本文介绍了原子力显微镜（AFM）在细菌表征中的应用，作为一种简便快速的方法，可用于分析细菌的大小和形态、细菌培养形成的生物膜，以及纳米颗粒作为杀菌剂的活性等细节。
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摘要
摘要
电子显微镜是表征细胞结构所需的工具之一。然而，由于观察前需要进行复杂的样品制备，该方法过程繁琐且成本较高。原子力显微镜（AFM）是一种非常有用的表征技术，因其在三维空间中具有高分辨率，并且无需真空环境和样品导电性。AFM 能够对具有不同形貌和不同类型材料的多种样品进行成像。
原子力显微镜（AFM）可提供从埃米级到微米尺度的高分辨率三维形貌信息。与传统显微镜不同，AFM利用探针扫描样品表面，从而生成表面形貌图像。本实验方案建议将此类显微技术用于固定在载体上的细菌的形态学及细胞损伤特征分析。实验中使用的菌株包括Staphylococcus aureus（ATCC 25923）、Escherichia coli（ATCC 25922）以及从大蒜鳞茎样品中分离得到的Pseudomonas hunanensis。在本研究中，细菌细胞在特定培养基中培养。为观察细胞损伤情况，将Staphylococcus aureus和Escherichia coli与不同浓度的纳米颗粒（NPs）共同孵育。
将一滴细菌悬液固定在玻璃基底上，并使用原子力显微镜（AFM）在不同尺度下进行成像。所获得的图像展示了细菌的形态学特征。此外，利用原子力显微镜可以观察到纳米颗粒（NPs）作用导致的细胞结构损伤。根据所获得的图像，接触式原子力显微镜可用于表征固定在基底上的细菌细胞的形态。原子力显微镜也是研究纳米颗粒对细菌影响的合适工具。与电子显微镜相比，原子力显微镜是一种成本较低且易于使用的检测技术。
引言
17世纪，安东尼·范·列文虎克首次观察到不同的细菌形态1。自远古以来，细菌就呈现出多种多样的形态，从球形到分枝状细胞均有存在2。细胞形态是细菌分类学家描述和分类每种细菌物种的基本依据，主要用于形态学上区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌门3。目前已知有多种因素决定细菌细胞的形态，这些因素均参与细胞包被和支撑结构，包括细胞壁和细胞膜的组分以及细胞骨架。因此，科学家们仍在深入研究涉及细菌细胞形态决定的化学、生物化学和物理机制与过程，而这些过程均由决定细菌形态的基因簇所控制2,4。
此外，科学家已证实，杆状很可能是细菌细胞的原始形态，因为这种细胞形态在与细胞功能密切相关的参数上表现出最优特性。因此，球菌、螺旋状、弧菌、丝状及其他形态被视为对不同环境的适应；事实上，特定形态已独立演化多次，表明细菌的形态可能是对特定环境的适应结果3,5。然而，在整个细菌细胞生命周期中，细胞形态会发生变化，这种变化也是细胞对有害环境条件产生的遗传响应3。细菌细胞的形态和大小在很大程度上决定了其刚度、稳定性以及表面积与体积的比值，这一特性可被应用于生物技术过程6。
电子显微镜因其可实现远超光学显微镜的高倍放大，被用于研究生物样品。透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）是该领域最常用的技术；然而，样品在放入显微镜腔室前需经过一定处理，以获得合适的图像。样品需要镀金，且整个图像采集时间不宜过长。相比之下，原子力显微镜（AFM）是一种广泛用于表面分析的技术，同时也被应用于生物样品的研究。
原子力显微镜（AFM）在表面分析中具有多种工作模式，例如接触模式、非接触模式或轻敲模式、磁力显微镜（MFM）、导电型原子力显微镜（conductive AFM）、压电力显微镜（PFM）、峰值力轻敲（PFT）、接触共振和力体积成像。每种模式均用于材料分析，可提供关于材料表面及其力学与物理特性的不同信息。然而，部分AFM模式专门用于生物样品的分析。 体外，例如压电力显微技术（PFT），因为PFT能够在液体环境中获取细胞的形貌和力学数据7.
