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方法文章

离体 基于聚乙烯醇培养体系的小鼠造血干细胞扩增与遗传操作

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⸱

DOI：

10.3791/64791

⸱

2023年2月10日

 ,  , 
1MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, University of Oxford

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于启动、维持和分析小鼠造血干细胞培养的实验方案 离体 基于聚乙烯醇的扩增，以及通过慢病毒转导和电穿孔对其进行遗传操作的方法。

摘要

自我更新 多能的 造血干细胞（HSCs）是一类重要的细胞类型，因其能够在整个生命周期中维持造血功能，并在移植后重建完整的血液系统。HSCs 已被临床应用于干细胞移植治疗，该疗法是多种血液系统疾病的根治性手段。目前，人们高度关注对调控 HSC 活性及造血过程的机制研究，以及新型 HSC 相关疗法的开发。然而，HSCs 的稳定培养与扩增仍面临挑战。 离体 一直是研究这些易于处理的干细胞的主要障碍 离体 系统。我们近期开发了一种基于聚乙烯醇的培养系统，可支持可移植小鼠造血干细胞的长期、大规模扩增，并实现了对其进行基因编辑的方法。本实验方案描述了培养和基因操控小鼠造血干细胞的技术方法 通过 电穿孔和慢病毒转导。本方案预期对广泛从事造血干细胞生物学及造血过程研究的实验血液学研究人员具有实用价值。

引言

造血系统通过特化的血细胞和免疫细胞类型，支持哺乳动物体内多种基本生理过程，从氧气输送至抵御病原体。持续的血液生成（即造血作用）对于维持血液系统的稳态至关重要，这一过程由造血干细胞和祖细胞（HSPCs）1所维持。其中最原始的造血细胞是造血干细胞（HSC），具有自我更新和多谱系分化的能力2,3。HSC是一类稀有细胞群体，主要存在于成年个体的骨髓中4，其频率约为每30,000个细胞中仅有一个。HSC被认为能够支持终生的造血功能，并在遭受血液系统应激后帮助重建造血功能。这些特性还使得HSC在移植到经辐照处理的受体体内后，能够稳定地重建整个造血系统5。这构成了HSC的功能性定义，也是HSC移植疗法的科学基础——该疗法是多种血液系统和免疫系统疾病的根治性治疗手段6。正因如此，HSC成为实验血液学研究的主要焦点。

尽管研究投入巨大，但稳定扩增造血干细胞（HSCs）仍然具有挑战性 离体7我们最近开发了首个长期 离体 小鼠造血干细胞扩增培养系统8该方法可在4周的培养期内将可移植的造血干细胞扩增234至899倍。与其它方法相比，本方案的主要改进在于去除血清白蛋白，并以一种合成聚合物替代。聚乙烯醇（PVA）被确定为小鼠造血干细胞培养中最优的聚合物。8，该方法现已被用于培养其他类型的造血细胞9然而，最近还发现另一种名为Soluplus（一种聚乙烯基己内酰胺-醋酸酯-聚乙二醇接枝共聚物）的聚合物，似乎能够促进克隆性造血干细胞的扩增10在使用聚合物之前，曾采用胎牛血清、牛血清白蛋白第V组分或重组血清白蛋白的形式，但这些成分对造血干细胞扩增的支持能力有限，且仅能维持短期扩增（约1周） 离体 培养7然而，需要注意的是，能够维持造血干细胞（HSC）处于静息状态的HSC培养方案可支持更长的 离体 培养时间11,12.

与其他培养方法相比，基于PVA的培养体系主要优势在于能够生成的细胞数量，以及该方案可用于追踪造血干细胞（HSCs）的时间长度。 离体这克服了实验血液学领域中的多个障碍，例如每只小鼠可分离的造血干细胞（HSC）数量极少（仅数千个），以及难以长期追踪HSC的问题。 体内然而，重要的是要记住，这些培养条件会刺激造血干细胞的增殖，而 体内 静息状态下，造血干细胞池主要处于静止状态13此外，尽管该培养体系对造血干细胞（HSCs）具有选择性，但随着培养时间的推移，其他类型的细胞也会逐渐积累；培养1个月后，具有移植能力的HSC仅约占总细胞数的1/34。髓系造血祖细胞似乎是这些HSC培养物中的主要污染细胞类型。8然而，我们可以利用这些培养体系从异质性细胞群体（例如，c-Kit）中富集造血干细胞（HSCs）+ 骨髓HSPCs14它还支持对造血干细胞（HSCs）进行转导或电穿孔以实现遗传操作14,15,16为了从异质性的培养HSPC群体中帮助鉴定HSCs，CD201（EPCR）最近被确定为一种有用的标记 离体 造血干细胞标志物10,17,18，具有可移植性 仅限于CD201的造血干细胞+CD150+c-Kit+Sca1+谱系- 组分

