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方法文章

探究桔梗皂苷D在棕榈酸诱导的非酒精性脂肪性肝病中的保护作用 体外 模型

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DOI：

10.3791/64816

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2022年12月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

该方案研究了 platycodin D 在棕榈酸诱导的非酒精性脂肪性肝病中的保护作用 体外 模型

摘要

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）在全球范围内的发病率正以惊人的速度上升。 Platycodon grandiflorum 被广泛用作治疗多种疾病的传统民族药物，是一种可融入日常饮食的典型功能性食品。研究表明，桔梗皂苷D（PD）是其中主要活性成分之一 桔梗，具有高生物利用度，可显著缓解非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的进展，但其潜在机制尚不明确。本研究旨在探讨原花青素（PD）对非酒精性脂肪性肝病的治疗作用 体外AML-12细胞用300 µM棕榈酸（PA）预处理24小时以建立非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型 体外随后，细胞经PD处理或不进行PD处理，持续24小时。采用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色法检测活性氧（ROS）水平，通过JC-1染色法测定线粒体膜电位。此外，通过蛋白质印迹法分析细胞裂解液中LC3-II/LC3-I和p62/SQSTM1的蛋白表达水平。结果显示，在棕榈酸（PA）处理组中，与对照组相比，PD显著降低了ROS水平和线粒体膜电位。同时，PD在PA处理组中提高了LC3-II/LC3-I水平，并降低了p62/SQSTM1水平。结果表明，PD可改善非酒精性脂肪性肝病（NAFLD） 体外 通过降低氧化应激并促进自噬。这 体外 模型是研究PD在NAFLD中作用的有用工具。

引言

桔梗 （PG），即干燥的根 桔梗 （Jacq.）A.DC. 在中国传统医学（TCM）中有所应用，主要产于中国东北、华北、华东、华中及西南地区。1PG组分包括三萜皂苷、多糖、黄酮类、多酚、聚乙二醇、挥发油和矿物质2PG 在亚洲有着长期作为食品和草药使用的歷史。传统上，这种草药被用于治疗肺部疾病。现代药理学研究也证实了 PG 对其他疾病的治疗功效。研究表明，PG 对多种药物诱导的肝损伤模型具有治疗作用。膳食补充 PG 或桔梗皂苷提取物可改善高脂饮食诱导的肥胖及其相关代谢性疾病3,4,5. PG来源的多糖可用于治疗小鼠LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤6此外，PG根部来源的皂苷可改善高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）7此外，桔梗皂苷D（PD）是PG中最重要的一种治疗成分，可增强人肝细胞癌（HepG2）细胞中低密度脂蛋白受体的表达以及低密度脂蛋白的摄取8此外，PD 还可诱导 HepG2 细胞凋亡，并抑制其黏附、迁移和侵袭能力。9,10因此，在本研究中，采用小鼠肝癌AML-12细胞进行实验 体外 模型构建，并进一步研究PD在该模型中的药理作用及其潜在机制。

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）这一术语指的是一组包括单纯性脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化和肝细胞癌在内的肝脏疾病11。尽管NAFLD的发病机制尚未完全阐明，但从经典的"二次打击"理论到目前的"多重打击"理论，胰岛素抵抗均被认为是NAFLD发病机制的核心环节12,13,14。研究表明，肝细胞中的胰岛素抵抗可导致游离脂肪酸增加，进而形成甘油三酯并在肝脏中沉积，使肝脏发生脂肪变性15,16。脂肪的积聚可引起脂毒性、氧化应激诱导的线粒体功能障碍、内质网应激以及炎症性细胞因子的释放，从而导致NAFLD的发生与发展17,18。此外，自噬也在NAFLD的发病机制中发挥作用，因其参与调控细胞胰岛素敏感性、细胞脂质代谢、肝细胞损伤及固有免疫反应19,20,21。

