本文介绍了一种简便且高通量分离和富集大麻（Cannabis sativa）腺鳞茎状和无柄毛状体的实验方案。该方法基于干燥、非缓冲体系提取，仅使用液氮、 干冰和尼龙筛网进行毛状体提取，适用于RNA提取及转录组学分析。
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摘要
摘要
本文介绍了一种便捷、高通量分离与富集腺毛头状具柄及无柄毛状体的实验方案 Cannabis sativa大麻素和挥发性萜类代谢的生物合成途径主要定位于 大麻 腺毛，分离的腺毛有利于转录组分析。现有的用于转录组表征的腺毛分离方案存在操作不便、获得的腺头完整性差以及分离腺毛产量较低等问题。此外，这些方法依赖昂贵的设备和含有蛋白酶抑制剂的分离介质，以防止RNA降解。本方案提出结合三种独立的改进方法，以从植物材料中获得大量分离的头状具柄和无柄腺毛。 C. sativa 分别为成熟雌性花序和扇形叶片。第一项改进是用液氮替代传统的分离介质，以促进毛状体通过微筛。第二项改进是使用干冰使毛状体从植物材料上脱落。第三项改进是将植物材料依次通过五个孔径逐渐减小的微筛。显微成像结果表明，该分离技术对两种类型的毛状体均具有良好的分离效果。此外，从分离得到的毛状体中提取的RNA质量适用于后续转录组学分析。
引言
腺毛是植物中存在的毛发状结构，含有多种次生代谢产物1，是新型生物合成基因和酶的重要资源库2。在Cannabis中，重要的次生代谢产物大麻素3和萜类化合物4的生物合成定位于腺毛中。鉴于腺毛在决定Cannabis药用和娱乐用途品质方面的重要作用，研究腺毛的基因表达具有重要意义。为了表征腺毛特异性基因的表达，首先必须分离目标腺毛。腺毛分离方案最早于1992年被描述5，其最新进展也已得到近期综述2。通常，用于转录组学表征的腺毛提取方案可分为两个连续步骤。第一步是将腺毛从植物组织中进行充分的物理分离，可通过干冰5、使用商用装置配合玻璃珠6,7、将植物材料在筛网上研磨8，或在分离缓冲液中涡旋震荡植物组织9来实现。第二步是从显微镜下可见的植物残渣和/或其他类型的腺毛中进一步精细分离目标腺毛，可通过密度梯度离心8,10或不同孔径的筛网7,9完成。由于处理后的组织中RNA对降解物质极为敏感，这两个连续步骤通常需在冰冻的分离介质中进行，并常加入蛋白酶抑制剂4。
传统的毛状体分离方案除了需要冰冻温度外，还需要大量分离介质以确保提取过程的高效性。这些因素的结合导致分离过程繁琐且耗时，限制了高通量操作的实现。因此，提出一种简单、用户友好的替代性毛状体分离方案，可能对毛状体表征相关的多个方面具有重要意义。本文旨在通过整合传统方案中的多个要素，提供一种分离大麻（Cannabis sativa）具柄和无柄腺头毛状体的替代方案。这些要素包括干冰5、使毛状体通过孔径依次减小的多个微筛7,9，以及用液氮（LN） 替代分离介质8。
与传统方法相比，本毛状体分离方案的新颖性体现在多个方面。该方案操作便捷，无需使用有害组分。实验可在实验室中进行，仅需采取基本防护措施，且适用于高通量操作。以液氮替代标准液体分离介质，可确保毛状体在整个分离过程中的完整性，从而为后续转录组分析提供保障。液氮和干冰升华后，分离得到的毛状体不残留任何有害物质。此外，液氮在室温下易于升华的特性使其可在整个实验流程中大量使用。相比之下，大量使用传统液体分离介质会带来实际操作上的困难。最后，该方案减少了腺毛头部结构中盘状细胞与其余脆弱部分的分离，有助于保留头部空间内的内含物。
本方案以详细的分步形式呈现，旨在协助技术人员开展大麻（C. sativa）腺毛状头状毛状体的分离操作。该方案提供了一套可操作的工作流程，能够获得高浓度和高纯度的分离毛状体，适用于后续分子分析。