本方案描述了启动、维持和评估基于PVA的小鼠造血干细胞扩增培养的方法，以及在这些培养体系中利用电穿孔或慢病毒载体转导进行遗传操作的方案。这些方法预期对各类实验血液学研究人员具有重要应用价值。

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方案

所有动物实验操作，包括繁育和安乐死，均须在机构和国家规定的指南范围内进行。下述实验已获得英国政府内政部的批准。有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和设备的列表，请参见材料表。

1. 储备液的配制

  1. PVA 储存液
    1. 取 50 mL 细胞培养级水置于适合高压灭菌的小玻璃瓶中。用微波炉将水加热至接近沸腾。
    2. 称取 5 g PVA 粉末加入水中。
      注意：建议仅溶解 1–5 g PVA。溶解量过大可能导致复溶不完全。
    3. 盖紧瓶盖并振荡混匀，随后略微松开瓶盖。
      注意：重新打开时需小心，因水温变化可能导致瓶内压力改变。
    4. 高压灭菌后冷却至室温。盖紧瓶盖并振荡混匀。分装至无菌离心管中，4 °C 可保存长达 3 个月。
  2. 将冻干的细胞因子溶解于含 1 mg/mL PVA 的 F-12 培养基中。将干细胞因子复溶至 10 µg/mL，血小板生成素复溶至 100 µg/mL，配制成 1:1,000 的储存液。分装至无菌离心管中，长期保存于 -80 °C。也可在 4 °C 保存最多 1 周。
    注意：由于对小鼠 HSC 扩增具有负面影响，应避免使用牛血清白蛋白复溶细胞因子。

2. HSC 骨髓提取与 c-Kit+ 富集

  1. 从新处死的8-12周龄C57BL/6小鼠中解剖出股骨、胫骨、骨盆和脊柱（通过 CO2 窒息和/或颈椎脱位）并将骨骼置于冰上的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
    注意：确保使用70%乙醇对表面和工具进行灭菌。
  2. 使用无绒精细擦拭巾清理骨骼，去除肌肉和脊髓组织，加入约 3 mL PBS 的研钵中。
    注意：确保研钵和研杵用70%乙醇灭菌，然后用PBS冲洗一次。
  3. 用研杵轻轻捣碎骨骼，避免研磨，以尽量减少剪切力。使用连接5 mL注射器的19 G针头将释放到PBS中的大块骨髓组织破碎。将细胞悬液经70 µm滤膜过滤后转移至50 mL锥形管中。
  4. 将悬浮液转移后，用新鲜的PBS重复操作，直至骨骼变白且无可见骨髓。每只小鼠的终体积约为30 mL，两只小鼠约为50 mL。
  5. 混合骨髓细胞，取10 µL细胞悬液，用血细胞计数板在1:10至1:20稀释度下以 Türk溶液进行细胞计数。
    注意：一只小鼠预计可获得 2-5 × 108 全骨髓细胞
  6. 450 × g 离心 g 4 °C下离心5分钟，弃上清，将沉淀重悬于预冷的PBS中（一只小鼠使用350 µL，两只小鼠使用500 µL）。
  7. 每1000万个细胞加入0.2 µL别藻蓝蛋白（APC）标记的抗c-Kit抗体，在4 °C避光孵育30分钟。
  8. 向孵育后的细胞中加入5 mL冷PBS，以洗去多余的抗体，并通过50 µm滤膜过滤至新的15 mL离心管中。
  9. 用 7 mL 冷 PBS 清洗原试管，并通过滤器转移。若发生滤器堵塞，可用 P1000 吸头轻轻刮擦滤器表面。
  10. 450 × g 离心 g 4 °C下离心5分钟，弃上清，将沉淀重悬于预冷的PBS中（一只小鼠使用350 µL，两只小鼠使用500 µL）。
  11. 向每1000万个细胞中加入0.2 µL抗APC微珠，4 °C避光孵育15分钟。加入12 mL无菌PBS以洗去未结合的微珠。
  12. 以 450 × g 离心细胞 g 4 °C下离心5分钟，弃上清，重悬于2 mL预冷的PBS中。此步骤离心期间，可继续进行步骤2.13。
  13. 将磁性过滤柱置于磁性柱分离器的磁铁中，柱顶放置50 µm滤器，下方放置15 mL锥形管，以准备进行柱富集。
  14. 用3 mL无菌PBS流经50 µm滤膜和过滤柱。待PBS完全通过后，将细胞悬液通过该柱，随后每次用3 mL冷PBS洗涤三次。每次洗涤时，需等待过滤柱停止滴液后再加入下一次洗涤液。
  15. 将柱子从磁铁上取下，置于一个新的15 mL离心管上。加入5 mL冷的PBS，将柱塞安装到柱子上，通过推动柱塞洗脱细胞。
  16. 混合c-Kit富集细胞，取10 µL细胞悬液，用Türks溶液以1:2比例稀释后，使用血细胞计数板进行计数。每只小鼠通常可获得2-5 × 10⁶个细胞。6 c-Kit+ 细胞
    注意：此时，细胞可直接接种至造血干细胞培养基中，或进行造血干细胞荧光激活细胞分选（FACS）纯化的准备。

