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从速冻肝组织中分离细胞核用于单细胞多组学分析

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DOI：

10.3791/64792

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2022年12月9日

 ,  ,  , 
1Helmholtz Pioneer Campus (HPC), Helmholtz Munich, 2Institute of Computational Biology, Computational Health Department, Helmholtz Munich, 3Division of Infectious Diseases and Tropical Medicine, Ludwig-Maximillian-Universität Klinikum, 4TUM School of Medicine, Technical University of Munich

本文内容

摘要

本文介绍一种从速冻保存的存档肝组织中分离细胞核的方案，用于单细胞核RNA测序（RNA-seq）、ATAC-seq以及联合多组学分析（RNA-seq和ATAC-seq）。

摘要

肝脏是一种结构复杂且具有异质性的组织，负责执行多种关键的生理功能，例如维持能量稳态以及外源性物质的代谢等。这些功能的实现依赖于肝实质细胞与非实质细胞之间的紧密协调。此外，多种代谢活动局限于肝小叶的特定区域，这一现象称为肝脏分区（liver zonation）。近年来，单细胞测序技术的进步使研究人员能够在单细胞分辨率下深入探究组织的异质性。然而，在包括肝脏在内的许多复杂组织中，剧烈的酶解和/或机械解离方案可能对单细胞悬液的活力或质量产生不利影响，从而限制了对肝脏在健康与疾病状态下全面表征的能力。

本文介绍了一种从冷冻保存的肝脏组织中分离细胞核的稳定且可重复的实验方案。该方法能够获得高质量的细胞核，适用于多种下游单细胞组学分析技术，包括单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA-seq）、基于高通量测序的转座酶可及染色质分析（ATAC-seq），以及多组学联合分析（联合RNA-seq和ATAC-seq）。该方法已成功应用于健康和病变的人类、小鼠及非人灵长类动物冷冻肝脏样本的细胞核分离。该技术可无偏倚地分离肝脏中所有主要细胞类型，因此为在单细胞分辨率下研究肝脏提供了可靠的实验方法。

引言

单细胞基因组学正迅速成为研究肝脏功能以及评估细胞异质性在健康与疾病状态下影响的关键方法1快速的发展 "多组学" 通过对不同层次信息的同步测量以及稳健计算流程的并行扩展，为发现正常及病变肝脏中此前未知的细胞类型和亚型铺平了道路2.

探索生物样本库和存档的冷冻样本的可能性显著增加了重新研究和发现非实质细胞3,4,5的作用，以及研究多倍体肝细胞在衰老和慢性疾病中作用的机会6,7,8,9。因此，本文描述了一种适用于存档的速冻（FF）肝脏组织的稳定且可重复的单细胞核分离方案，该方案可兼容下游的单细胞核RNA测序和ATAC测序，以及多组学分析（联合RNA-seq与ATAC-seq）（图1）。

该实验流程可用于研究肝脏中所有细胞类型的转录组和染色质可及性，且不受细胞大小或脆弱性的限制，无需依赖酶解离解协议。该方法可使用珍贵的人体样本或转基因小鼠的少量组织（15–30 mg 或 5–10 mm3）进行。通过定量分析核大小来评估细胞核分离的高纯度，核大小可能与细胞体积增大及细胞衰老相关10,11，而该纯度对于肝细胞倍性12以及依赖细胞大小的转录调控机制分析至关重要11,13,14,15。此外，从冷冻肝脏中分离的细胞核仍保留有关肝脏分区结构的重要信息。该实验流程与组织采集方法支持对同一组织及同一受试个体进行单细胞基因组学数据验证，或进一步开展免疫组织化学、空间转录组学等互补性分析。因此，该方法可系统、可靠地应用于多种肝脏疾病状态及模式生物的研究。

方案

所有动物实验均依照德国动物福利法规及上巴伐利亚州政府的规定进行。动物饲养已根据 §德国动物福利法第11条以及欧盟指令2010/63/EU

1. 组织准备

  1. 通过颈椎脱位法处死一只3个月至22个月大的雄性C57BL/6J小鼠。将动物置于解剖板上，用针固定四肢，并用70%乙醇对腹部进行消毒。
  2. 按照Treuting等人的建议进行剖检16。
    1. 切开腹部至肋骨区域，暴露肝脏，使用镊子小心取出肝脏，避免刺破肝小叶。
    2. 用镊子夹住膈肌，用剪刀剪断连接组织，完整取出肝脏。
  3. 用冷磷酸盐缓冲液（PBS）清洗器官，在干净的纸巾上轻轻吸干，并将肝小叶切割成若干部分用于不同用途：一部分用于单核分离和多组学分析（FF）；一部分用10%多聚甲醛（PFA）固定后进行石蜡包埋；以及/或用最佳切割温度（OCT）包埋剂包埋，用于后续组织学分析（图1A）。
  4. 将肝组织分装至冻存管或5 mL螺口管中，立即在液氮中速冻。将冷冻的肝样本储存在−80 °C，用于后续单核多组学实验（图1B、C）。
    ​注意：冷冻保存的组织可在−80 °C安全储存数年，使用前应始终在−80 °C干冰条件下运输。

