接触模式原子力显微镜作为一种快速进行形态观察与细菌细胞损伤分析的技术

摘要

本文介绍了原子力显微镜（AFM）在细菌表征中的应用，作为一种简便快速的方法，可用于分析细菌的大小和形态、细菌培养形成的生物膜，以及纳米颗粒作为杀菌剂的活性等细节。

摘要

电子显微镜是表征细胞结构所需的工具之一。然而，由于观察前需要进行复杂的样品制备，该方法过程繁琐且成本较高。原子力显微镜（AFM）是一种非常有用的表征技术，因其在三维空间中具有高分辨率，并且无需真空环境和样品导电性。AFM 能够对具有不同形貌和不同类型材料的多种样品进行成像。

原子力显微镜（AFM）可提供从埃米级到微米尺度的高分辨率三维形貌信息。与传统显微镜不同，AFM利用探针扫描样品表面，从而生成表面形貌图像。本实验方案建议将此类显微技术用于固定在载体上的细菌的形态学及细胞损伤特征分析。实验中使用的菌株包括Staphylococcus aureus（ATCC 25923）、Escherichia coli（ATCC 25922）以及从大蒜鳞茎样品中分离得到的Pseudomonas hunanensis。在本研究中，细菌细胞在特定培养基中培养。为观察细胞损伤情况，将Staphylococcus aureus和Escherichia coli与不同浓度的纳米颗粒（NPs）共同孵育。

将一滴细菌悬液固定在玻璃基底上，并使用原子力显微镜（AFM）在不同尺度下进行成像。所获得的图像展示了细菌的形态学特征。此外，利用原子力显微镜可以观察到纳米颗粒（NPs）作用导致的细胞结构损伤。根据所获得的图像，接触式原子力显微镜可用于表征固定在基底上的细菌细胞的形态。原子力显微镜也是研究纳米颗粒对细菌影响的合适工具。与电子显微镜相比，原子力显微镜是一种成本较低且易于使用的检测技术。

引言

17世纪，安东尼·范·列文虎克首次观察到不同的细菌形态¹。自远古以来，细菌就呈现出多种多样的形态，从球形到分枝状细胞均有存在²。细胞形态是细菌分类学家描述和分类每种细菌物种的基本依据，主要用于形态学上区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌门³。目前已知有多种因素决定细菌细胞的形态，这些因素均参与细胞包被和支撑结构，包括细胞壁和细胞膜的组分以及细胞骨架。因此，科学家们仍在深入研究涉及细菌细胞形态决定的化学、生物化学和物理机制与过程，而这些过程均由决定细菌形态的基因簇所控制^2,4。

此外，科学家已证实，杆状很可能是细菌细胞的原始形态，因为这种细胞形态在与细胞功能密切相关的参数上表现出最优特性。因此，球菌、螺旋状、弧菌、丝状及其他形态被视为对不同环境的适应；事实上，特定形态已独立演化多次，表明细菌的形态可能是对特定环境的适应结果^3,5。然而，在整个细菌细胞生命周期中，细胞形态会发生变化，这种变化也是细胞对有害环境条件产生的遗传响应³。细菌细胞的形态和大小在很大程度上决定....

方案

1. 细菌的分离与鉴定

1. 从大蒜鳞茎分生组织中分离内生菌株：
   1. 将先前去皮、消毒并切割的大蒜鳞茎的分生组织切成 2 mm 的小片段，接种于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基上作为富集培养基，在 25 °C 下培养 1 天。
   2. 根据细菌菌落的形态差异——包括形状、大小、颜色、边缘、透射光、反射光、质地、稠度及色素产生情况——描述所观察到的不同形态类型，并通过十字划线法对每种形态类型的代表性菌落进行纯化。
   3. 将所有纯化后的细菌菌株保存在含 30% 甘油的溶液中，置于 −80 °C 下保藏。
   4. 通过测序 16S rDNA 鉴定随机选取的一株菌（9AP）。采用 Hoffman 和 Winston⁸ 的方法提取 DNA。
   5. 使用聚合酶链式反应（PCR）扩增 16S rRNA，反应体系包含：100 ng DNA、1× 聚合酶缓冲液、4 mM MgCl₂、0.4 mM dNTPs、27F/1492r 通用寡核苷酸引物各 10 pmol，以及 1 U DNA 聚合酶⁹。PCR 热循环程序如下：95 °C 预变性 5 min；随后进行 35 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 1 min、56 °C 退火 1 min、72 °C 延伸 1 min；最后在 72 °C 延伸 1....