3. 使用 c-Kit 富集的造血干细胞和祖细胞启动细胞培养

  1. 根据所需细胞数量/孔，配制新鲜培养基（表1）。对于c-Kit富集的造血干细胞和祖细胞（HSPCs），以每毫升0.5-1×10⁶个细胞的密度接种。
  2. 将c-Kit富集的细胞离心沉淀，重悬于HSC培养基中，调整至所需细胞密度。
  3. 将细胞接种至纤维连接蛋白包被或表面带负电荷的培养板中，每孔96孔板加入200 µL，每孔24孔板加入1 mL。
  4. 将细胞置于设定为37 °C、5% CO2的组织培养箱中培养。

4. 使用FACS纯化的HSCs启动细胞培养

  1. 准备适量的生物素化谱系抗体染色液：每1000万细胞使用3 µL主混合液（表2），用PBS按1:100稀释。
  2. 将c-Kit富集的细胞离心沉淀，重悬于谱系抗体染色液中，在4 °C孵育30分钟。
  3. 用10 mL无菌PBS洗涤，于4 °C以450 × g离心5分钟。
  4. 准备适量的新鲜造血干细胞（HSC）抗体染色液（表3）：每1000万细胞使用300 µL。同时，为补偿和设门准备相应的染色对照样本。
    注意：使用荧光染料偶联抗体时，应在关闭光源的组织培养罩内操作。
  5. 将细胞重悬于HSC抗体染色液中，在4 °C孵育90分钟。每20–30分钟轻敲管壁混匀，防止细胞沉淀。
  6. 用10 mL无菌PBS洗涤，于4 °C以450 × g离心5分钟。
  7. 吸除上清液，轻弹管底使沉淀重悬，再用含0.5 µg/mL碘化丙啶（PI）的无菌PBS重悬细胞。
  8. 根据所需孔数准备新鲜培养基（表1），接种至纤维连接蛋白包被板或负电荷表面板（每96孔板孔200 µL，每24孔板孔1 mL）。
  9. 准备FACS分选仪进行分选，直接将CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage-造血干细胞分选至含培养基的孔中（参见图1中所示的标准FACS设门策略）。每96孔板孔最多分选200个细胞，每24孔板孔最多分选1,000个细胞。
    注意：FACS仪器应由经过培训的科研人员操作。若用户缺乏小鼠造血干细胞FACS分离经验，建议联系本地FACS平台讨论此分选策略。