已建立多种动物模型和细胞模型，为探索非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发病机制及潜在治疗靶点提供了基础22,23然而，单一动物模型无法完全模拟非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的全部病理过程24动物个体间的差异导致不同的病理特征。使用肝细胞系或原代肝细胞在 体外 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的研究可确保实验条件的最大一致性。肝脏脂质代谢紊乱可导致NAFLD中肝细胞脂滴积累水平升高。25游离脂肪酸（如油酸和棕榈油）已被用于 体外 模拟高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病模型26,27人肝母细胞瘤细胞系HepG2常用于构建非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型 体外但是，作为一种肿瘤细胞系，HepG2 细胞的代谢与正常生理条件下肝细胞的代谢存在显著差异28因此，使用原代肝细胞或小鼠原代肝细胞来构建 体外 用于药物筛选的NAFLD模型比使用肿瘤细胞系更具优势。在动物模型和细胞模型中，对药物效应与治疗靶点进行协同性考察的比较 体外 肝细胞模型时，使用小鼠肝细胞构建似乎是一种可行的方法 体外 非酒精性脂肪性肝病模型具有更好的应用潜力。

进入肝脏的游离脂肪酸可被氧化以产生能量，或以甘油三酯形式储存。值得注意的是，游离脂肪酸具有一定的脂毒性，可能诱导细胞功能障碍和细胞凋亡12棕榈酸（PA）是人血浆中最丰富的饱和脂肪酸29当非脂肪组织中的细胞长期暴露于高浓度棕榈酸（PA）时，会刺激活性氧（ROS）的产生，导致氧化应激、脂质蓄积，甚至细胞凋亡。30因此，许多研究人员使用棕榈酸（PA）作为诱导剂，刺激肝细胞产生活性氧（ROS），从而构建模型 体外 脂肪肝疾病模型及评估某些活性物质对细胞的保护作用31,32,33,34本研究介绍了一种用于探究PD对棕榈酸（PA）诱导的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）细胞模型保护作用的实验方案。

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方案

AML-12 细胞（一种正常的小鼠肝细胞系）用于基于细胞的研究。这些细胞购自商业来源（见材料表）。

1. 建立非酒精性脂肪性肝病模型的AML-12细胞预处理 体外

  1. 将细胞置于正常细胞培养基中（DMEM 与 Ham's F12 培养基按 1:1 混合，含 0.005 mg/mL 胰岛素、5 ng/mL 硒、0.005 mg/mL 转铁蛋白、40 ng/mL 地塞米松和 10% 胎牛血清 [FBS]，参见材料表），在 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中培养。
  2. 以每孔 1 mL 的体积将细胞接种于 12 孔板中，接种密度为 2.8 × 105 个细胞/孔。
    注意：所有细胞消化和换液操作均在生物安全柜中进行，以避免细胞污染。
  3. 过夜培养（约 10 小时）后，吸除细胞培养基，然后每孔用 1 mL 无血清培养基洗涤细胞两次。
  4. 将 12 孔细胞培养板从左至右分为四个不同的处理组，分别为：(1) 对照组，(2) PD 处理组，(3) PA 处理组，以及 (4) PA + PD 处理组。
    注意：每个实验处理组设置三个重复，位于同一块 12 孔板上，从上至下排列。
  5. 向对照组和 PD 处理组中加入正常细胞培养基（1 mL/孔），向 PA 处理组和 PA + PD 处理组中加入含 300 µM PA 的正常细胞培养基（1 mL/孔）。
  6. 培养 24 小时后，吸除细胞培养基，然后每孔用 1 mL 无血清培养基洗涤细胞两次。
  7. 向对照组中加入含溶剂（二甲基亚砜，DMSO，0.1% v/v）的正常细胞培养基（1 mL/孔）；向 PD 处理组中加入含 1 µM PD 的正常细胞培养基（1 mL/孔）；向 PA 处理组中加入含 300 µM PA 的正常细胞培养基（1 mL/孔）；向 PA + PD 处理组中加入含 300 µM PA 和 1 µM PD 的正常细胞培养基（1 mL/孔）。
  8. 继续培养 24 小时后，通过 2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色（步骤 2）、JC-1 染色（步骤 3）和蛋白质印迹法（Western blotting，步骤 4）检测 PD 对细胞的保护作用。
    ​注意：所有培养操作均在 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中进行。