结果

S. aureus 和 P. hunanensis 菌株的形态、大小以及两种菌株的群体结构图像通过原子力显微镜接触模式拍摄获得。S. aureus 的图像显示，其群体以区域形式分布，包含成簇的球菌（图1A）。随着放大倍数的增加，菌群分布及球菌形态的细节更加清晰可见（图1B）。显微分析结果表明，S. aureus 相邻细胞间存在类半球状结构，但总体而言，细菌在分裂后呈典型的球菌状球形形态，这与原子力显微镜图像中先前观察到的结果一致。此外，原子力显微镜接触模式图像可用于测定球菌的尺寸，结果显示其平均宽度为 1.25 µm。对 20 个细胞进行测量所得的数据如 图2 所示。

P. hunanensis在玻璃载体表面呈现均匀分布，形成附着于载体上的细菌单层（图3A）.......

讨论

显微技术是生物实验室中常用的一种方法，可用于研究生物样本的结构、大小、形态以及细胞排列方式。为了改进该技术，可采用多种不同类型的显微镜，这些显微镜在光学或电子特性上有所差异，从而决定了仪器的分辨能力。

在科学研究中，表征细菌细胞需要使用显微镜技术；例如，显微镜已证明NaCl会影响大肠杆菌（E. coli）菌株的耐热性及细胞形态，五味子（Schisandra chinensis）提取物对金黄色葡萄球菌（S. aureus）具有抑菌作用，金黄色葡萄球菌（S. aureus）在亚致死热激后会产生耐热性，以及大肠杆菌（E. coli）能够生物矿化铂^{23,24,25,26,27}。因.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AFM EasyScan 2	NanoSurf	已停产	测量介质
细菌接种环	不适用	不适用	用于细菌接种的仪器
BigDye Terminator v3.1	ThermoFisher Scientific	4337455	矩阵安装试剂盒
Bioedit	不适用	版本 7.2.5	序列比对编辑器
Cary 60 分光光度计	Agilent Technologies	不适用
头孢曲松	Merck	不适用	抗生素
离心机	Eppendorf	不适用	用于去除干扰原子力显微镜（AFM）检测的颗粒
ContAI-G 硅悬臂梁	BudgetSensors	ContAl-G-10	测量介质
伊红美蓝琼脂	Merck	不适用	细菌培养基
Escherichia coli	美国模式培养物集存库	ATCC 25922	细菌菌株
GoTaq Flexi DNA 聚合酶	Promega	M8295	16S rRNA 基因的 PCR 扩增
微孔板	Thermo Scientific	10558295	用于微量稀释分析
Müller-Hinton 肉汤	Merck	不适用	细菌培养基
营养琼脂	Merck	不适用	细菌培养基
营养肉汤	Merck	不适用	细菌培养基
培养皿	不适用	不适用	用于细菌培养
Pseudomonas hunanensis 9AP	不适用	不适用	由中国国家资源库（CNRG）从大蒜鳞茎中分离获得
Sanger 测序	Macrogen	不适用	测序服务
ScienceDesk 抗振动工作台	ThorLabs
载玻片	不适用	不适用	用于细菌样品分析的玻璃载体
Staphylococcus aureus	美国模式培养物集存库	ATCC 25923	细菌菌株
热循环仪	Applied Biosystems	Veriti-4375786	PCR 扩增
胰蛋白胨大豆琼脂	BD	BA-256665	培养基
超声波破碎仪	Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC	不适用	用于混合纳米颗粒稀释液