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方案
注意：本研究使用的植物材料包括四种在以色列Volcani中心种植的C. sativa ARO-Volcani品系（CS-11、CS-12、CS-13和CS-14），具体种植方法见其他文献11。腺性具柄头状毛状体从成熟的开花花序中分离获得，而腺性无柄头状毛状体则从成熟非开花母株的大扇形叶中分离获得。所有植物材料均新鲜采集后立即于−80 °C保存。
警告：本实验方案全程使用干冰和液氮。这些物质具有极高危险性。分离的毛状体可能含有干冰颗粒，插入密封管后可能产生危险的气体压力；因此，所有管盖均需用针刺孔。强烈建议佩戴护目镜、合适的实验服以及适用于极低温操作的手套。
1. 植物材料中毛状体初始分离的准备工作
- 使用锤子和坚硬的平面物体在5 L塑料容器中将干冰块粉碎成细小的薄片。
- 用大号滤网将细小的干冰碎屑（小于5 mm）与未粉碎的干冰分离通过 孔径小于5 mm的筛子）倒入另一个5 L塑料容器中。倒入约200 cm³3 （200 mL 刻度处）的干冰碎片放入一个直立的 1 L 玻璃烧杯中。
- 加入最多10 g冷冻的 C. sativa 花序（此后称为植物材料）置于第一层粉碎的干冰上，并用额外一层200 cm3 细碎的干冰。
- 用两到三层1毫米孔径的纱窗蚊帐布覆盖1升玻璃烧杯的开口，并用橡皮筋将其固定在玻璃杯外侧图1).
- 加入LN 放入一个大型圆底不锈钢容器中（参见 材料表)，用于收集分离的毛状体。
- 将一个350 µm的筛网插入面粉筛底部，以从下方覆盖面粉筛的筛网图2）。如果使用带有可拆卸塑料环的面粉筛，将350 µm筛网插入其中，使其固定在面粉筛的筛网下方。若无此装置，则用橡皮筋将350 µm筛网固定在面粉筛的边缘。
- 将面粉筛置于装有液氮的大型圆底不锈钢容器上方图3确保容器的宽度大于面粉筛的宽度，以尽量减少筛分后的物料洒落到圆形不锈钢容器外。
2. 从植物材料中分离毛状体
- 将1 L玻璃瓶倒置，瓶口朝向面粉筛，像使用大型盐瓶一样摇晃图4).
- 每隔 2-3 分钟将 1 L 玻璃烧杯移开，以便过筛堆积在面粉筛上的粉碎干冰和植物材料。
- 将面粉筛水平筛动，以促进植物材料进入液氮中 在下方的圆底不锈钢容器中。
- 当液氮（LN）量不足时，向不锈钢容器中补充液氮；当1 L玻璃烧杯中的干冰消耗较多时，向其中添加粉碎的干冰。当面粉筛上的植物材料用尽时，用额外的10 g新鲜植物材料补充玻璃烧杯中的材料。通常情况下，补充操作无需重复超过两次。
- 重复步骤 2.1–2.4，直至在圆底不锈钢容器中收集到足量的富集腺毛。通常，20 g 新鲜植物材料足以用于 RNA 提取和转录组分析。
- 确认浸没在液氮（LN）中的不锈钢容器底部存在一种类似白色粉末的物质（由植物碎屑、腺毛和粉碎的干冰组成）。显微观察有助于判断是否已收集到足够量的腺毛，但此步骤可能会干扰实验流程的连贯性。通常情况下，大多数分离操作使用10–20 g起始植物材料即可；然而，不同植物的腺毛密度可能存在差异。
注意：从这一点开始，实验可以暂停并在之后重新启动。如果暂停时间较短，应保留足量的 LN 应加入适量液体，使毛状体保持浸没状态。或者，毛状体可按照步骤5所述方法收集并储存在−80 °C，最长可保存3个月，以备后续使用。
3. 将腺毛头状毛（具柄和无柄）与其他类型的毛状体（如球形毛状体和囊状结石毛状体）及碎片分离开
- 加入少量液氮 转移到一个洁净的小型圆底不锈钢容器中。
- 将一块40 cm × 40 cm、孔径为150 µm的微型筛网对折两次，得到一个20 厘米 × 20 厘米折叠，然后打开。确保其呈圆锥状（图5).
