该方案研究了 platycodin D 在棕榈酸诱导的非酒精性脂肪性肝病中的保护作用 体外 模型
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方法文章
探究桔梗皂苷D在棕榈酸诱导的非酒精性脂肪性肝病中的保护作用 体外 模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）在全球范围内的发病率正以惊人的速度上升。 Platycodon grandiflorum 被广泛用作治疗多种疾病的传统民族药物，是一种可融入日常饮食的典型功能性食品。研究表明，桔梗皂苷D（PD）是其中主要活性成分之一 桔梗，具有高生物利用度，可显著缓解非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的进展，但其潜在机制尚不明确。本研究旨在探讨原花青素（PD）对非酒精性脂肪性肝病的治疗作用 体外AML-12细胞用300 µM棕榈酸（PA）预处理24小时以建立非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型 体外随后，细胞经PD处理或不进行PD处理，持续24小时。采用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色法检测活性氧（ROS）水平，通过JC-1染色法测定线粒体膜电位。此外，通过蛋白质印迹法分析细胞裂解液中LC3-II/LC3-I和p62/SQSTM1的蛋白表达水平。结果显示，在棕榈酸（PA）处理组中，与对照组相比，PD显著降低了ROS水平和线粒体膜电位。同时，PD在PA处理组中提高了LC3-II/LC3-I水平，并降低了p62/SQSTM1水平。结果表明，PD可改善非酒精性脂肪性肝病（NAFLD） 体外 通过降低氧化应激并促进自噬。这 体外 模型是研究PD在NAFLD中作用的有用工具。
引言
桔梗 （PG），即干燥的根 桔梗 （Jacq.）A.DC. 在中国传统医学（TCM）中有所应用，主要产于中国东北、华北、华东、华中及西南地区。1PG组分包括三萜皂苷、多糖、黄酮类、多酚、聚乙二醇、挥发油和矿物质2PG 在亚洲有着长期作为食品和草药使用的歷史。传统上，这种草药被用于治疗肺部疾病。现代药理学研究也证实了 PG 对其他疾病的治疗功效。研究表明，PG 对多种药物诱导的肝损伤模型具有治疗作用。膳食补充 PG 或桔梗皂苷提取物可改善高脂饮食诱导的肥胖及其相关代谢性疾病3,4,5. PG来源的多糖可用于治疗小鼠LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤6此外，PG根部来源的皂苷可改善高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）7此外，桔梗皂苷D（PD）是PG中最重要的一种治疗成分，可增强人肝细胞癌（HepG2）细胞中低密度脂蛋白受体的表达以及低密度脂蛋白的摄取8此外，PD 还可诱导 HepG2 细胞凋亡，并抑制其黏附、迁移和侵袭能力。9
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方案
AML-12 细胞（一种正常的小鼠肝细胞系）用于基于细胞的研究。这些细胞购自商业来源（见材料表）。
1. 建立非酒精性脂肪性肝病模型的AML-12细胞预处理 体外
- 将细胞置于正常细胞培养基中（DMEM 与 Ham's F12 培养基按 1:1 混合，含 0.005 mg/mL 胰岛素、5 ng/mL 硒、0.005 mg/mL 转铁蛋白、40 ng/mL 地塞米松和 10% 胎牛血清 [FBS]，参见材料表），在 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中培养。
- 以每孔 1 mL 的体积将细胞接种于 12 孔板中，接种密度为 2.8 × 105 个细胞/孔。
注意：所有细胞消化和换液操作均在生物安全柜中进行，以避免细胞污染。 - 过夜培养（约 10 小时）后，吸除细胞培养基，然后每孔用 1 mL 无血清培养基洗涤细胞两次。
- 将 12 孔细胞培养板从左至右分为四个不同的处理组，分别为：(1) 对照组，(2) PD 处理组，(3) PA 处理组，以及 (4) PA + PD 处理组。
注意：每个实验处理组设置三个重复，位于同一块 12 孔板上，从上至下排列。 - 向对照组和 PD 处理组中加入正....
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结果
细胞内活性氧水平
AML-12 细胞用 300 µM 棕榈酸（PA）诱导 24 小时，建立非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）细胞模型。随后，细胞经 PD 处理 24 小时。采用 DCFH-DA 荧光探针标记细胞，并在荧光显微镜下观察活性氧（ROS）的生成。细胞内 ROS 的 DCFH-DA 染色结果如 图 1 所示。结果显示，与仅用 300 µM PA 孵育的细胞相比，PD 能显著降低细胞内 ROS 水平（P < 0.01），表明 PD 可减轻细胞氧化应激。
细胞线粒体膜电位
线粒体是由内源性凋亡通路调控的核心细胞器48,49,50。因此，在经JC-1染色后，通过荧光显微镜观察经PD处理24 h的AML-12细胞的线粒体膜电位（MMP.......