2. 活性氧生成变化的测定

注意：细胞内活性氧（ROS）水平的检测基于DCFH-DA染色法。

  1. 在处理期结束时（步骤 1.8），每孔用 1 mL 磷酸盐缓冲液（1× PBS，pH 7.4）洗涤细胞三次，然后每孔加入 100 µL 10 µM DCFH-DA 进行染色（参见材料表）。将细胞置于避光条件下孵育 30 分钟。
    注意：若孵育 30 分钟后未观察到明显的绿色荧光，可适当延长探针与细胞的孵育时间（30–60 分钟）；若孵育 30 分钟后绿色荧光信号过强，则可适当缩短孵育时间（15–30 分钟）。
  2. 用 1× PBS（1 mL/孔）洗涤细胞三次，每孔加入 1 mL 1× PBS。
  3. 将 12 孔板置于显微镜载物台上（参见材料表），使用 20 倍物镜观察细胞形态（放大倍数：200 倍）。
  4. 在荧光显微镜下，使用激发波长为 480 nm、发射波长为 530 nm 的绿色荧光通道，为每个孔拍摄三张具有代表性的荧光图像（放大倍数：200 倍）。
    注意：推荐使用激发波长 480 nm、发射波长 530 nm 的绿色荧光通道检测 DCFH-DA。此外，也可采用荧光显微镜中用于 GFP 和 FITC 的参数设置来检测 DCFH-DA35,36。
  5. 最后，使用图像采集软件处理图像（参见材料表），然后利用 ImageJ 软件计算各组的平均荧光强度或不同组之间的荧光强度比值。
    ​注意：用于成像的荧光显微镜及 ImageJ 软件的技术细节此前已有描述37,38。

3. 线粒体膜电位变化的测定

注意：线粒体膜电位的变化通过 JC-1 染色实验进行监测。

  1. 在处理期结束时（步骤 1.8），用 1 mL 的 1× PBS 每孔洗涤细胞三次，然后每孔加入 100 µL 浓度为 5 µg/mL 的 JC-1 工作液（见材料表），在 37 °C 避光孵育 30 分钟。
    注意：若孵育 30 分钟后未观察到明显的绿色荧光，可适当延长探针与细胞的孵育时间（30–60 分钟）；若孵育 30 分钟后绿色荧光信号过强，则可适当缩短孵育时间（15–30 分钟）。
  2. 用 1× PBS（1 mL/孔）洗涤细胞三次，每孔加入 1 mL 的 1× PBS。
  3. 将 12 孔板置于显微镜载物台上，使用 20 倍物镜观察细胞形态（放大倍数：200 倍）。
  4. 在荧光显微镜下，对每孔采集三张具有代表性的荧光图像（放大倍数：200 倍），分别使用绿色荧光通道（激发波长 485 nm，发射波长 535 nm）和红色荧光通道（激发波长 550 nm，发射波长 600 nm）进行成像。
    注意：绿色荧光通道（激发波长 485 nm，发射波长 535 nm）用于检测 JC-1 单体，代表线粒体去极化状态39,40,41；红色荧光通道（激发波长 550 nm，发射波长 600 nm）用于检测 JC-1 二聚体，代表线粒体极化状态39,40,41。
  5. 最后，使用图像采集软件处理图像，然后利用 Image J 软件计算各组的平均荧光强度或不同组之间的荧光强度比值。
    ​注意：用于成像的荧光显微镜及 Image J 软件的技术细节此前已有描述37,38。