2. 细胞核分离

  1. 工作台清洁及缓冲液与耗材的准备
    1. 使用70%乙醇和RNase去污染溶液清洁工作台面和移液器，或使用专用的无RNase污染的台面和材料。
    2. 将摆动转子离心机和固定角转子离心机、1.5 mL/2 mL离心管以及多孔板预冷至4 °C，具体操作如下。
    3. 将用于组织处理的无RNase一次性镊子、一次性无菌手术刀和培养皿置于干冰（−60 °C）上预冷。
    4. 将Dounce玻璃匀浆器及研杵置于冰上（4 °C）预冷。将每个研杵（A 和 B）分别放入5 mL离心管中，避免其直接接触冰面而可能引入RNase污染。
    5. 配制碘克沙醇介质（IDM）稀释液（表1A），并用其将60%碘克沙醇储备液分别稀释为50%和29%的溶液，用于密度梯度离心（分别为 表1B 和 表1C）。
    6. 将所有离心管预冷。对每个待处理的样本，准备以下离心管：
      1. 准备三个1.5 mL低DNA吸附离心管（一个用于过滤后的组织匀浆液，第二个管中加入250 µL 50%碘克沙醇溶液稀释液，第三个用于盛放纯净的细胞核悬液）。
      2. 准备一个2 mL圆底离心管，加入500 µL 29%碘克沙醇溶液稀释液，用于密度梯度分离。
      3. 准备一个15 mL锥形离心管，用于盛放细胞核分离介质-2（NIM-2）和匀浆缓冲液（HB）。
    7. 配制细胞核分离介质-1（NIM-1）（表1D），并用其配制NIM-2（表1E），再进一步配制HB（表1F）。按照以下实验步骤所述，在使用前立即加入两种RNase抑制剂。
    8. 按照 表1G 所述配制细胞核保存缓冲液（NSB）。在使用前加入重组RNase抑制剂。若需进行FACS分选，可在NSB中额外加入基于蛋白质的RNase抑制剂（可选）。
    9. 准备一个500 mL烧杯，装入无菌水，用于组织匀浆后清洗Dounce匀浆器和研杵，以实现最佳清洁和维护效果。
  2. 组织匀浆
    1. 在干冰上的培养皿内，使用预冷的手术刀切取一块20–30 mg（或5 mm3） 的组织。随后立即将培养皿转移至湿冰（4 °C）上。加入1 mL HB缓冲液，并使用冷的手术刀尽可能将组织切碎，使其能够被1 mL宽口枪头轻松吸取。
      注意：所有组织或细胞核的转移操作均应使用宽口枪头。作为替代方案，也可使用无菌手术刀在无菌塑料盖上将1 mL枪头末端剪开，以形成宽口（图2A）。
    2. 收集组织悬液，并转移至预冷的2 mL玻璃Dounce匀浆器中（图2B）。
    3. 用额外0.5–1 mL HB缓冲液冲洗培养皿，收集所有残留的组织碎片，全程保持低温操作。
    4. 在冰上缓慢而小心地使用松配合研杵 A 进行5次匀浆操作。拉动研杵上下运动时，采用旋转动作以避免产生气泡。确保每次操作中研杵均从匀浆器顶部到底部完整移动。
    5. 随后，在冰上使用紧配合研杵 B 缓慢进行10–15次匀浆操作，避免产生气泡。
      注意：建议在使用研杵 B 进行10次操作后，在显微镜下观察细胞核形态，以判断是否需要继续匀浆。可通过台盼蓝染色（台盼蓝与样本按1:1比例混合）和手动血细胞计数板进行观察（例如，将10 μL台盼蓝与10 μL细胞核悬液混合，取10 μL混合液在显微镜下观察；图2C）。
    6. 将匀浆液通过50 µm细胞滤网过滤，同时转移至预冷的1.5 mL离心管中。对于含有大量结缔组织团块的匀浆液，可使用多个滤网和/或离心管。
    7. 用额外0.5–1 mL HB缓冲液冲洗匀浆器和滤网，以充分回收所有组织匀浆液。随后进行密度梯度离心。
  3. 密度梯度离心
    1. 将过滤后的匀浆液在预冷的固定角转子离心机中，于4 °C、1,000 × g 离心8分钟。
    2. 在样品离心过程中，准备一个含250 µL 50%碘克沙醇稀释液的1.5 mL离心管，以及一个含500 µL 29%碘克沙醇稀释液的2 mL离心管。两管均需保持在冰上。
    3. 离心结束后，使用真空泵小心吸除上清液，避免扰动沉淀。
      注意：若采用手动移液，将影响最终细胞核悬液的质量。
    4. 使用1 mL宽口枪头向沉淀中加入250 µL HB缓冲液，并缓慢充分重悬。
    5. 将250 µL细胞核悬液转移至预冷的1.5 mL离心管中（该管已含250 µL 50%碘克沙醇稀释液），轻轻但充分混匀，形成25%碘克沙醇/细胞核悬液。
    6. 将500 µL 25%碘克沙醇/细胞核悬液转移至预冷的2 mL离心管中（该管已含500 µL 29%碘克沙醇稀释液）。
      注意：应将500 µL 25%碘克沙醇/细胞核悬液轻柔地加至500 µL 29%碘克沙醇溶液的上层，使25%与29%碘克沙醇溶液之间形成清晰的相界面。建议将枪头沿管壁以45°角加入，以形成梯度界面。此后操作中必须轻柔处理离心管，避免破坏该梯度。
    7. 将离心管置于预冷的摆动转子离心机中，于12,500 g 离心20分钟，离心机刹车设置为关闭。
    8. 在离心即将结束前，若后续将进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）流程，请向NSB缓冲液中加入RNase抑制剂（见 表1G）。
    9. 离心结束后，使用真空泵小心吸除上清液，避免扰动沉淀。
      注意：若采用手动移液，将影响最终细胞核悬液的质量。
    10. 使用1 mL宽口枪头，将沉淀轻柔地重悬于100–300 µL NSB缓冲液中，并将细胞核悬液转移至洁净的预冷1.5 mL离心管中。
    11. 使用台盼蓝溶液（台盼蓝与样本按1:1比例混合）和手动血细胞计数板对细胞核进行计数（例如，将10 μL台盼蓝与10 μL细胞核悬液混合，取10 μL混合液用于计数；图2D）。
    12. 获得的细胞核悬液应立即用于单细胞核基因组学检测。
      ​注意：在NSB缓冲液中的细胞核悬液可在4 °C冷藏保存最多1周，适用于后续流式细胞术和/或成像流式细胞术分析，但不适用于snRNA-seq或snATAC-seq。

