本文介绍了一种简便且高通量分离和富集大麻（Cannabis sativa）腺鳞茎状和无柄毛状体的实验方案。该方法基于干燥、非缓冲体系提取，仅使用液氮、 干冰和尼龙筛网进行毛状体提取，适用于RNA提取及转录组学分析。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种便捷、高通量分离与富集腺毛头状具柄及无柄毛状体的实验方案 Cannabis sativa大麻素和挥发性萜类代谢的生物合成途径主要定位于 大麻 腺毛，分离的腺毛有利于转录组分析。现有的用于转录组表征的腺毛分离方案存在操作不便、获得的腺头完整性差以及分离腺毛产量较低等问题。此外，这些方法依赖昂贵的设备和含有蛋白酶抑制剂的分离介质，以防止RNA降解。本方案提出结合三种独立的改进方法，以从植物材料中获得大量分离的头状具柄和无柄腺毛。 C. sativa 分别为成熟雌性花序和扇形叶片。第一项改进是用液氮替代传统的分离介质，以促进毛状体通过微筛。第二项改进是使用干冰使毛状体从植物材料上脱落。第三项改进是将植物材料依次通过五个孔径逐渐减小的微筛。显微成像结果表明，该分离技术对两种类型的毛状体均具有良好的分离效果。此外，从分离得到的毛状体中提取的RNA质量适用于后续转录组学分析。
引言
腺毛是植物中存在的毛发状结构，含有多种次生代谢产物1，是新型生物合成基因和酶的重要资源库2。在Cannabis中，重要的次生代谢产物大麻素3和萜类化合物4的生物合成定位于腺毛中。鉴于腺毛在决定Cannabis药用和娱乐用途品质方面的重要作用，研究腺毛的基因表达具有重要意义。为了表征腺毛特异性基因的表达，首先必须分离目标腺毛。腺毛分离方案最早于1992年被描述5，其最新进展也已得到近期综述2。通常，用于转录组学表征的腺毛提取方案可分为两个连续步骤。第一步是将腺毛从植物组织中进行充分的物理分离，可通过干冰5、使用商用装置配合玻璃珠6,7、将植物材料在筛网上研磨8，或在分离缓冲液中涡旋震荡植物组织9来实现。第二步是从显微镜下可见的植物残渣和/或其他类型的腺毛中进一步精细分离目标腺毛，可通过密度梯度离心8,....
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方案
注意：本研究使用的植物材料包括四种在以色列Volcani中心种植的C. sativa ARO-Volcani品系（CS-11、CS-12、CS-13和CS-14），具体种植方法见其他文献11。腺性具柄头状毛状体从成熟的开花花序中分离获得，而腺性无柄头状毛状体则从成熟非开花母株的大扇形叶中分离获得。所有植物材料均新鲜采集后立即于−80 °C保存。
警告：本实验方案全程使用干冰和液氮。这些物质具有极高危险性。分离的毛状体可能含有干冰颗粒，插入密封管后可能产生危险的气体压力；因此，所有管盖均需用针刺孔。强烈建议佩戴护目镜、合适的实验服以及适用于极低温操作的手套。
1. 植物材料中毛状体初始分离的准备工作
- 使用锤子和坚硬的平面物体在5 L塑料容器中将干冰块粉碎成细小的薄片。
- 用大号滤网将细小的干冰碎屑（小于5 mm）与未粉碎的干冰分离通过 孔径小于5 mm的筛子）倒入另一个5 L塑料容器中。倒入约200 cm³3 （200 mL 刻度处）的干冰碎片放入一个直立的 1 L 玻璃烧杯中。
- 加入最多10 g冷冻的 C. sativa 花序（此后称为植物材料）置于第一层粉碎的干冰上，并用额外一层200 cm3....