4. LC3-II/LC3-I 和 p62/SQSTM1 蛋白表达水平的测定

  1. 处理后（步骤 1.8），用预冷至 4 °C 的 1x PBS 洗涤细胞三次（1 mL/孔）。
  2. 向 12 孔板中加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（1x）的 RIPA 裂解缓冲液（100 µL/孔）（参见材料表），冰上裂解 5 分钟。
  3. 将细胞裂解液收集至 1.5 mL 微量离心管中，在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 20 分钟。采用 BCA 法按照标准操作程序测定上清液中的蛋白浓度42。
  4. 向细胞裂解液上清中加入 SDS-PAGE 样品上样缓冲液（5x，参见材料表）（体积比 = 1:4）。
  5. 涡旋混匀（高速约 15 秒），然后将混合样品在 100 °C 加热 5 分钟以使蛋白变性。
  6. 将已制备好的 12 孔 12% SDS-PAGE 凝胶放入电泳槽中，然后加入用超纯水稀释的 SDS 上样缓冲液（1x）至液面达到限高位置。
    注：SDS-PAGE 凝胶根据制造商说明书使用商用试剂盒制备（参见材料表）。
  7. 将蛋白 Marker（5 µL/孔）和样品（20 µg/孔）分别加入 SDS-PAGE 凝胶的不同加样孔中。
  8. 设定恒定电压为 100 V，电泳运行 80 分钟。
  9. SDS-PAGE 电泳结束后，参照已发表文献43,44，将蛋白电转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（0.45 µm，参见材料表）。
  10. 蛋白电转完成后，在室温下于摇床上用 10 mL TBST（1x TBS，0.1% Tween 20）洗涤 PVDF 膜两次（每次 5 分钟）。
  11. 在室温下于摇床上用 5 mL 牛血清白蛋白（BSA，5%）封闭 PVDF 膜 1 小时。
  12. 用 10 mL TBST 在室温下洗涤 PVDF 膜三次（每次 10 分钟）。然后将 PVDF 膜与用封闭缓冲液稀释的特异性一抗在 4 °C 孵育过夜：LC3（小鼠单克隆抗体，1:2,000）、p62/SQSTM1（后文简称 p62，小鼠单克隆抗体，1:2,000）和 β-actin（小鼠单克隆抗体，1:2,000）（参见材料表）。
  13. 在室温下用 10 mL TBST 洗涤 PVDF 膜三次（每次 10 分钟）。然后在避光条件下，于室温下用封闭缓冲液稀释的兔抗小鼠 IgG（HRP）二抗（1:10,000）（参见材料表）孵育 PVDF 膜 2 小时。
  14. 在室温下用 10 mL TBST 洗涤 PVDF 膜三次（每次 10 分钟）。然后将 PVDF 膜置于塑料膜上，加入适量 ECL 显色工作液（200 µL/膜）（参见材料表），孵育 2 分钟。
  15. 孵育后，去除 ECL 显色工作液，将 PVDF 膜放入成像系统进行图像采集。最后使用 Image J 软件分析各条带的灰度值。
    ​注：Western blot 实验技术细节及用于成像分析的 Image J 软件操作已在先前文献中详细描述45,46。

5. 统计学分析

  1. 以均值 ± 标准差（SD）表示实验数据。
  2. 使用先前所述的统计软件工具进行显著性分析47.
  3. 使用统计学方法计算两组之间的差异 t-测试。A P- 值小于 0.05 被认为具有统计学显著性：*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005.

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结果

细胞内活性氧水平
AML-12 细胞用 300 µM 棕榈酸（PA）诱导 24 小时，建立非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）细胞模型。随后，细胞经 PD 处理 24 小时。采用 DCFH-DA 荧光探针标记细胞，并在荧光显微镜下观察活性氧（ROS）的生成。细胞内 ROS 的 DCFH-DA 染色结果如 图 1 所示。结果显示，与仅用 300 µM PA 孵育的细胞相比，PD 能显著降低细胞内 ROS 水平（P < 0.01），表明 PD 可减轻细胞氧化应激。

细胞线粒体膜电位
线粒体是由内源性凋亡通路调控的核心细胞器48,49,50。因此，在经JC-1染色后，通过荧光显微镜观察经PD处理24 h的AML-12细胞的线粒体膜电位（MMP...