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讨论
研究表明，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种临床病理综合征，其疾病谱从单纯性脂肪肝延伸至非酒精性脂肪性肝炎（NASH），并可进一步发展为肝硬化和肝癌51高脂饮食和久坐不动的生活方式是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的常见风险因素。目前已有针对NAFLD治疗的非药物疗法和药物疗法的相关研究。51,52,53然而，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发病机制尚未完全阐明。本文所述方法涉及一种 体外 通过棕榈酸（PA）刺激AML-12细胞建立的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型。我们在该模型中研究了PD对NAFLD的保护作用，发现PD可减轻PA诱导的活性氧（ROS）水平升高。此外，PD还能改善PA引起的线粒体膜电位（MMP）去极化。进一步研究表明，PD可显著降低p62蛋白表达水平，并提高LC3-II/LC3-I比值。这些实验结果为将PD作为治疗NAFLD的活性药物成分的应用提供了依据。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到重庆市科学技术委员会（cstc2020jxjl-jbky10002、jbky20200026、cstc2021jscx-dxwtBX0013 和 jbky20210029）以及中国博士后科学基金会（编号：2021MD703919）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5% BSA封闭缓冲液 | Solarbio，北京，中国 | SW3015 | |
| AML12（alpha mouse liver 12）细胞系 | 普罗赛生命科学&安普科技有限公司，中国 | AML12 | |
| Beyo ECL 加 | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | P0018S | |
| 生物安全柜 | Esco Micro Pte Ltd，新加坡 | AC2-5S1 A2 | |
| cellSens | 奥林巴斯，日本东京 | 1.8 | |
| CO2 培养箱 | Esco Micro Pte Ltd，新加坡 | CCL-170B-8 | |
| 地塞米松 | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | ST125 | |
| 二甲基亚砜 | Solarbio，北京，中国 | D8371 | |
| DMEM/F12 | Hyclone 洛根, 中国台湾 美国 | SH30023.01 | |
| 胎牛血清 | Hyclone，新西兰陶朗加 | SH30406.05 | |
| Graphpad 软件 | GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 8.0 | |
| HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L） | ABclonal，中国武汉 | AS003 | |
| 疏水性PVDF转印膜 | 默克，德国达姆施塔特 | IPFL00010 | |
| 胰岛素、转铁蛋白、硒溶液，100× | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | C0341 | |
| MAP LC3β 抗体 | Santa Cruz Biotechnology（上海）有限公司 | SC-376404 | |
| JC-1线粒体膜电位检测试剂盒 | Solarbio，北京，中国 | M8650 | |
| 奥林巴斯倒置显微镜 IX53 | 奥林巴斯，日本东京 | IX53 | |
| 棕榈酸 | 德国 Sigma | P0500 | |
| 青霉素-链霉素溶液（100倍浓缩） | Hyclone 洛根, 犹他州 美国 | SV30010 | |
| 苯甲基磺酰基 氟化物 | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | ST506 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Hyclone 洛根, 犹他州 美国 | BL302A | |
| 桔梗皂苷D | 成都微斯生物科技有限公司，中国 | CSA：58479-68-8 | |
| 通用蛋白酶抑制剂混合物，100倍浓缩液 | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | P1005 | |
| 蛋白分子量标准 | Solarbio，北京，中国 | PR1910 | |
| 活性氧检测试剂盒 | Solarbio，北京，中国 | CA1410 | |
| RIPA 裂解 缓冲液 | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | P0013E | |
| SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒 | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | P0012AC | |
| 5× SDS-PAGE样品上样缓冲液 | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | P0015 | |
| Sigma 离心机 | 德国 Sigma | 3K15 | |
| SQSTM1/p62 抗体 | Santa Cruz Biotechnology（上海）有限公司 | SC-28359 | |
| Tecan Infinite 200 PRO | Tecan Austria GmbH，奥地利 | 1510002987 | |
| WB 转膜缓冲液，10x | Solarbio，北京，中国 | D1060 | |
| β-肌动蛋白小鼠单克隆抗体 | ABclonal，中国武汉 | AC004 |
参考文献
- Xunyan, X. Y., Fang, X. M. The effect of Platycodon grandiflorum and its historical change in the clinical application of Platycodonis radix. Zhonghua Yi Shi Za Shi. 51 (3), 167-176 (2021).
- Ma, X., et al.
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重印与许可