5. 进行培养基更换

  1. 对于由c-Kit富集细胞起始的细胞培养，从第2天开始更换培养基；对于由FACS分离的HSC起始的细胞培养，从第5天开始更换培养基。
  2. 为所有孔板准备足量的新鲜预热（约37 °C）HSC培养基（表1）。
  3. 轻柔地将培养板从组织培养孵育箱中取出。
    注意：由于造血干细胞/祖细胞（HSPC）在带负电荷的表面培养板上比在纤维连接蛋白包被的板上更容易被扰动，因此在更换带负电荷表面培养板的培养基时需格外小心，避免扰动细胞培养物。
  4. 使用移液器或真空泵，缓慢吸除孔中约90%–95%的培养基液面部分。
    注意：避免从孔底吸取培养基，否则会带走大量细胞。
  5. 向每孔中加入200 µL（96孔板）或1 mL（24孔板）新鲜培养基。
  6. 将培养板放回组织培养孵育箱中。
  7. 每2–3天重复步骤5.1–5.6，直至达到实验终点。
  8. 对于使用c-Kit富集的HSPC起始的细胞培养（第3节），约3周后以1:2–1:3的比例传代；对于使用FACS纯化的HSC起始的细胞培养（第4节），约3周后且当细胞培养物汇合度>90%时，以1:2–1:3的比例传代。
    ​注意：具体时间安排将取决于实验目的。这些培养物已可在体外维持4–8周8，但更长时间的培养也可能实现。

6. 对培养的造血干细胞和祖细胞进行电穿孔

注意：本方案适用于 Cas9/sgRNA 核糖核蛋白（RNP）的电穿孔，但也可根据需要调整用于 mRNA 或其他重组蛋白的电穿孔。为在预定的实验时间点进行操作，需以足够数量的细胞起始培养。

  1. 电穿孔前一天进行换液，具体操作如第5节所述。
    注意：建议电穿孔前至少培养过夜。然而，通常在转导前将细胞培养1-3周。
  2. 在电穿孔当天，设置核转染仪。打开仪器电源，在触摸屏上选择X模块，然后选择所使用的比色杯尺寸。
  3. 根据电穿孔规模（每比色杯100 µL或每微比色杯20 µL），按制造商说明书准备足量的P3溶液，并使其平衡至室温。
  4. 根据接种孔数准备足量的新鲜培养基（表1），向24孔板每孔加入500 µL培养基，或向96孔板每孔加入100 µL培养基。
  5. 将sgRNA（预先用无RNase水稀释至2 µg/mL）置于冰上解冻，并在无菌PCR管中将16 µg sgRNA与30 µg Cas9酶（浓度为10 µg/mL）混合。另设一个仅含Cas9蛋白的PCR管作为对照。通过轻弹管壁混匀，短暂离心后，在25 °C下于热循环仪中孵育10分钟以形成RNP复合物，随后将试管置于冰上保存。
    注意：若使用微比色杯进行电穿孔，可将上述用量缩小五倍。
  6. 将用于电穿孔的HSPCs混匀并转移至离心管中；取10 µL细胞悬液，用Türks溶液按1:2稀释后，使用血细胞计数板进行细胞计数。
    注意：建议每100 µL比色杯电穿孔100万至500万个细胞（微比色杯则相应缩小五倍）。
  7. 将适量细胞在4 °C下以450 × g离心5分钟。尽可能吸除上清液，并用100 µL核转染缓冲液重悬细胞。
  8. 立即将细胞悬液转移至含有已形成复合物的RNP的PCR管中，缓慢吹打数次以轻柔混匀，然后转移至100 µL电穿孔比色杯中。将混合液缓慢且连续地注入比色杯，避免产生气泡。
  9. 在电穿孔仪上选择待电穿孔的孔位。通过触摸屏选择细胞类型程序CD34+、human，或手动输入脉冲代码EO100，然后按下OK 按钮。
  10. 将比色杯放入电穿孔仪中，按下触摸屏上的Start 按钮启动电穿孔。电穿孔完成后立即向比色杯中加入500 µL培养基（若使用微比色杯则加入100 µL）。
  11. 轻柔地将细胞转移至预先准备好的培养板中，并放回组织培养孵箱。
  12. 对于使用AAV6供体质粒的实验，在细胞转移至纤维连接蛋白包被的培养板后，立即以每细胞5,000个病毒载体的浓度加入该载体。
  13. 6-18小时后，准备新鲜培养基并按第5节所述进行换液操作。此次换液仅移除80%-90%的培养基。
    注意：避免从孔底吸取培养基。
  14. 在2天或更长时间后，通过流式细胞术分析细胞（详见第8节）。
  15. 继续按照第5节所述每2天进行一次换液，直至达到实验终点。
    ​注意：采用本方法的CRISPR/Cas9编辑效率高度依赖于所设计sgRNA的靶向效率。高效向导RNA可实现高达95%的编辑率15。sgRNA设计指南此前已有详细报道19,20。

