本文介绍了一种用于启动、维持和分析小鼠造血干细胞培养的实验方案 离体 基于聚乙烯醇的扩增，以及通过慢病毒转导和电穿孔对其进行遗传操作的方法。
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方法文章
离体 基于聚乙烯醇培养体系的小鼠造血干细胞扩增与遗传操作
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
自我更新 多能的 造血干细胞（HSCs）是一类重要的细胞类型，因其能够在整个生命周期中维持造血功能，并在移植后重建完整的血液系统。HSCs 已被临床应用于干细胞移植治疗，该疗法是多种血液系统疾病的根治性手段。目前，人们高度关注对调控 HSC 活性及造血过程的机制研究，以及新型 HSC 相关疗法的开发。然而，HSCs 的稳定培养与扩增仍面临挑战。 离体 一直是研究这些易于处理的干细胞的主要障碍 离体 系统。我们近期开发了一种基于聚乙烯醇的培养系统，可支持可移植小鼠造血干细胞的长期、大规模扩增，并实现了对其进行基因编辑的方法。本实验方案描述了培养和基因操控小鼠造血干细胞的技术方法 通过 电穿孔和慢病毒转导。本方案预期对广泛从事造血干细胞生物学及造血过程研究的实验血液学研究人员具有实用价值。
引言
造血系统通过特化的血细胞和免疫细胞类型，支持哺乳动物体内多种基本生理过程，从氧气输送至抵御病原体。持续的血液生成（即造血作用）对于维持血液系统的稳态至关重要，这一过程由造血干细胞和祖细胞（HSPCs）1所维持。其中最原始的造血细胞是造血干细胞（HSC），具有自我更新和多谱系分化的能力2,3。HSC是一类稀有细胞群体，主要存在于成年个体的骨髓中4，其频率约为每30,000个细胞中仅有一个。HSC被认为能够支持终生的造血功能，并在遭受血液系统应激后帮助重建造血功能。这些特性还使得HSC在移植到经辐照处理的受体体内后，能够稳定地重建整个造血系统5。这构成了HSC的功能性定义，也是HSC移植疗法的科学基础——该疗法是多种血液系统和免疫系统疾病的根治性治疗手段6。正因如此，HSC成为实验血液学研究的主要焦点。
尽管研究投入巨大，但稳定扩增造血干细胞（HSCs）仍然具有挑战性 离体7我们最近开发了首个长期 离体 小鼠造血干细胞扩增培养系统8该方法可在4周....
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方案
所有动物实验操作，包括繁育和安乐死，均须在机构和国家规定的指南范围内进行。下述实验已获得英国政府内政部的批准。有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和设备的列表，请参见材料表。
1. 储备液的配制
- PVA 储存液
- 取 50 mL 细胞培养级水置于适合高压灭菌的小玻璃瓶中。用微波炉将水加热至接近沸腾。
- 称取 5 g PVA 粉末加入水中。
注意：建议仅溶解 1–5 g PVA。溶解量过大可能导致复溶不完全。 - 盖紧瓶盖并振荡混匀，随后略微松开瓶盖。
注意：重新打开时需小心，因水温变化可能导致瓶内压力改变。 - 高压灭菌后冷却至室温。盖紧瓶盖并振荡混匀。分装至无菌离心管中，4 °C 可保存长达 3 个月。
- 将冻干的细胞因子溶解于含 1 mg/mL PVA 的 F-12 培养基中。将干细胞因子复溶至 10 µg/mL，血小板生成素复溶至 100 µg/mL，配制成 1:1,000 的储存液。分装至无菌离心管中，长期保存于 -80 °C。也可在 4 °C 保存最多 1 周。
注意：由于对小鼠 HSC 扩增具有负面影响，应避免使用牛血清白蛋白复溶细胞因子。
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结果
对于造血干细胞（HSC）的FACS纯化，我们预期在c-Kit富集的骨髓中，约0.2%的细胞为CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage-群体，该比例适用于年轻的（8–12周龄）C57BL/6小鼠（图1）。然而，转基因小鼠或不同年龄的小鼠其造血干细胞频率可能存在差异。培养4周后，我们预期CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage-细胞比例约为10%（图2）。无论细胞培养起始于c-Kit富集的骨髓还是FACS纯化的造血干细胞，结果均相似。在使用表达GFP的慢病毒载体（每细胞20个转导单位）进行转导后，我们预期约有30%的细胞为GFP+（图3）。
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讨论
我们希望本实验方案为研究造血干细胞生物学、造血过程以及更广泛的血液学领域提供一种有效的方法。自从基于PVA的培养方法最初开发用于FACS纯化的造血干细胞以来8该方法已被进一步拓展。例如，已证明该方法适用于经骨髓富集的c-Kit以及表面带负电荷的培养板14其与转导和电穿孔的兼容性也已得到证实14,15。该 体内 HSC 和 c-Kit 的验证+ HSPC 培养可在这些出版物中找到，而读者可参考其他已发表的实验方案以获取更多信息 体内 移植方案21我们未观察到移植后新鲜与培养的HSPC在谱系嵌合性方面存在显著差异，然而，单个HSC在培养后的重建潜能 离体 扩增的详细机制仍有待阐明。通过该方法产生的大量造血干细胞（HSCs）为利用需要大量细胞的分子或生化检测手段来研究HSCs提供了新的途径。此外，若能在这些培养.......
