进行统计处理。在高通量接种的情况下，需要确定测试数据，工作量巨大。智能图像采集转换器和配套软件产生的智能分析和统计结果是该问题的完美解决方案。AST 结果会自动直接上传到 Varms 数据库。提高了结果解释的效率和准确性，减少了人为因素造成的误差¹³。

第三个关键步骤是提出AMR的Lar指数。目前，国际上尚无抗微生物药物耐药性综合评价指标。根据文献，Laxminarayan 和 Klugman 描述了耐药指数 （DRI） 来衡量抗生素有效性的变化^14,15。它结合了耐药率和处...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96孔 培养板	北京蓝捷科科技有限公司	11510
96点阵AST图像采集系统	山东省农业科学院畜牧兽医研究所	自家软件版权所有
96点阵接种器	山东省农业科学院畜牧兽医研究所	N/A	专利产品
琼脂	青岛市高新技术产业园 海博生物科技有限公司	HB8274-1
阿米卡星	上海麦克莱恩生化科技有限公司	A857053
阿莫西林	上海麦克莱恩生化科技有限公司 A822839
氨苄西林	上海麦克莱恩生化科技有限公司	A830931
分析天平	赛多利斯	BSA224S
AMR	Lar 指数自动计算软件山东省农业科学院畜牧兽医研究所	自有软件版权所有
细菌沙门氏菌 strains	山东省农业科学院畜牧兽医研究所	N/A	动物源
性细菌耐药性 Lar 指数认证管理系统 V1.0	山东省农业科学院畜牧兽医研究所	内部软件版权所有
头孢噻呋	上海麦克莱恩生化科技有限公司 C873619
环丙沙星	上海麦克莱恩生化科技有限公司	C824343
克拉维酸	上海麦克莱恩生化科技有限公司	C824181
洁净工作台	苏州净化设备有限公司	SW-CJ-2D
硫酸粘菌素	上海麦克莱恩生化科技有限公司	C805491
培养板	山东省农业科学院畜牧兽医研究所	N/A	专利产品
多西环素	上海麦克莱恩生化科技有限公司
恩诺沙星	上海麦克莱恩生化科技有限公司	E809130
滤 0.22 &μ;m	Millipore	SLGP033RB
氟苯尼考	上海麦克莱恩生化科技有限公司	F809685
庆大霉素	上海麦克莱恩生化科技有限公司	G810322
玻璃瓶 50 mL	徐州乾星玻璃科技有限公司	QX-7
高通量耐药性检测系统 V1.0	山东省农业科学院畜牧兽医研究所	自有软件版权所有
图像采集转换器	山东省农业科学院畜牧兽医研究所	N/A	专利产品
美罗培南	上海麦克莱恩生化科技有限公司	M861173
Mueller-Hinton 琼脂	青岛市高新技术产业园区海博生物科技有限公司	HB6232
培养皿 60 mm x 15 mm	青岛金点生化设备有限公司	16021-1
培养皿 90 mm x 15 mm	青岛金点生化设备有限公司	16001-1
沙门氏菌 噬菌	山东省农业科学院畜牧兽医研究所	N/A
摇床培养箱	上海民泉仪器有限公司	MQD-S2R
浊度仪	上海兴佰生物科技有限公司	F-TC2015
Varms 基式库系统 V1.0	山东省农科院畜牧兽医研究所	自家软件著作权
立式高压蒸汽消毒器	上海申安医疗器械厂	LDZX-75L
兽用病原菌耐药性检测管理系统	山东省农业科学院畜牧兽医研究所	自有软件版权所有
兽用耐药云监测噬菌体控制平台V1.0	山东省农业科学院畜牧兽医研究所	自有软件著作权