3. 用于肝细胞倍性分析或基于孔板的测序方法的细胞核分选

  1. 对于基于流式细胞术的细胞分选，将细胞核悬液通过50 µm滤膜过滤至预冷的5 mL流式分选管中。
  2. 使用配备100 μm喷嘴的流式细胞分选仪。将流式分选管装载到分选仪上，并预览样品。
  3. 设置细胞核分选的门控策略：首先绘制前向散射面积与侧向散射面积的关系图（FSC-A/SSC-A）进行散射门控，随后绘制Hoechst-Height与Hoechst-Area的关系图（细胞核门），再绘制Hoechst-Width与Hoechst-Area的关系图（单细胞核门）。在Hoechst-Area直方图上观察细胞核倍性分布。
    注意：为获得更佳的峰分辨率，建议将Hoechst通道（450/50）以线性尺度显示（图3A）。
  4. 若需将样品分选至96孔或384孔板中，应设置液滴延迟时间，并参照先前方法6，使用联苯胺底物-辣根过氧化物酶（TMB-HRP）比色法优化板位置对齐。
  5. 将样品冷却装置和板架均设置为4 °C冷藏，同时开启样品旋转，转速设为300 rpm。
  6. 以约1 × 105 个细胞核/mL的样品浓度进行单细胞核分选，流速控制在200–500 事件/秒。

4. 通过成像细胞术对核参数进行可视化检查与定量（可选）

  1. 取一个含有 50 µL 细胞核悬液的 0.5 mL 离心管，细胞核浓度为 2 × 107 个/mL。
  2. 根据长宽比与 Hoechst 荧光通道设置所有事件门控，以观察细胞核的倍性分布（图 3B）。
  3. 使用明场（BF）和 Hoechst 荧光通道，以 40 倍放大倍数采集样本图像。
  4. 利用明场测量结果和 Hoechst 荧光强度，通过成像流式细胞术软件对 2n 和 4n 细胞核进行观察和定量分析（图 3C）。