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讨论

研究表明，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种临床病理综合征，其疾病谱从单纯性脂肪肝延伸至非酒精性脂肪性肝炎（NASH），并可进一步发展为肝硬化和肝癌51高脂饮食和久坐不动的生活方式是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的常见风险因素。目前已有针对NAFLD治疗的非药物疗法和药物疗法的相关研究。51,52,53然而，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发病机制尚未完全阐明。本文所述方法涉及一种 体外 通过棕榈酸（PA）刺激AML-12细胞建立的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型。我们在该模型中研究了PD对NAFLD的保护作用，发现PD可减轻PA诱导的活性氧（ROS）水平升高。此外，PD还能改善PA引起的线粒体膜电位（MMP）去极化。进一步研究表明，PD可显著降低p62蛋白表达水平，并提高LC3-II/LC3-I比值。这些实验结果为将PD作为治疗NAFLD的活性药物成分的应用提供了依据。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到重庆市科学技术委员会（cstc2020jxjl-jbky10002、jbky20200026、cstc2021jscx-dxwtBX0013 和 jbky20210029）以及中国博士后科学基金会（编号：2021MD703919）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5% BSA封闭缓冲液Solarbio，北京，中国SW3015
AML12（alpha mouse liver 12）细胞系普罗赛生命科学&安普科技有限公司，中国AML12
Beyo ECL 加中国上海碧云天生物技术有限公司P0018S
生物安全柜Esco Micro Pte Ltd，新加坡AC2-5S1 A2 
cellSens奥林巴斯，日本东京1.8
CO2 培养箱Esco Micro Pte Ltd，新加坡CCL-170B-8
地塞米松中国上海碧云天生物技术有限公司ST125
二甲基亚砜Solarbio，北京，中国D8371
DMEM/F12Hyclone 洛根, 中国台湾 美国SH30023.01
胎牛血清Hyclone，新西兰陶朗加SH30406.05
Graphpad 软件GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥8.0
HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）ABclonal，中国武汉AS003
疏水性PVDF转印膜默克，德国达姆施塔特IPFL00010
胰岛素、转铁蛋白、硒溶液，100×中国上海碧云天生物技术有限公司C0341
MAP LC3β 抗体Santa Cruz Biotechnology（上海）有限公司SC-376404
JC-1线粒体膜电位检测试剂盒Solarbio，北京，中国M8650
奥林巴斯倒置显微镜 IX53奥林巴斯，日本东京IX53
棕榈酸德国 SigmaP0500
青霉素-链霉素溶液（100倍浓缩）Hyclone 洛根, 犹他州 美国SV30010
苯甲基磺酰基 氟化物中国上海碧云天生物技术有限公司ST506
磷酸盐缓冲液Hyclone 洛根, 犹他州 美国BL302A
桔梗皂苷D成都微斯生物科技有限公司，中国CSA：58479-68-8
通用蛋白酶抑制剂混合物，100倍浓缩液中国上海碧云天生物技术有限公司P1005
蛋白分子量标准Solarbio，北京，中国PR1910
活性氧检测试剂盒Solarbio，北京，中国CA1410
RIPA 裂解 缓冲液中国上海碧云天生物技术有限公司P0013E
SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒中国上海碧云天生物技术有限公司P0012AC
5× SDS-PAGE样品上样缓冲液中国上海碧云天生物技术有限公司P0015
Sigma 离心机德国 Sigma3K15
SQSTM1/p62 抗体Santa Cruz Biotechnology（上海）有限公司SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO  Tecan Austria GmbH，奥地利1510002987
WB 转膜缓冲液，10xSolarbio，北京，中国D1060
β-肌动蛋白小鼠单克隆抗体ABclonal，中国武汉AC004