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致谢
感谢WIMM流式细胞术核心实验室提供的流式细胞术使用权限，以及WIMM病毒筛查核心实验室在慢病毒载体构建方面的支持。本工作由Kay Kendall白血病基金和英国医学研究理事会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器 | |||
| 解剖工具包 | Fisher Scientific | 12764416 | |
| 血细胞计数板 | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 原代细胞 4D-核转染 X 试剂盒 | Lonza | V4XP-3024 | |
| 研钵和研杵 | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS 分离器 | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| 材料 | |||
| 5 mL 注射器 | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G 针头 | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm 细胞筛 | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm 细胞筛 | Corning | 431751 | |
| Kimtech 擦拭纸 | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 试剂 | |||
| Alt-R S.p. Cas9 核酸酶 V3，100 μg | IDT | 1081058 | |
| 无动物成分重组小鼠干细胞因子 | Peprotech | AF-250-03 | |
| 无动物成分重组小鼠血小板生成素 | Peprotech | AF-315-14 | |
| 抗小鼠 CD117 APC（克隆：2B8） | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| 抗小鼠 CD117 BV421（克隆：2B8） | Biolegend | 105828 | |
| 抗小鼠 CD127 APC/Cy7（克隆：A7R34） | Biolegend | 135040 | |
| 抗小鼠 CD127 生物素（克隆：A7R34） | Biolegend | 135006 | |
| 抗小鼠 CD150 PE/Cy7（克隆：TC15-12F12.2） | Biolegend | 115914 | |
| 抗小鼠 CD201 APC（克隆：eBio1560） | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| 抗小鼠 CD34 FITC（克隆：RAM34） | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| 抗小鼠 CD4 APC/Cy7（克隆：RM4-5） | Biolegend | 100526 | |
| 抗小鼠 CD4 生物素（克隆：RM4-5） | Biolegend | 100508 | |
| 抗小鼠 CD45R APC/Cy7（克隆：RA3-6B2） | Biolegend | 103224 | |
| 抗小鼠 CD45R 生物素（克隆：RA3-6B2） | Biolegend | 103204 | |
| 抗小鼠 CD48 BV421（克隆：HM48-1） | Biolegend | 103428 | |
| 抗小鼠 CD8 生物素（克隆：53-6.7） | Biolegend | 100704 | |
| 抗小鼠 CD8a APC/Cy7（克隆：53-6.7） | Biolegend | 100714 | |
| 抗小鼠 Ly6G/Ly6C APC/Cy7（克隆：RB6-8C5） | Biolegend | 108424 | |
| 抗小鼠 Ly6G/Ly6C 生物素（克隆：RB6-8C5） | Biolegend | 108404 | |
| 抗小鼠 Sca1 PE（克隆：D7） | Biolegend | 108108 | |
| 抗小鼠 Ter119 APC/Cy7（克隆：TER-119） | Biolegend | 116223 | |
| 抗小鼠 Ter119 生物素（克隆：TER-119） | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND 培养板，24 孔 | Corning | 3337 | 负表面电荷 |
| CellBIND 培养板，96 孔 | Corning | 3330 | 负表面电荷 |
| 定制合成 sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | 定制订购 | |
| 胎牛血清 | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| 纤维连接蛋白包被板，96 孔 | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 营养混合物 | Gibco | 11765054 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒-X（100 倍浓缩液） | Gibco | 51500.056 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| 聚乙烯醇 | Sigma Aldrich | P8136 | |
| 碘化丙啶 | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| 链霉亲和素 APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ 溶液 | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
参考文献
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
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