5. 单核RNA测序、ATAC测序或多重组学文库构建与测序

  1. 对于基于液滴的单核RNA测序（snRNA-seq）方法，将纯化的细胞核悬液直接上样至微流控装置中，进行自动化的并行分隔和分子条形码标记17。
  2. 在单细胞分隔装置中完成微流控运行后，收集凝胶珠包埋的细胞核，并按照制造商指南中所述进行孵育和清洗17。
  3. 对cDNA预扩增进行11个聚合酶链式反应（PCR）循环，程序如下：98 °C 3分钟，(98 °C 15秒，63 °C 20秒，72 °C 1分钟) × 11个循环，72 °C 1分钟，然后在4 °C保存。随后按照制造商说明进行末端修复和A尾添加以及接头连接17。对于后续的最终基因表达文库构建，进行10个PCR循环，程序如下：98 °C 45秒，(98 °C 20秒，54 °C 30秒，72 °C 20秒) × 10个循环，72 °C 1分钟，然后在4 °C保存。
  4. 对所获得的文库进行测序，每个细胞核的平均测序深度约为20,000–50,000条读段。
  5. 对于联合多组学（RNA + ATAC）基于液滴的测序，将肝细胞核在裂解缓冲液中孵育5分钟，然后进行1小时的片段化标签标记（tagmentation），具体步骤如前所述18。
  6. 将完成标签标记的细胞核直接上样至微流控装置中，进行自动化的并行分隔和分子条形码标记。
  7. 微流控运行完成后，收集凝胶珠包埋的细胞核，并按照制造商说明进行孵育和清洗18。
  8. 对cDNA预扩增步骤进行6个PCR循环，程序如下：72 °C 5分钟，98 °C 3分钟，(98 °C 20秒，63 °C 30秒，72 °C 1分钟) × 6个循环，72 °C 1分钟，然后在4 °C保存。
  9. 取35 µL预扩增样品，进行cDNA扩增，程序如下：98 °C 3分钟，(98 °C 15秒，63 °C 20秒，72 °C 1分钟) × 6个循环，72 °C 1分钟，然后在4 °C保存。随后按照制造商说明进行末端修复和A尾添加以及接头连接18。对于后续的最终样本索引PCR，进行15个PCR循环，程序如下：98 °C 45秒，(98 °C 20秒，54 °C 30秒，72 °C 20秒) × 15个循环，72 °C 1分钟，然后在4 °C保存。
  10. 对于ATAC文库的构建，使用40 µL样品，对样本索引进行6个PCR循环扩增，程序如下：98 °C 45秒，(98 °C 20秒，67 °C 30秒，72 °C 20秒) × 6个循环，72 °C 1分钟，然后在4 °C保存。
  11. 对所获得的多组学基因表达文库进行测序，每个细胞核的最小测序深度为20,000对读段；对多组学ATAC文库进行测序，每个细胞的最小测序深度为25,000对读段，具体建议参见制造商说明18。

结果

该工作流程专为单细胞核多组学分析设计，适用于冷冻肝脏样本的单细胞核分离，主要包含三个核心步骤：i) 用于细胞异质性与组织结构平行分析的样本采集；ii) 单细胞核悬液制备；iii) 单细胞核多组学分析。图 1)。提取的肝脏从安乐死小鼠中解剖出来，并切成小块用于组织学检查，可进行石蜡包埋、冷冻切片或两者兼施。其余切块立即在液氮中速冻，用于后续单细胞核分离以进行多组学分析。该组织收集系统使用户能够进一步在同一只个体的组织切片上验证单细胞核组学数据，从而在需要时通过空间转录组学或免疫组织化学分析补充数据集。

采用本文所述方法对冷冻肝脏提取的细胞核进行显微观察表明，密度梯度离心步骤极大地促进了多余细胞和组织碎片的去除。图 2C,D此外，该方法能保留所有倍性水平，可通过流式细胞术分析进行验证和定量。图 3).

为进一步验证该方案的性能，我们对未分选及经FACS分选的细胞核进行了基于液滴的单核RNA测序（snRNA-seq），并遵循Seurat流程分析数据。简言之，提取的单核按照先前描述的方法制备，用于基于液滴的snRNA-seq。19对于 2n 和 4n 或更高倍性细胞核的 snRNA-seq，cDNA 扩增步骤使用 11 个循环，最终基因表达文库构建使用 10 个循环。所得文库的测序深度约为每个细胞核平均 25,000-39,000 条读数。获得的单细胞核读数比对至 GRCm39/mm39 小鼠基因组。运行预处理流程时，命令 --包含内含子 添加该步骤是为了确认并量化细胞核中存在的未剪接信使RNA（mRNA）。 EmptyDrops 比对器内嵌的算法过滤并移除了空液滴。

使用R软件包Seurat（版本4.1.1）计算质量控制（QC）指标，所用数据为单核RNA测序分析流程输出的唯一分子标识符（UMI）计数矩阵。移除了特征（基因）数少于100且细胞数少于10的计数。根据设定的QC阈值对细胞核进行过滤：最小基因数 = 200，最大基因数 = 8,000，线粒体基因占比 <1% 和核糖体组分 <2%。使用 Seurat 软件包中实现的方法，选取前 3,000 个高变基因进行主成分分析。将主成分分析所得的前 15 个主成分维度作为输入，进行基于图的聚类分析。为对细胞进行聚类，我们采用了模块化优化技术。鲁汶 算法）的分辨率参数设置为0.5。为了可视化和探索该数据集，我们运行了非线性降维，即均匀流形逼近与投影（UMAP）。每个簇的身份是基于已知的标记基因进行分配的。6,20,21.

图 4A 展示了使用该细胞核提取方法所获数据的高质量指标。UMAP 图呈现了所有细胞核的计数分布以及主要细胞类型，这些细胞类型仅凭细胞核转录组和相对较浅的测序深度（每个细胞平均约 25,000-40,000 条读长）即可被可靠地鉴定。图 4B该方法可用于研究肝脏特异性转录因子，例如 Hnf4a, Mlxipl, 以及 Ppara以及参与外源性物质代谢的下游靶基因（即 Cyp2e1 以及 Cyp2f2)(图 4C值得注意的是，提取的细胞核保留了关于肝脏分区的关键信息，这通过标志性基因（如中央静脉周围区域标志基因）的互补表达模式得以证实。 Cyp2e1 以及门静脉周围 Cyp2f2 (图 4C).