参考文献

  1. Xunyan, X. Y., Fang, X. M. The effect of Platycodon grandiflorum and its historical change in the clinical application of Platycodonis radix. Zhonghua Yi Shi Za Shi. 51 (3), 167-176 (2021).
  2. Ma, X., et al. Platycodon grandiflorum extract: Chemical composition and whitening, antioxidant, and anti-inflammatory effects. RSC Advances. 11 (18), 10814-10826 (2021).
  3. Ke, W., et al. Dietary Platycodon grandiflorus attenuates hepatic insulin resistance and oxidative stress in high-fat-diet induced non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 12 (2), 480(2020).
  4. Kim, Y. J., et al. Platycodon grandiflorus root extract attenuates body fat mass, hepatic steatosis and insulin resistance through the interplay between the liver and adipose tissue. Nutrients. 8 (9), 532(2016).
  5. Park, H. M., et al. Mass spectrometry-based metabolomic and lipidomic analyses of the effects of dietary Platycodon grandiflorum on liver and serum of obese mice under a high-fat diet. Nutrients. 9 (1), 71(2017).
  6. Qi, C., et al. Platycodon grandiflorus polysaccharide with anti-apoptosis, anti-oxidant and anti-inflammatory activity against LPS/D-GalN induced acute liver injury in mice. Journal of Polymers and the Environment. 29 (12), 4088-4097 (2021).
  7. Choi, J. H., et al. Saponins from the roots of Platycodon grandiflorum ameliorate high fat diet-induced non-alcoholic steatohepatitis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 86, 205-212 (2017).
  8. Choi, Y. J., et al. Platycodin D enhances LDLR expression and LDL uptake via down-regulation of IDOL mRNA in hepatic cells. Scientific Reports. 10, 19834(2020).
  9. Li, T., et al. Platycodin D triggers autophagy through activation of extracellular signal-regulated kinase in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. European Journal of Pharmacology. 749, 81-88 (2015).
  10. Lu, J. -J., et al. Proteomic analysis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells treated with platycodin D. Chinese Journal of Natural Medicines. 13 (9), 673-679 (2015).
  11. Neuschwander-Tetri, B. A. Therapeutic landscape for NAFLD in 2020. Gastroenterology. 158 (7), 1984-1998 (2020).
  12. Friedman, S. L., Neuschwander-Tetri, B. A., Rinella, M., Sanyal, A. J. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nature Medicine. 24 (7), 908-922 (2018).
  13. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (1), 99-128 (2019).
  14. Buzzetti, E., Pinzani, M., Tsochatzis, E. A. The multiple-hit pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Metabolism. 65 (8), 1038-1048 (2016).
  15. Watt, M. J., Miotto, P. M., De Nardo, W., Montgomery, M. K. The liver as an endocrine organ-Linking NAFLD and insulin resistance. Endocrine Reviews. 40 (5), 1367-1393 (2019).
  16. Khan, R. S., Bril, F., Cusi, K., Newsome, P. N. Modulation of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 70 (2), 711-724 (2019).
  17. Karkucinska-Wieckowska, A., et al. Mitochondria, oxidative stress and nonalcoholic fatty liver disease: A complex relationship. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), 13622(2022).
  18. Tilg, H., Adolph, T. E., Dudek, M., Knolle, P. Non-alcoholic fatty liver disease: The interplay between metabolism, microbes and immunity. Nature Metabolism. 3 (12), 1596-1607 (2021).
  19. Qian, H., et al. Autophagy in liver diseases: A review. Molecular Aspects of Medicine. 82, 100973(2021).
  20. Du, J., Ji, Y., Qiao, L., Liu, Y., Lin, J. Cellular endo-lysosomal dysfunction in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Liver International. 40 (2), 271-280 (2020).
  21. Allaire, M., Rautou, P. E., Codogno, P., Lotersztajn, S. Autophagy in liver diseases: Time for translation. Journal of Hepatology. 70 (5), 985-998 (2019).
  22. Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11963-11980 (2013).
  23. Lau, J. K., Zhang, X., Yu, J. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease: Current perspectives and recent advances. The Journal of Pathology. 241 (1), 36-44 (2017).
  24. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: Lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  25. Carpino, G., et al. Increased liver localization of lipopolysaccharides in human and experimental NAFLD. Hepatology. 72 (2), 470-485 (2020).
  26. Vergani, L. Fatty acids and effects on in vitro and in vivo models of liver steatosis. Current Medicinal Chemistry. 26 (19), 3439-3456 (2019).
  27. Scorletti, E., Carr, R. M. A new perspective on NAFLD: Focusing on lipid droplets. Journal of Hepatology. 76 (4), 934-945 (2022).
  28. Green, C. J., Pramfalk, C., Morten, K. J., Hodson, L. From whole body to cellular models of hepatic triglyceride metabolism: Man has got to know his limitations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (1), 1-20 (2015).
  29. Gambino, R., et al. Different serum free fatty acid profiles in NAFLD subjects and healthy controls after oral fat load. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 479(2016).
  30. Marra, F., Svegliati-Baroni, G. Lipotoxicity and the gut-liver axis in NASH pathogenesis. Journal of Hepatology. 68 (2), 280-295 (2018).
  31. Zhang, J., Zhang, H., Deng, X., Zhang, Y., Xu, K. Baicalin protects AML-12 cells from lipotoxicity via the suppression of ER stress and TXNIP/NLRP3 inflammasome activation. Chemico-Biological Interactions. 278, 189-196 (2017).