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结果
与传统的毛状体分离方案相比，本方案的主要改进之处在于用液氮（LN）替代了标准的分离介质。使用液氮作为分离介质可使实验流程更加宽松，因为只要样品始终浸没在液氮中，就不太可能发生代谢降解。此外，由于本方案避免了传统毛状体分离介质中所含的有害成分（即金精三羧酸和β-巯基乙醇），实验操作无需局限于化学通风橱中进行。然而，在操作干冰和液氮时，仍需采取必要的安全防护措施。
为评估本方案的优势，将本方案获得的腺毛分离结果与传统腺毛分离方法（使用水相缓冲液、玻璃珠和细筛进行腺毛分离）所得结果进行了比较12，最初使用光学显微镜进行观察。不同分离阶段组分的比较 通过 光学显微镜观察显示，随着分离过程的进行，毛状体的分离程度逐渐增加。在分离过程的初始阶段（105-150 µm 微筛），叶片组织碎片在分离出的部分中占主导地位（图9A），与最终的分离产物形成对比，后者几乎完全由分离的腺毛组成（图9C）。应注意验证分离的样品无.......
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讨论
与目前可用的毛状体分离方案相比，本方案描述了两项主要改进：一是在初始步骤中使用干冰将毛状体从植物材料上分离，二是以液氮（LN）替代常用的液体缓冲液介质。该方案中针对C. sativa毛状体纯化的第一项改进，基于先前一项利用粉碎干冰从天竺葵花梗上分离毛状体的方案5。传统毛状体分离方案通常使用小型（50 mL）试管，而本研究采用1 L玻璃烧杯，并加入大量粉碎干冰，从而可处理更大体积的初始植物材料（最多达10 g）。此外，本方案在第一分离步骤中额外增加了两次毛状体通过微孔筛的过筛过程。第一次采用类似盐瓶的剧烈上下垂直振荡方式，第二次则采用类似面粉筛的水平筛动方式通过微孔筛。建议结合使用水平与垂直筛动方式，以促进基于毛状体大小和形状的更高效分离。
第二个也是最重要的改进涉及通过微筛进行分离时所使用的分离介质。在本方案中，传统的水基分离介质被完全替换为液氮（LN）。先前的一项方案8也在第一步中使用液氮进行腺毛的分离，通过将花组织在网筛上研磨以将腺毛与植物材料分离，但后续仍采用液体.......
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致谢
作者感谢CannabiVar有限公司提供的资金支持。所有植物材料均由以色列Volcani中心的Hinanit Koltai教授慷慨提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物分析仪RNA Pico 6000芯片 | Agilent, Germany | 货号 5067-1513 | 芯片实验室系统 |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | 超声波清洗仪 |
| TruSeq RNA样本制备试剂盒v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | RNA测序文库样本制备 |
| Spectrum植物总RNA试剂盒 | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | 植物总RNA试剂盒 |
| 尼龙微孔筛，孔径350 µm（40 x 40 cm或大于面粉筛周长） | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | 尼龙 筛网孔径 |
| 尼龙微孔筛，孔径150 µm（30 x 30 cm） | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | 尼龙 筛网孔径 |
| 尼龙微孔筛，孔径105 µm（30 x 30 cm） | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | 尼龙 筛网孔径 |
| 尼龙微孔筛，孔径80 µm（30 x 30 cm） | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | 尼龙 筛网孔径 |
| 尼龙微孔筛，孔径65 µm（30 x 30 cm） | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | 尼龙 筛网孔径 |
| 尼龙微孔筛，孔径50 µm（30 x 30 cm） | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | 尼龙 筛网孔径 |
| 最多10 g冷冻植物材料（储存于-80 oC或液氮中） | |||
| 适用于低温操作的防护手套 | |||
| 护目镜 | |||
| 1 mm孔径的纱窗网（30 x 100 cm条状） | |||
| 大号滤网（漏勺），孔径约5 mm | |||
| 1 L玻璃烧杯 | |||
| 1块干冰（0.5–1 kg） | |||
| 锤子和坚硬的平面物体 | |||
| 两个5 L塑料容器 | |||
| 橡皮筋 | |||
| 大号面粉筛或筛网滤器——最好带有可拆卸的塑料环 | |||
| 若干大小不同的圆底不锈钢容器。其中一个应大于面粉筛的周长（直径约40 cm），以尽量减少筛分物料在圆底不锈钢容器外的损失 | |||
| 预冷（通过液氮）的不锈钢勺、刮刀和药勺 | |||
| 干净的托盘 | |||
| 若干夹子 | |||
| 预冷（通过液氮）并标记的1.5 mL离心管，管盖用无菌针头扎孔 | |||
| 两个液氮容器 | |||
| 1 cm宽的画笔 |
参考文献
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H.
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