我们进一步评估了使用此方法提取的未分选细胞核与新型多组学检测技术的兼容性，该技术可在同一单细胞核中同时分析表观基因组景观（ATAC）和基因表达（RNA）。18我们优化了转座前的细胞核裂解孵育时间至5分钟。测序文库通过运行六个PCR循环进行cDNA预扩增来构建。从预扩增样本中，35 µ取 L 进行 15 个 PCR 循环的进一步扩增，以完成样本索引，构建基因表达文库。图中展示了 cDNA 峰图的代表性电泳图谱。 图 5A （上）为构建ATAC文库，取40 µ取 L 预扩增样本，进行额外六个 PCR 循环以完成样本索引，其 DNA 轨迹的代表性电泳图如下所示。 图5A （底部）。对所得基因表达文库（RNA）进行了测序，每个细胞核的平均测序深度为 44,600 条读长；ATAC 文库的测序深度为每个细胞核 43,500 条读长。图 5B).

与上述基于液滴的单模态测序方案类似，读段比对、序列比对、空滴去除及片段计数均遵循先前描述的标准指南进行，使用 GRCm39/mm39 参考基因组。18使用 Seurat 和 Signac 软件包22我们进行了 "加权最近邻" (WNN)分析用于两种模态（RNA + ATAC）的多重测量图 5C），这使我们能够识别并注释主要和次要的肝细胞类型，且不会因细胞大小或细胞核脆性而产生显著偏差。图 5D该分析流程，如Satija实验室所发表22,23，包含对两种检测方法独立进行的标准质控步骤——预处理与降维。为良好呈现RNA-seq与ATAC-seq模态的加权组合，绘制了WNN图并将其用于UMAP可视化、聚类分析以及基于先前已识别标志基因的注释。6,20,21与使用单一模态的检测方法类似，我们也检测了上游转录调控因子。Hnf4a, Ppara, Mlxipl) 以及肝脏分区特征基因 (Hamp, Cyp2e1，以及 Cyp2f2) (图 5E).

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图 1实验概述、工作流程与单细胞基因组学应用。 (A) 组织取样示意图：左侧为选取三个区域进行石蜡包埋和/或冷冻切片，中间为用于单细胞基因组学的速冻组织收集，右侧为代表性免疫组织化学与免疫荧光分析；比例尺 = 100 µm.B) 高质量单细胞核悬液制备的关键步骤。C) 细胞核悬液可加载至 10x chromium 芯片，或用于流式细胞分选及基于微孔板的方法。缩写：H&E = 苏木精-伊红；DAPI = 4'6-二脒基-2-苯基吲哚；FACS = 荧光激活细胞分选。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 2肝脏解剖与Dounce玻璃组织匀浆。 (A) 代表性3月龄C57BL6/J小鼠肝脏（左图）；用于单核分离的肝组织切片在手术刀切碎前（中图）与切碎后（右图）。比例尺 = 1 cm。B) 2 mL Dounce 玻璃匀浆器在匀浆操作前的示例图像 "松散" 研钵 A （左）与处理后 "紧密" 研钵 B （右）。使用血细胞计数板监测组织匀浆化过程C) 在梯度离心前（D) 梯度离心后。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 3荧光激活细胞分选与成像流式细胞术用于高通量细胞核表征。 (A) 单细胞核流式分选至微孔板的设门策略，用于探究不同倍性水平。基于前向散射面积与侧向散射面积的散点图设门以排除碎片；基于Hoechst-Height与Hoechst-Area的细胞核设门包含多个细胞核群体；基于Hoechst-Width与Hoechst-A的单体设门用于双联体鉴别；Hoechst-A直方图可呈现细胞核倍性分布谱。B) 所有事件（左）与单个事件（右）的代表性成像流式定量结果，显示二倍体与四倍体细胞核。C) 二倍体与四倍体细胞核的明场及Hoechst染色图像及其通过成像细胞术进行的定量分析。缩写：FACS = 荧光激活细胞分选；FSC-A = 前向散射面积；SSC-A = 侧向散射面积；Hoechst-H = Hoechst-高度；Hoechst-A = Hoechst-面积；Hoechst-W = Hoechst-宽度。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 4利用单核RNA测序深度解析肝细胞倍性。 (A) 小提琴图展示检测到的基因数量、计数、线粒体基因百分比及核糖体基因百分比。B) UMAP 展示通过 snRNA-seq 检测到的细胞类型（左），定量结果以细胞核百分比表示（右）。C) UMAP图展示了计数数量并指示了肝细胞特异性基因的表达。所有细胞核（顶行）、2n细胞核（中间行）和4n细胞核（底行）。缩写：snRNA-seq = 单核RNA测序；UMAP = 均匀流形逼近与投影；mitoc. = 线粒体基因；Ribos. = 核糖体基因。 请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-5
图 5冷冻保存的年轻肝脏样本多组学（联合RNA测序与ATAC测序）数据的质量控制与分析。 (A) 采用多组学流程后获得的代表性自动电泳图谱，显示cDNA合成与ATAC后的分子量产物。B) 小提琴图展示过滤前后ATAC-seq、RNA-seq的计数数量、线粒体基因百分比及核糖体基因百分比。C) UMAP 展示 RNA-seq（左）、ATAC-seq（中）以及联合模态——RNA-seq 与 ATAC-seq（右）的基因表达。D) 不同细胞类型以不同颜色标注，并显示指定的肝细胞特异性基因表达。E) 特征图显示指定基因在指定细胞类型中的簇特异性表达。缩写：ATAC-seq = 高通量测序转座酶可及染色质测定；Mid Hep = 中带肝细胞；Endo = 内皮细胞；PV Hep = 门静脉周围肝细胞；Non-z Hep = 非分区肝细胞；CV Hep = 中央静脉周围肝细胞；Kup & DC = 库普弗细胞 & 树突状细胞；SC = 星状细胞，Neu = 中性粒细胞；Chol = 胆管细胞；mitoc. = 线粒体基因；Ribos. = 核糖体基因。 请点击此处查看此图的放大版本。

