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方法文章

脱细胞软骨细胞外基质水凝胶的制备

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DOI：

10.3791/64797

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2023年7月21日

 ,  , 
1Department of Orthopedics Surgery, Tongde Hospital of Zhejiang Province

本文内容

摘要

本文介绍了一种制备脱细胞软骨细胞外基质（DC-ECM）水凝胶的新方法。DC-ECM水凝胶具有优异的生物相容性，可为细胞生长提供优越的微环境，因此可作为理想的细胞支架和生物递送系统。

摘要

脱细胞软骨细胞外基质（DC-ECM）水凝胶因其良好的生物相容性以及能够模拟天然组织特性，在组织工程与再生医学领域具有广阔的应用前景。本实验方案旨在制备高度模拟软骨组织天然细胞外基质（ECM）特性的DC-ECM水凝胶。该方法结合物理和化学破碎以及酶消化技术，有效去除细胞成分，同时最大限度保留ECM的结构与组成。随后利用化学交联剂对DC-ECM进行交联，形成稳定且具有生物活性的水凝胶。所获得的DC-ECM水凝胶具备优异的生物活性、空间结构和生物诱导功能，并具有低免疫原性。这些特性有助于促进细胞黏附、增殖、分化和迁移，为细胞生长提供优越的微环境。本方案可为组织工程领域的科研人员与临床医生提供重要参考。仿生水凝胶有望推动软骨修复与再生领域中高效组织工程技术的发展。

引言

软骨组织工程是一个快速发展的领域，旨在再生受损或病变的软骨组织1。该领域的一个关键挑战是开发能够支持软骨细胞（即负责产生软骨的细胞）生长和分化的仿生支架2。软骨组织的细胞外基质（ECM）在调控软骨细胞行为方面起着至关重要的作用。脱细胞化细胞外基质（DC-ECM）是一种适用于组织工程应用的有效支架3。

已开发出多种技术用于从软骨组织制备脱细胞细胞外基质（DC-ECM），包括化学法、酶解法和物理法。然而，这些方法常产生生物模拟性不足的细胞外基质水凝胶，限制了其在组织工程应用中的潜力4,5。因此，亟需一种更有效的方法来制备DC-ECM水凝胶。

该技术的开发具有重要意义，因为它为创建可支持组织再生与修复的仿生支架提供了一种新方法，从而推动组织工程领域的发展。此外，该技术可轻松地被改造用于从其他组织制备细胞外基质水凝胶，从而拓展其潜在应用范围。

在更广泛的研究文献中，人们日益关注将脱细胞化细胞外基质（DC-ECM）作为组织工程应用的支架材料6。大量研究已证实，DC-ECM水凝胶在促进多种组织（包括软骨组织7,8）中的细胞生长与分化方面具有显著效果。因此，建立一种能够高度模拟软骨组织天然细胞外基质特性的DC-ECM水凝胶制备方案，对该领域具有重要意义。

本文所述方案通过提供一种新型方法来制备DC-ECM水凝胶，以满足这一需求，该方法可有效模拟软骨组织的天然细胞外基质（ECM）。该方案包括对软骨组织进行脱细胞处理，分离所得细胞外基质，并通过将细胞外基质与生物相容性聚合物交联形成水凝胶。所获得的水凝胶在支持软骨细胞生长和分化方面已展现出良好的应用前景。