- 用一到两个夹子将网状锥体固定在圆底不锈钢容器的边缘，使锥体的开口端朝上，尖端部分浸入液氮中。
- 轻柔地倒入液氮 将步骤2.6中得到的白色粉末状物质加入微型筛锥中。
- 用宽头刷轻轻刷取并转移第一个容器中残留的植物材料至150 µm筛网锥形漏斗中。
- 向第一个容器中添加更多液氮，重复刷拭动作，直至所有植物材料均转移至微型筛锥中。
- 小心地将衣夹从容器盖上取下，打开微型筛锥，使腺毛位于打开的微型筛网中央。捏住微型筛网的四个角，使含有腺毛的中部保持浸没在液氮（LN）中图6).
- 用双手捏住微筛的四个角，轻轻将其浸入钢制容器中的液氮（LN）中，并像浸泡茶包一样轻轻摇晃微筛。持续进行这种浸入/摇晃（垂直和水平方向）动作1分钟。分离效果与产量之间存在权衡关系：浸入时间较长可能获得更多的腺毛，但其纯度可能降低。综合考虑，推荐1分钟的处理时间为兼顾产量与分离质量的最佳选择。
注意：此筛分操作是本实验方案中最关键的步骤，应严格按照要求执行。 - 可选：用13 mL离心管收集包裹在微型筛网中心、未过筛的植物碎屑及较大的、仍浸没在液氮中的腺毛 或50 mL离心管中，于−80 °C保存以备后续使用。
警告：为避免干冰和液氮残留物产生气体积聚压力，需使用灭菌针头在试管盖上刺一个小孔。待压力降低后（通常在24小时后）可更换新的盖子。
4. 通过孔径递减的微筛过滤毛状体
- 将沉在小型圆底不锈钢容器中液氮（LN）底部的过筛腺毛，按照步骤3所述方法，依次通过孔径逐渐减小的微型筛网（105 µm、80 µm、65 µm 和 50 µm）进行转移。
5. 收集目标毛状体
- 用预冷（在液氮中）的勺子取出浸没在液氮中并包裹在50 µm微型筛网中的目标毛状体，置于洁净的培养皿上。
注意：在此最终分离阶段，从筛子上收集所需的毛状体。 - 迅速将粉末状的腺毛转移至已标记并预冷的1.5 mL离心管中 通过 预冷的刮勺或药勺插入管中（图7立即将试管置于 −80 °C 保存，以备后续研究。
注意：整个分离方案的示意图流程图如下所示 图8.
6. 纯化后毛状体的观察与分析
- 将少量（10 mg）分离的腺毛置于显微镜载玻片上，使用预冷的（通过 LN）刮勺，加入一滴水，不染色直接在光学显微镜下观察。使用低倍（10×）和高倍（40×）物镜评估整体分离程度及污染程度。通过比较毛状体与非毛状体组织的相对含量，对富集程度进行直观估算，如图所示 图9.
- 从50 mg分离组织中进行RNA提取及质量分析 C. sativa 腺毛状头状具柄及无柄毛状体。
注意：一种市售提取试剂盒（参见 材料表采用基于poly-A的mRNA纯化策略进行RNA提取。- 将50 mg分离得到的腺毛重悬于裂解液中，涡旋振荡30 s，在冰浴中超声清洗仪（35 kHz）中超声处理5 min，然后根据试剂盒说明书提取样品中的mRNA（参见 材料表).
- 为评估从毛状体提取的RNA的完整性，使用芯片实验室系统测定RNA浓度、总量及RNA完整性数值（RIN）（参见 材料表).
- 对毛状体组分进行RNA测序分析（可选）。测序所得reads的RNA测序分析及生物信息学分析可通过标准的外包服务完成
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结果
与传统的毛状体分离方案相比，本方案的主要改进之处在于用液氮（LN）替代了标准的分离介质。使用液氮作为分离介质可使实验流程更加宽松，因为只要样品始终浸没在液氮中，就不太可能发生代谢降解。此外，由于本方案避免了传统毛状体分离介质中所含的有害成分（即金精三羧酸和β-巯基乙醇），实验操作无需局限于化学通风橱中进行。然而，在操作干冰和液氮时，仍需采取必要的安全防护措施。
为评估本方案的优势，将本方案获得的腺毛分离结果与传统腺毛分离方法（使用水相缓冲液、玻璃珠和细筛进行腺毛分离）所得结果进行了比较12，最初使用光学显微镜进行观察。不同分离阶段组分的比较 通过 光学显微镜观察显示，随着分离过程的进行，毛状体的分离程度逐渐增加。在分离过程的初始阶段（105-150 µm 微筛），叶片组织碎片在分离出的部分中占主导地位（图9A），与最终的分离产物形成对比，后者几乎完全由分离的腺毛组成（图9C）。应注意验证分离的样品无...