7. 使用慢病毒载体转导培养的造血干细胞和祖细胞

注意：应以足够数量的细胞起始培养，以便在预定的实验时间点进行操作。

  1. 制备并测定慢病毒载体滴度（根据实验目的而定）。将慢病毒载体在冰上解冻。
  2. 更换培养基（如第5节所述）；然后将HSPCs混合并转移至离心管中用于转导。取10 µL细胞，用Türks溶液以1:2稀释后，使用血细胞计数板进行细胞计数。
    注意：细胞可在铺板后立即进行转导。然而，通常在转导前将细胞培养1-3周。
  3. 将所需剂量的细胞重新接种至培养板中用于转导（通常每96孔板接种100,000个细胞）。另设未转导的阴性对照细胞组单独接种。
    注意：若使用带负电荷的培养板，需将细胞转移至纤维连接蛋白包被的培养板中进行慢病毒载体转导。
  4. 向每孔细胞中加入慢病毒载体：每细胞加入20个转导单位，以实现约30%的转导效率。然而，应根据实验需求通过实验确定慢病毒载体的最佳用量。
    注意：确保按照机构规定处理废弃的慢病毒载体。
  5. 将细胞放回组织培养孵箱中培养6小时。之后，按照第5节所述方法更换培养基。
    注意：上清液中含有活病毒，应按照机构规定进行处置。
  6. 转导后2天或更长时间，通过流式细胞术分析细胞（例如检测GFP表达）。详见第8节。
  7. 按照第5节所述方法，每2天更换一次培养基，直至达到实验终点。

8. 造血干细胞和祖细胞培养物的流式细胞术分析

  1. 制备浓缩的培养物 离体 含2% FBS的PBS中的HSC抗体混合液（表 4). 将混合物置于 4 °C 避光保存，可保存长达 1 个月。
    注意：使用染料偶联抗体时，应在关闭光源的组织培养罩内操作。
  2. 向50 µL细胞中加入2 µL浓缩抗体混合液。在4 °C避光孵育30分钟。同时，制备用于补偿和设门的适当染色对照样本。
  3. 加入 200–1,000 µL 含 2% FBS 的 PBS，于 450 × g 4 °C下离心5分钟。尽可能吸除上清液，加入含2% FBS和0.5 µg/mL PI的PBS溶液100–500 µL重悬细胞。
  4. 设置流式细胞仪，每份样品至少记录 10,000 个活细胞。
    注意：流式细胞仪应由受过培训的科研人员操作。如果用户缺乏流式细胞术经验，必须联系当地的FACS设施以咨询本项分析。
  5. 以FCS格式导出数据，并使用适当的流式细胞术分析软件进行数据分析。参见 图2 此处所用的标准门控策略。

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结果

对于造血干细胞（HSC）的FACS纯化，我们预期在c-Kit富集的骨髓中，约0.2%的细胞为CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage-群体，该比例适用于年轻的（8–12周龄）C57BL/6小鼠（图1）。然而，转基因小鼠或不同年龄的小鼠其造血干细胞频率可能存在差异。培养4周后，我们预期CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-细胞比例约为10%（图2）。无论细胞培养起始于c-Kit富集的骨髓还是FACS纯化的造血干细胞，结果均相似。在使用表达GFP的慢病毒载体（每细胞20个转导单位）进行转导后，我们预期约有30%的细胞为GFP+（图3）。

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讨论

我们希望本实验方案为研究造血干细胞生物学、造血过程以及更广泛的血液学领域提供一种有效的方法。自从基于PVA的培养方法最初开发用于FACS纯化的造血干细胞以来8该方法已被进一步拓展。例如，已证明该方法适用于经骨髓富集的c-Kit以及表面带负电荷的培养板14其与转导和电穿孔的兼容性也已得到证实14,15。该 体内 HSC 和 c-Kit 的验证+ HSPC 培养可在这些出版物中找到，而读者可参考其他已发表的实验方案以获取更多信息 体内 移植方案21我们未观察到移植后新鲜与培养的HSPC在谱系嵌合性方面存在显著差异，然而，单个HSC在培养后的重建潜能 离体 扩增的详细机制仍有待阐明。通过该方法产生的大量造血干细胞（HSCs）为利用需要大量细胞的分子或生化检测手段来研究HSCs提供了新的途径。此外，若能在这些培养...