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方案

本研究经浙江省中德医院伦理委员会批准。

1. DC-ECM 水凝胶的制备

注意：本研究中，软骨取自12月龄巴马香猪的膝关节，避免采集骨组织。

  1. 取收集的软骨组织，用手术刀切成 1-2 mm3 大小的块状。
  2. 将 20 g 切碎的软骨放入 50 mL 离心管中，加入 20 mL 低渗 Tris-HCl 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0），完全浸没组织。将离心管置于 −80 °C 冰箱中冷冻 3 小时，随后放入 37 °C 烘箱中加热 3 小时。重复冻融过程六次。此步骤中无需更换低渗 Tris-HCl 缓冲液。
  3. 使用涡旋振荡器以 1,000 rpm 的速度振荡离心管 30 秒。将不锈钢筛网（孔径：~250 µm）置于新的 50 mL 离心管上。
  4. 将脱细胞软骨缓慢倾倒至不锈钢筛网上，用无菌 PBS 洗涤组织三次，并收集软骨。
  5. 加入 10 mL 胰蛋白酶溶液（PBS 中含 0.25% 胰蛋白酶），将离心管置于 37 °C 摇床上消化 24 小时。期间每 4 小时更换一次胰蛋白酶溶液。使用不锈钢筛网过滤悬液，并保留组织。在某一次消化过程中，胰蛋白酶可过夜处理，不影响最终消化效果。
  6. 用高渗缓冲液（1.5 M NaCl，50 mM Tris-HCl，pH 7.6）洗涤经胰蛋白酶处理的组织。
  7. 加入 10 mL 核酸酶溶液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，含 50 U/mL 脱氧核糖核酸酶和 1 U/mL 核糖核酸酶），将离心管置于 37 °C 摇床上反应 4 小时。
  8. 移除核酸酶溶液，用无菌 PBS 洗涤软骨三次，然后加入低渗 Tris-HCl 溶液。将离心管置于摇床上，室温（RT）下冲洗 20 小时。
  9. 移除低渗 Tris-HCl 溶液，用无菌 PBS 洗涤软骨三次，再加入 1% Triton X-100 溶液完全浸没组织，作用 24 小时。
  10. 移除 Triton X-100 溶液，用蒸馏水彻底冲洗脱细胞软骨 3 天，每 12 小时更换一次蒸馏水。
  11. 将软骨浸泡于过氧乙酸溶液（0.1% PAA 溶于 4% 乙醇）中 4 小时。移除过氧乙酸溶液后，用无菌蒸馏水洗涤软骨三次。
  12. 将不锈钢筛网（孔径：~250 µm）置于 50 mL 离心管上。将脱细胞软骨缓慢倾倒至筛网上，收集软骨。通过测定 DNA、胶原蛋白和糖胺聚糖（GAG）含量，评估软骨的脱细胞程度及基质保留情况。
  13. 将脱细胞软骨放入研磨钵中，加入液氮，研磨成粉末。取 2 g 脱细胞软骨粉末，加入 80 mL 0.5 M 醋酸和 20 mg 胃蛋白酶，消化 24 小时。在 400 x g 条件下离心 10 分钟；弃去沉淀，收集上清液（DC-ECM 溶液）。
  14. 将 1 mL DC-ECM 溶液分装至 6 孔板各孔中。将 6 孔板放入冷冻干燥机中，冷冻 DC-ECM 溶液。待冻干机内温度降至 −40 °C 后，开启真空泵，维持真空度为 10 Pa，持续 22 小时。
  15. 取出冻干后的 DC-ECM 溶液，放入离心管中，于 −20 °C 保存。冻干 DC-ECM 溶液的最短保存时间超过半年。
  16. 在离心管中加入 1 mL 无菌蒸馏水，溶解 20 mg 冻干 DC-ECM 溶液。在室温下以 1,000 rpm 的速度用涡旋振荡器振荡 1 分钟。向 DC-ECM 溶液中加入 1 mg 维生素 B2（0.1% w/v），37 °C 孵育 60 分钟，随后用紫外光（370 nm，3.5 mW/cm2）照射 3 分钟，形成水凝胶（DC-ECM 水凝胶）。

2. 脱细胞软骨的检测

  1. 脱细胞软骨的DNA含量检测
    注意：使用DNEasy Blood & Tissue试剂盒提取DNA。
    1. 首先，取20 mg脱细胞软骨基质（DC-ECM）软骨放入离心管中。加入180 µL Buffer GTL和20 µL蛋白酶K，涡旋振荡混匀，在56 °C下孵育4 h，直至软骨完全溶解。
    2. 在室温下使用涡旋混合器以1,000 rpm的速度震荡离心管15 s。然后加入200 µL Buffer GL和无水乙醇，充分涡旋混匀。在4 °C下以6,000 × g离心1 min。
    3. 向吸附柱中加入500 µL Buffer GW1，在4 °C下以12,000 × g离心1 min。再加入500 µL Buffer GW2，在4 °C下以20,000 × g离心1 min。最后向吸附柱中加入50 µL无菌水，在4 °C下以6,000 × g离心1 min，收集DNA溶液。使用分光光度计测定DNA含量。
  2. 脱细胞软骨中胶原含量检测
    1. 为检测脱细胞软骨中的胶原含量，使用羟脯氨酸作为胶原氨基酸标志物。将5 mg脱细胞软骨用5 mL 6 M盐酸在100 °C下酸化20 min，然后用5 mL 6 M氢氧化钠溶液中和。
    2. 使用分光光度计测定样品在570 nm处的吸光度，计算羟脯氨酸含量。利用标准羟脯氨酸样品获得浓度-吸光度线性回归曲线。
  3. 脱细胞软骨中糖胺聚糖（GAG）含量检测
    注意：使用组织GAG比色定量检测试剂盒检测DC-ECM软骨中的GAG含量。以下所有试剂均来自该试剂盒。
    1. 取200 mg DC-ECM软骨粉末，加入500 µL试剂A，涡旋振荡混匀。在4 °C下孵育16 h，然后在14,000 × g下离心10 min。
    2. 取50 mL样品溶液，加入50 µL高盐溶液（试剂B）和50 µL酸性溶液（试剂C），涡旋振荡混匀。孵育10 min。
    3. 加入750 µL染色液（试剂D），涡旋振荡混匀，在避光条件下孵育30 min。在14,000 × g下离心10 min，弃去上清液。
    4. 加入1 µL清洗液（试剂E），充分混匀。在14,000 × g下离心10 min，弃去上清液。
    5. 向样品中加入1 µL解离液（试剂F），充分混匀。在避光条件下孵育30 min。最后，在600 nm处使用分光光度计测定GAG含量。
  4. 脱细胞软骨的扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）分析
    1. 比较脱细胞软骨与正常软骨组织。将样品置于2.5%戊二醛溶液中，在4 °C下孵育过夜，然后用PBS洗涤三次。
    2. 用1%四氧化锇固定样品1 h，再用PBS洗涤三次。
    3. 依次将样品浸入50%、70%、90%和100%乙醇以及100%丙酮中各15 min进行脱水。将样品置于六甲基二硅氮烷与乙醇的混合液（1:1）中15 min，再浸入纯六甲基二硅氮烷中15 min。
    4. 将样品放入HCP-2干燥器中，用液氮干燥。然后，通过溅射镀膜在完全干燥的样品表面镀上一层薄金-钯膜，进行SEM成像。溅射镀膜条件为120 W功率下处理5 min。实验条件为：工作电压15 kV，真空度低于5 × 10−5 Pa。
    5. 进行TEM分析时，将样品置于无水丙酮与树脂混合液（1:1）中1 h，再置于无水丙酮与树脂混合液（1:3）中3 h，然后在树脂中过夜。
      1. 将样品放入充满包埋剂的包埋胶囊中，在70 °C下加热9 h。
      2. 包埋后，使用超薄切片机将样品切成70 nm的薄片，并置于铜网上。
      3. 用移液器将20 µL醋酸铀染色液滴加到铜网上，在室温下染色15 min。用蒸馏水轻轻冲洗铜网两次，去除染色液。
      4. 再将20 µL柠檬酸铅染色液滴加到铜网上，在室温下染色15 min。用蒸馏水冲洗铜网三次。
      5. 将铜网置于铺有滤纸的干净培养皿中。待空气干燥后，使用TEM拍摄图像。探针施加500 nN的向下作用力，扫描速率为1 Hz，弹性常数（k值）为40 Nm-1。探针尖端半径为8 nm。