试剂库存10 mL 15 毫升50 mL
(A) 碘克沙醇培养基 (IDM) 
250 mM 蔗糖1M12.5 mL
150 mM KCl2M3.75 毫升
30 mM MgCl21M1.5 mL
60 mM Tris 缓冲液 pH 8.01M3 毫升
超纯无核糖核酸酶水29.25 毫升
(B) 50% IDM
碘克沙醇60%12.5 毫升
IDM2.5 mL
(C) 29% IDM
碘克沙醇60%7.25 mL
IDM7.75 mL
(D) Nuclei Isolation Medium-1 (NIM-1)
250 mM 蔗糖1M12.5 毫升
25 mM KCl2M0.625 毫升
5 mM MgCl21M0.25 毫升
10 mM Tris 缓冲液 pH 8.01M0.5 mL
超纯无核糖核酸酶水36.125 毫升
(E) 细胞核分离培养基-2 (NIM-2) 
NIM-1 缓冲液9.99 毫升
二硫苏糖醇 (DTT)1 mM0.01 mL
蛋白酶抑制剂片剂（不含EDTA）11 片 
(F) 匀浆缓冲液
NIM-2 缓冲液9.697 毫升
重组RNase抑制剂40 U/µL0.1 毫升
基于蛋白质的RNA酶抑制剂（SUPERase•IN) 20 U/µL0.1 mL
0.1% Triton-X10%0.1 毫升
3 µg/mL Hoechst 3334210 mg/mL0.003 毫升
(G) 细胞核储存缓冲液 (NSB)
166.5 mM 蔗糖1M 1.665 毫升
5 mM MgCl21M 0.05 mL
10 mM Tris pH 8.01M 0.1 毫升
重组RNase抑制剂40 U/µJoVE 教育与科学内容专业翻译0.1 mL
基于蛋白质的 RNase 抑制剂 (SUPERase)•IN)20 U/µL0.1 毫升
超纯无核糖核酸酶水8.085 毫升
* 可选（仅用于流式细胞分选）

表1：溶液配方。 (A) 碘克沙醇培养基（IDM）的制备；B) 50% 碘克沙醇溶液稀释液；C) 29% 碘克沙醇溶液稀释液。D) 制备细胞核分离培养基-1 (NIM-1)。E) 制备细胞核分离培养基-2 (NIM-2)。F) 均质缓冲液（HB）的制备。G) 制备细胞核储存缓冲液（NSB）。

讨论

通过单细胞或单细胞核RNA测序（RNA-seq）解析肝脏的细胞组成，有助于深入理解肝脏疾病的发生与发展过程3,4,5,24。从肝脏中分离单细胞耗时较长，且需要采用剧烈的机械或酶解解离方法25,26,27。目前普遍认为，每种组织均需系统评估以确定最佳的组织解离方案，以及合适的保存方法，以捕获脆弱的细胞类型或细胞核28。根据组织来源、目标疾病、发育阶段或模式生物的不同，制备用于下游分析的单细胞核悬液可能比单细胞悬液更为合适。重要的是，在肝脏中，单细胞RNA测序（scRNA-seq）与单细胞核RNA测序（snRNA-seq）显示细胞核与细胞质mRNA之间具有高度相关性，表明这两种方法可提供互补的信息2,3,4,6,29。

本文提供了一种标准化、稳健且可重复的单细胞核分离方法，适用于小鼠及其他物种（包括人类和猕猴）的冷冻保存肝脏样本。该方法可用于普通饲料或高脂饮食（HFD）喂养的野生型小鼠，以及肝纤维化小鼠模型，并可结合基于孔板和基于液滴的单细胞核基因组学技术6。本方法基于Krishnaswami等最初为脑组织描述的方案30，并针对速冻肝脏样本进行了额外优化。适当的匀浆处理可有效释放组织中的大部分细胞核，同时不破坏核膜完整性。然而，过度匀浆可能损伤脆弱的细胞核，降低其整体质量。通常情况下，年轻和/或脂肪含量较高的肝脏仅需使用研杵A研磨5次，再使用研杵B研磨10次；而年老和/或纤维化程度较高的肝脏可能需要使用研杵B研磨15次，但不应超过此次数。因此，不建议超出此处所述的研磨次数。过度研磨可能影响单细胞核悬液的质量，并增加环境RNA的污染，进而导致在后续数据分析过程中需要进行额外的计算过滤步骤。