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讨论
与目前可用的毛状体分离方案相比，本方案描述了两项主要改进：一是在初始步骤中使用干冰将毛状体从植物材料上分离，二是以液氮（LN）替代常用的液体缓冲液介质。该方案中针对C. sativa毛状体纯化的第一项改进，基于先前一项利用粉碎干冰从天竺葵花梗上分离毛状体的方案5。传统毛状体分离方案通常使用小型（50 mL）试管，而本研究采用1 L玻璃烧杯，并加入大量粉碎干冰，从而可处理更大体积的初始植物材料（最多达10 g）。此外，本方案在第一分离步骤中额外增加了两次毛状体通过微孔筛的过筛过程。第一次采用类似盐瓶的剧烈上下垂直振荡方式，第二次则采用类似面粉筛的水平筛动方式通过微孔筛。建议结合使用水平与垂直筛动方式，以促进基于毛状体大小和形状的更高效分离。
第二个也是最重要的改进涉及通过微筛进行分离时所使用的分离介质。在本方案中，传统的水基分离介质被完全替换为液氮（LN）。先前的一项方案8也在第一步中使用液氮进行腺毛的分离，通过将花组织在网筛上研磨以将腺毛与植物材料分离，但后续仍采用液体...
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致谢
作者感谢CannabiVar有限公司提供的资金支持。所有植物材料均由以色列Volcani中心的Hinanit Koltai教授慷慨提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物分析仪RNA Pico 6000芯片 | Agilent, Germany | 货号 5067-1513 | 芯片实验室系统 |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | 超声波清洗仪 |
| TruSeq RNA样本制备试剂盒v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | RNA测序文库样本制备 |
| Spectrum植物总RNA试剂盒 | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | 植物总RNA试剂盒 |
| 尼龙微孔筛，孔径350 µm（40 x 40 cm或大于面粉筛周长） | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | 尼龙 筛网孔径 |
| 尼龙微孔筛，孔径150 µm（30 x 30 cm） | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | 尼龙 筛网孔径 |
| 尼龙微孔筛，孔径105 µm（30 x 30 cm） | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | 尼龙 筛网孔径 |
| 尼龙微孔筛，孔径80 µm（30 x 30 cm） | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | 尼龙 筛网孔径 |
| 尼龙微孔筛，孔径65 µm（30 x 30 cm） | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | 尼龙 筛网孔径 |
| 尼龙微孔筛，孔径50 µm（30 x 30 cm） | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | 尼龙 筛网孔径 |
| 最多10 g冷冻植物材料（储存于-80 oC或液氮中） | |||
| 适用于低温操作的防护手套 | |||
| 护目镜 | |||
| 1 mm孔径的纱窗网（30 x 100 cm条状） | |||
| 大号滤网（漏勺），孔径约5 mm | |||
| 1 L玻璃烧杯 | |||
| 1块干冰（0.5–1 kg） | |||
| 锤子和坚硬的平面物体 | |||
| 两个5 L塑料容器 | |||
| 橡皮筋 | |||
| 大号面粉筛或筛网滤器——最好带有可拆卸的塑料环 | |||
| 若干大小不同的圆底不锈钢容器。其中一个应大于面粉筛的周长（直径约40 cm），以尽量减少筛分物料在圆底不锈钢容器外的损失 | |||
| 预冷（通过液氮）的不锈钢勺、刮刀和药勺 | |||
| 干净的托盘 | |||
| 若干夹子 | |||
| 预冷（通过液氮）并标记的1.5 mL离心管，管盖用无菌针头扎孔 | |||
| 两个液氮容器 | |||
| 1 cm宽的画笔 |
参考文献
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