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致谢

感谢WIMM流式细胞术核心实验室提供的流式细胞术使用权限，以及WIMM病毒筛查核心实验室在慢病毒载体构建方面的支持。本工作由Kay Kendall白血病基金和英国医学研究理事会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器
解剖工具包Fisher Scientific12764416
血细胞计数板Appleton Woods LtdHC002
P3 原代细胞 4D-核转染 X 试剂盒Lonza V4XP-3024
研钵和研杵Scientific Laboratory Supplies LimitedX18000
QuadroMACS 分离器Miltenyi Biotec130-090-976
材料
5 mL 注射器VWR International Ltd720-2519
19 G 针头VWR International Ltd613-5394
50 μm 细胞筛Sysmex04-004-2317
70 μm 细胞筛Corning431751
Kimtech 擦拭纸VWR International Ltd115-2075
LS MACS 柱Miltenyi Biotec130-042-401
试剂
Alt-R S.p. Cas9 核酸酶 V3，100 μgIDT 1081058
无动物成分重组小鼠干细胞因子 PeprotechAF-250-03
无动物成分重组小鼠血小板生成素PeprotechAF-315-14
抗小鼠 CD117 APC（克隆：2B8）ThermoFisher17-1171-83
抗小鼠 CD117 BV421（克隆：2B8）Biolegend105828
抗小鼠 CD127 APC/Cy7（克隆：A7R34）Biolegend135040
抗小鼠 CD127 生物素（克隆：A7R34）Biolegend135006
抗小鼠 CD150 PE/Cy7（克隆：TC15-12F12.2）Biolegend115914
抗小鼠 CD201 APC（克隆：eBio1560）ThermoFisher17-2012-82
抗小鼠 CD34 FITC（克隆：RAM34）ThermoFisher11-0341-85
抗小鼠 CD4 APC/Cy7（克隆：RM4-5）Biolegend100526
抗小鼠 CD4 生物素（克隆：RM4-5）Biolegend100508
抗小鼠 CD45R APC/Cy7（克隆：RA3-6B2）Biolegend103224
抗小鼠 CD45R 生物素（克隆：RA3-6B2）Biolegend103204
抗小鼠 CD48 BV421（克隆：HM48-1）Biolegend103428
抗小鼠 CD8 生物素（克隆：53-6.7）Biolegend100704
抗小鼠 CD8a APC/Cy7（克隆：53-6.7）Biolegend100714
抗小鼠 Ly6G/Ly6C APC/Cy7（克隆：RB6-8C5）Biolegend108424
抗小鼠 Ly6G/Ly6C 生物素（克隆：RB6-8C5）Biolegend108404
抗小鼠 Sca1 PE（克隆：D7）Biolegend108108
抗小鼠 Ter119 APC/Cy7（克隆：TER-119）Biolegend116223
抗小鼠 Ter119 生物素（克隆：TER-119）Biolegend116204
CellBIND 培养板，24 孔Corning3337负表面电荷
CellBIND 培养板，96 孔 Corning3330负表面电荷
定制合成 sgRNA Synthego, Sigma Aldrich, IDT定制订购
胎牛血清Merck Life Science UK LimitedF7524-50ML
纤维连接蛋白包被板，96 孔BD Biosciences354409
Ham's F-12 营养混合物Gibco11765054
胰岛素-转铁蛋白-硒-X（100 倍浓缩液）Gibco51500.056
磷酸盐缓冲液Alfa AesarJ61196.AP
聚乙烯醇Sigma AldrichP8136
碘化丙啶Enzo Life Sciences (UK) LtdEXB-0018
链霉亲和素 APC/Cy7Biolegend405208
Türks’ 溶液Sigma Aldrich109277
VirkonMettler-Toledo Ltd95015662

参考文献

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