本文所述方案具有广泛适用性，可根据年轻（3个月）和年老（24个月）小鼠的不同肝脏状况进行调整。由于我们发现对于年老小鼠、高脂饮食（HFD）处理以及纤维化组织，需要更大体积的肝脏组织，因此可用于处理的组织量可能对起始生物材料较少的用户构成限制。然而，对于需立即进行基于液滴的基因组检测的样本，强烈建议采用梯度纯化法。如果需要将细胞核通过流式细胞分选（FACS）导入96孔或384孔板以进行基于孔板的检测，则可省略梯度纯化步骤。但若组织样本量充足，足以达到推荐的细胞核浓度（即约 ~1 × 105 个细胞核/mL）用于FACS分选，我们仍建议用户执行梯度纯化步骤。

肝细胞具有多倍体特性9，但肝细胞多倍体在正常生理功能和疾病中的作用尚不明确。越来越多的证据表明，多倍体可提供基因组变异性31，且已知多倍体水平随年龄增长而升高32,33。然而，单核四倍体肝细胞的富集在临床上也与人肝细胞癌（HCC）的不良预后相关34。类似地，肝细胞多倍体水平的变化也与年龄相关的慢性肝病（如非酒精性脂肪性肝病（NAFLD））有关35,36,37。多倍体是指基因组拷贝数超过两份的状态，可通过DNA染料（如Hoechst）染色基因组含量来检测38。在提取前加入Hoechst染料至HB中，可在分离过程中标记所有细胞核。这使得在流式细胞仪上使用紫外（350 nm）或紫光（450 nm）激光激发时，可根据DNA含量区分二倍体与多倍体细胞核。通过展示的设门策略，可在冷冻保存的归档肝脏样本中分析2n、4n、8n及更高水平的肝细胞多倍体，以更深入理解细胞异质性在组织功能中的作用1（图3A）。此外，可利用成像流式细胞术对细胞核形态（包括大小和体积）进行定量，以关联细胞核尺寸变化与总事件数或基因数量的变化，具体取决于多倍体水平（图3B、C）。

多模态组学测量技术使得能够同时研究基因组组织的多个层面。联合RNA与ATAC的多组学方法可探究上游调控因子与下游代谢相关基因，从而在单细胞分辨率下全面研究转录调控网络及与肝脏功能相关的染色质结构。此外，随着能够应对数据稀疏性问题的计算方法不断进步以及测序成本的降低，单细胞多组学正引领着对同一细胞中多种模态数据进行联合分析的新方向。本单细胞核分离方案适用于基因表达数据与染色质可及性数据的独立或联合分析。我们采用Stuart等人23建立的标准分析流程（Signac软件包）来展示数据质量，同时，多种现有且可选的计算方法也可便捷地用于后续分析23,39,40,41。