  32. Liang, Y., et al. γ-Linolenic acid prevents lipid metabolism disorder in palmitic acid-treated alpha mouse liver-12 cells by balancing autophagy and apoptosis via the LKB1-AMPK-mTOR pathway. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (29), 8257-8267 (2021).
  33. Peng, Z., et al. Nobiletin alleviates palmitic acid-induced NLRP3 inflammasome activation in a sirtuin 1dependent manner in AML12 cells. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5815-5822 (2018).
  34. Xu, T., et al. Ferulic acid alleviates lipotoxicity-induced hepatocellular death through the SIRT1-regulated autophagy pathway and independently of AMPK and Akt in AML-12 hepatocytes. Nutrition & Metabolism. 18 (1), 13(2021).
  35. Aranda, A., et al. Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay: A quantitative method for oxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells. Toxicology in Vitro. 27 (2), 954-963 (2013).
  36. Eruslanov, E., Kusmartsev, S. Identification of ROS using oxidized DCFDA and flow-cytometry. Methods in Molecular Biology. 594, 57-72 (2010).
  37. Bankhead, P. Analyzing Fluorescence Microscopy Images with ImageJ. , Queen's University Belfast. Belfast, Ireland. (2014).
  38. Wiesmann, V., et al. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
  39. Lugli, E., Troiano, L., Cossarizza, A. Polychromatic analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 7, Unit 7.32 (2007).
  40. Sivandzade, F., Bhalerao, A., Cucullo, L. Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a sensitive fluorescent probe. Bio-protocol. 9 (1), 3128(2019).
  41. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  42. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).
  43. Goldman, A., Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current Protocols in Protein Science. 82, 1-16 (2015).
  44. Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Proteins from polyacrylamide gels onto PVDF membranes. Current Research in Protein Chemistry. , 87(2012).
  45. Davarinejad, H. Quantifications of western blots with ImageJ. University of York. , Available from: http://www.yourku.ca/yisheng/internal/Protocols/Imagej.pdf (2015).
  46. Taylor, S. C., Posch, A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Research International. 2014, 361590(2014).
  47. Motulsky, H. J. Graphpad Statistics Guide. Options for multiple t tests. Graphpad. , (2020).
  48. Poltorak, A. Cell death: All roads lead to mitochondria. Current Biology. 32 (16), 891-894 (2022).
  49. Dadsena, S., Jenner, A., García-Sáez, A. J. Mitochondrial outer membrane permeabilization at the single molecule level. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3777-3790 (2021).
  50. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305 (5684), 626-629 (2004).
  51. Lange, N. F., Radu, P., Dufour, J. F. Prevention of NAFLD-associated HCC: Role of lifestyle and chemoprevention. Journal of Hepatology. 75 (5), 1217-1227 (2021).
  52. Liu, X., Zhang, Y., Ma, C., Lin, J., Du, J. Alternate-day fasting alleviates high fat diet induced non-alcoholic fatty liver disease through controlling PPARalpha/Fgf21 signaling. Molecular Biology Reports. 49 (4), 3113-3122 (2022).
  53. Romero-Gomez, M., Zelber-Sagi, S., Trenell, M. Treatment of NAFLD with diet, physical activity and exercise. Journal of Hepatology. 67 (4), 829-846 (2017).
  54. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  55. Cui, B., Yu, J. M. Autophagy: A new pathway for traditional Chinese medicine. Journal of Asian Natural Products Research. 20 (1), 14-26 (2018).
  56. Law, B. Y., et al. New potential pharmacological functions of Chinese herbal medicines via regulation of autophagy. Molecules. 21 (3), 359(2016).
  57. Zhou, H., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine monomer for treatment of non-alcoholic fatty liver disease. European Journal of Pharmacology. 898, 173976(2021).
  58. Zhang, L., Yao, Z., Ji, G. Herbal extracts and natural products in alleviating non-alcoholic fatty liver disease via activating autophagy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1459(2018).
  59. Zhang, X., et al. C-X-C motif chemokine 10 impairs autophagy and autolysosome formation in non-alcoholic steatohepatitis. Theranostics. 7 (11), 2822-2836 (2017).
  60. Li, C. X., et al. Allyl isothiocyanate ameliorates lipid accumulation and inflammation in nonalcoholic fatty liver disease via the Sirt1/AMPK and NF-kappaB signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 25 (34), 5120-5133 (2019).
  61. Li, S., et al. Sirtuin 3 acts as a negative regulator of autophagy dictating hepatocyte susceptibility to lipotoxicity. Hepatology. 66 (3), 936-952 (2017).
  62. Farrell, G. C., Teoh, N. C., McCuskey, R. S. Hepatic microcirculation in fatty liver disease. The Anatomical Record. 291 (6), 684-692 (2008).
  63. Milner, E., et al. Emerging three-dimensional hepatic models in relation to traditional two-dimensional in vitro assays for evaluating drug metabolism and hepatoxicity. Medicine in Drug Discovery. 8, 100060(2020).
  64. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: State of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  65. Bilson, J., Sethi, J. K., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A multi-system disease influenced by ageing and sex, and affected by adipose tissue and intestinal function. Proceedings of the Nutrition Society. 81 (2), 146-161 (2022).

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