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结果

为了制备更优的DC-ECM软骨水凝胶，我们研究并回顾了以往的文献，比较了不同脱细胞化方案在脱细胞率、免疫原性及机械功能方面的表现9。

基于此，我们制备了脱细胞软骨细胞外基质（DC-ECM）软骨水凝胶，并探讨了径向取向的提取基质/间充质干细胞外泌体生物墨水在治疗骨软骨缺损中的作用。结果表明，DC-ECM软骨水凝胶具有低免疫原性，能够增强细胞迁移并促进软骨修复10。

近年来，我们优化了脱细胞软骨基质（DC-ECM）软骨的制备方法。采用上述实验步骤制备脱细胞软骨，结果显示，与天然软骨相比，脱细胞软骨中的DNA含量显著降低（p < 0.001，图1A）。羟脯氨酸检测表明，天然软骨与脱细胞软骨之间的胶原蛋白含量相似（p = 0.48，图1B）。DMMB法检测显示，与天然软骨相比，脱细...

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讨论

本方案提供了一种系统性的方法，用于制备去细胞化软骨细胞外基质水凝胶，该水凝胶可高度模拟软骨组织的天然细胞外基质（ECM）。该方案结合了物理、化学和酶学方法对组织进行破坏，以去除细胞成分，同时保留ECM的结构与组成。方案中的关键步骤包括调整去细胞化的时间和方法，并确保实现完全的去细胞化。

与其他现有的组织工程和再生医学方法相比，本方案具有多项优势。脱细胞细胞外基质（DC-ECM）水凝胶具有优异的生物活性、空间结构和生物学诱导功能，且免疫原性低，这些特性有利于促进细胞黏附、增殖、分化和迁移11。此外，DC-ECM水凝胶还可用于药物递送和软骨缺损治疗12。

对该方案的一种改进是使用不同的交联剂以增强水凝胶的机械性能。例如，可采用纳米金属材料来改善水凝胶的机械性能13。此外，还可优化核黄素的浓度以及紫外光照射时间，以调控水凝胶的压缩强度和拉伸强度。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由浙江省医药卫生科技计划（2019KY050）、浙江省中医药科技计划（2019ZA026）、浙江省重点研发计划（项目编号：2020C03043）、浙江省中医药科技计划（2021ZQ021）以及中国浙江省自然科学基金（LQ22H060007）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M Tris-HCl，pH 7.6BeyotimeST776-100 mL
1 M Tris-HCl，pH 8.0BeyotimeST780-500 mL
-80 °C 型冷冻机EppendorfF440340034
脱氧核糖核酸酶AladdinD128600-80KU
DNEasy 血液 &Tissue 试剂盒Qiagen69506号
糖胺聚糖比色法定量检测试剂盒上海哈灵HL19236.2
HCP-2 干燥器 日立N/A
Nanodrop8000赛默飞世尔科技N/A分光光度计
PBS（10倍浓缩液）Gibco70011044
核糖核酸酶AladdinR341325-100 mg
Sigma500ZIESSN/A扫描电子显微镜
光谱 S赛默飞世尔科技N/A透射电子显微镜
不锈钢筛网SHXB-Z-1上海新埠
Triton X-100BeyotimeP0096-500 mL
胰蛋白酶 Gibco15050065
紫外灯Omnicure 2000N/A
维生素B2GibcoR4500-5G
涡旋混合器上海启森78HW-1 

参考文献

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