总体而言，单细胞核多组学技术通过采用本文所述的细胞核提取方案，仅需极少量起始样本材料即可对生物存档样本、小鼠、人类及非人灵长类动物的肝脏组织进行研究。这一宝贵工具将使肝脏生物学家能够在多种肝脏病理背景下同时探究基因表达与染色质可及性。此外，肝细胞倍性水平的差异及其在肝小叶内不同位置所导致的基因表达调控，可能揭示其在肝脏疾病中的作用。因此，我们预期对细胞异质性的研究将为肝细胞癌（HCC）和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）等疾病的精准医学发展和靶向干预提供新的机遇。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了亥姆霍兹先锋园区（M.S.、K.Y.、C.P.M.-J.）和计算生物学研究所（C. T.-L.）的支持。本研究还得到了日本医疗研究开发机构（AMED）基金编号JP20jm0610035（C.P.M.-J.）的支持。我们感谢亥姆霍兹慕尼黑中心基因组学核心设施（I. de la Rosa）和生物信息学核心设施（T. Walzthoeni）的支持，特别感谢Xavier Pastor提供的培训与指导。我们感谢A. Feuchtinger、U. Buchholz、J. Bushe以及亥姆霍兹慕尼黑中心病理学与组织分析核心设施的其他所有工作人员在技术和科学方面提供的支持，同时感谢J. Zorn、R. Erdelen、D. Würzinger、E-Streifen的工作人员以及实验动物服务核心设施成员持续提供的科学支持与讨论。我们衷心感谢TranslaTUM细胞分析核心设施（R. Mishra）以及Luminex（DiaSorin公司，P. Rein）的支持。我们感谢I. Deligiannis博士提供的技术支持。M. Hartman博士、A. Schröder博士以及A. Barden女士（亥姆霍兹先锋园区）在法律、管理和行政支持方面发挥了关键作用。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 吐温-20 - 5 mL伯乐（Bio-Rad）1662404
2100 生物分析仪安捷伦G2939BA
粘性PCR膜赛默飞世尔科技AB0558
生物分析仪高灵敏度DNA分析安捷伦5067-4626
C1000 Touch 梯度PCR仪伯乐（Bio-Rad）1851196
细胞分选仪用于荧光激活细胞分选（FACS）；例如 BD FACSAria 细胞分选仪。
Centrifuge 5430REppendorf5428000619使用预冷至4℃的 °C
铬控制器 & Next GEM 配件试剂盒10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Chip G 单细胞试剂盒10X Genomics1000127
Chromium Next GEM Chip J 单细胞试剂盒，16 次反应10X Genomics1000230
Chromium Next GEM 单细胞 3' 试剂盒 v3.1，4 次反应10X Genomics1000269
Chromium Next GEM 单细胞多组学 ATAC + 基因表达试剂盒，4个反应10X Genomics1000285
cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物Sigma Aldrich11873580001
二硫苏糖醇（DTT）1 M 溶液Sigma Aldrich646563配制1 mM的储备液，并以1 mM使用 µM 终浓度
DNA AWAY表面去污染剂赛默飞世尔科技10223471实验开始前擦拭台面和移液器
DNA LoBind 离心管，1.5 mL赛默飞世尔科技16628742
DNA LoBind 离心管，2.0 mL赛默飞世尔科技16638742
洗脱缓冲液（EB）- 250 mLQiagen19086
Eppendorf ThermoMixer C赛默飞世尔科技13527550
Eppendorf ThermoMixer C 配件：Smartblock赛默飞世尔科技13518470
乙醇，纯度99.8%（200度），分子生物学级 - 100 mL 赛默飞世尔科技10517694
过滤器 50 µm，无菌  SYSMEX PARTEC - CELLTRICS04-004-2327根据组织和细胞核的大小调整滤膜直径
甘油（丙三醇），50%（v/v） - 1 LRicca Chemical Company3290-32
硬壳型 384 孔 PCR 板，薄壁，带裙边，透明/白色Bio-RadHSP3905
赫伦兹·海因茨 ABS 止血钳赛默飞世尔科技1131884
Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物，水溶液（10 mg/mL）InvitrogenH3570光敏感的
成像流式细胞仪用于成像流式细胞术分析，例如 Luminex Amnis ImageStream
Invitrogen TE缓冲液 - 100 mL赛默飞世尔科技11568846
KCl (2 M)，无RN酶，100 mL赛默飞世尔科技AM9640G
MgCl₂2 (1 M)，100 mL赛默飞世尔科技AM9530G
MicroAmp 8孔管条，透明-300条赛默飞世尔科技10209104
MicroAmp 8孔管条，0.2 mL - 125条赛默飞世尔科技10733087
Mörser 2 mL DOUNCEWagner & Munz GmbH9651632使用前用 RNase Zap 处理并用 MilliQ 水冲洗
MyFuge 12 微型微量离心机 C1012Benchmark ScientificC1012或任何其他条带和离心管微型离心机
纽鲍尔血细胞计数板OMNILAB  LABORZENTRUM5435293在显微镜下观察并计数细胞核
无核酸酶水（非DEPC处理）赛默飞世尔科技AM9937
OptiPrep 密度梯度介质Sigma AldrichD1556
移液器吸头 RT LTS 1000 µL，宽视野Mettler Toledo30389218
雌蕊 "A" 2 mLWagner & Munz GmbH 9651621使用前用 RNase Zap 处理并用 MilliQ 水冲洗
雌蕊 "B" 2 mLWagner & Munz GmbH9651627使用前用 RNase Zap 处理并用 MilliQ 水冲洗
聚丙烯15 mL离心管赛默飞世尔科技10579691
聚苯乙烯培养皿，60 mm × 15 mm赛默飞世尔科技10634141
聚苯乙烯圆底5 mL FACS管赛默飞世尔科技10100151
RNase抑制剂Protector - 2,000 USigma Aldrich3335399001-20℃保存 °C，直至使用
基于蛋白质的RNase抑制剂SUPERase•在（20 U/μL赛默飞世尔科技AM2696保存于 -20 °C，直至使用
重组RNase抑制剂Clontech Takara2313B-20℃保存 °C，直至使用
无RNA酶的微量离心管 - 0.5 mL赛默飞世尔科技AM12450
RNaseZap RNase 去污染溶液赛默飞世尔科技AM9780实验开始前擦拭台面和移液器
SPRIselect - 60 mL贝克曼库尔特B23318分装并储存于4 °C
蔗糖，500 gSigma AldrichS0389-500G配制1 M的储备液
Swann-Morton 无菌一次性不锈钢手术刀赛默飞世尔科技11798343
Tris-HCl (1 M)，pH 8.0Invitrogen15568025
Triton X-100，98%，100 mL赛默飞世尔科技10671652配制10%的储存液，4℃保存 °避光并置于 C 条件下保存。
0.4% 台盼蓝溶液赛默飞世尔科技11538886
涡旋混合器VWR444-1372或任何其他类型的涡旋

参考文献

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