在本研究中，我们采用了每台传统且简单的原子力显微镜（AFM）均具备的最基本模式——接触模式。AFM利用一个尖锐的探针（直径约为<50 nm）扫描小于100 µm的区域。探针与样品对齐，以与其相关的力场发生相互作用。通过探针在样品表面扫描并保持作用力恒定，同时监测悬臂在表面移动时的运动情况，从而生成样品表面的图像。所获取的信息可提供样品表面的纳米力学性质，例如黏附性、弹性、黏度和剪切特性。
在原子力显微镜（AFM）接触模式下，探针悬臂在样品表面以固定的偏转程度进行扫描。这种方法能够确定样品的高度（Z），相较于其他电子显微技术具有优势。AFM 软件通过探针尖端与样品表面之间的相互作用，可生成三维图像扫描结果，而尖端的偏转程度通过激光和检测器与样品的高度相关联。
在静态模式（接触模式）下以恒定力操作时，输出呈现两种不同的图像：高度（z向形貌）和偏转或误差信号。静态模式是一种有价值的、简单的成像模式，特别适用于在空气中能够承受该模式施加的高负载和扭转力的坚固样品。偏转或误差模式在恒定力模式下运行。然而，通过将偏转信号叠加到表面结构上，可进一步增强形貌图像。在此模式中，偏转信号也被称为误差信号，因为偏转是反馈参数；该通道中出现的任何特征或形貌均源于反馈回路中的"误差"，或者更准确地说，是由于需要维持恒定偏转设定点而产生的反馈回路所致。
原子力显微镜（AFM）独特的设计使其结构紧凑——体积小到可放置于实验台面上，同时具备足够高的分辨率以分辨原子级台阶。AFM 设备的成本低于其他电子显微镜设备，且维护成本极低。该显微镜无需在具备特殊条件（如洁净室或隔振空间）的实验室中使用，仅需一张无振动的实验台即可。对于 AFM 而言，样品无需像其他技术那样进行复杂的制备处理（如镀金、减薄），只需将干燥的样品固定在样品台上即可。
我们采用原子力显微镜接触模式观察细菌形态及纳米颗粒的影响。可观察固定在载体上的细菌种群及其细胞形态，以及纳米颗粒对细菌物种造成的细胞损伤。原子力显微镜接触模式获得的图像证实，该方法是一种强大的工具，不受试剂和复杂操作步骤的限制，是一种简单、快速且经济的细菌表征方法。
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方案
1. 细菌的分离与鉴定
- 从大蒜鳞茎分生组织中分离内生菌株：
- 将先前去皮、消毒并切割的大蒜鳞茎的分生组织切成 2 mm 的小片段，接种于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基上作为富集培养基，在 25 °C 下培养 1 天。
- 根据细菌菌落的形态差异——包括形状、大小、颜色、边缘、透射光、反射光、质地、稠度及色素产生情况——描述所观察到的不同形态类型，并通过十字划线法对每种形态类型的代表性菌落进行纯化。
- 将所有纯化后的细菌菌株保存在含 30% 甘油的溶液中，置于 −80 °C 下保藏。
- 通过测序 16S rDNA 鉴定随机选取的一株菌（9AP）。采用 Hoffman 和 Winston8 的方法提取 DNA。
- 使用聚合酶链式反应（PCR）扩增 16S rRNA，反应体系包含：100 ng DNA、1× 聚合酶缓冲液、4 mM MgCl2、0.4 mM dNTPs、27F/1492r 通用寡核苷酸引物各 10 pmol，以及 1 U DNA 聚合酶9。PCR 热循环程序如下：95 °C 预变性 5 min；随后进行 35 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 1 min、56 °C 退火 1 min、72 °C 延伸 1 min；最后在 72 °C 延伸 10 min。
- 使用相同的寡核苷酸引物对 PCR 产物进行毛细管测序；采用双脱氧末端终止法，配合毛细管测序用基质安装试剂盒10，并在自动化多毛细管电泳系统中进行电泳分析11。
- 手动编辑测得的序列，通过 BLAST 搜索与 GenBank 数据库比对，并以与最近物种序列相似性至少达到 98.7% 的“黄金标准”进行初步鉴定12,13。
注：菌株 9AP 被鉴定为属于Pseudomonas hunanensis物种，其与P. hunanensis LV 菌株（JX545210）序列的相似性达 99.86%。
2. 通过原子力显微镜进行形态学观察的细菌样品制备
- 在无菌条件下，将一滴细菌悬液（Pseudomonas hunanensis、Staphylococcus aureus）置于载玻片上。
- 通过干热法固定载玻片上的样品。将载玻片在火焰上方轻轻通过数次，直至样品干燥。
注：样品固定是微生物学中的常规技术，用于观察固定的原核生物，并尽可能真实地模拟其活细胞结构。 - 将固定后的样品放入培养皿中，并送至原子力显微镜（AFM）设备进行观察。
注：由于样品可能随时间受环境条件影响而发生变化，建议在24小时内完成AFM设备的分析。保持样品免受灰尘污染。
3. 氧化镁纳米颗粒对细菌的抗菌作用
注意：MgO 纳米颗粒的合成与表征此前已有报道14。本研究中，纳米材料的抗菌活性根据临床与实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）手册，采用宏量稀释法和微量稀释法测定其抑制效果15,16。
- 最小抑菌活性（MIC）和杀菌浓度（CMB）的测定
- 菌株的预培养
- 将适量的 Escherichia coli 或 Staphylococcus aureus 接种至营养肉汤中，使终浓度达到 1 × 108 CFU/mL。
- 在 37 °C（± 2 °C）条件下培养悬浮液 18–24 小时。
- 适应性菌株的继代培养
- 将无菌细菌接种环浸入悬浮液中，并接触试管底部。
- 用接种环在伊红美蓝琼脂和营养琼脂平板上划线接种。
- 在 37 °C（± 2 °C）条件下培养琼脂平板 24 小时。
- 用于制备标准化接种物的菌落选择
- 用细菌接种环轻触培养皿中菌落顶部，选取三至五个形态相同的菌落。
- 将所选菌落转移并浸入 3–5 mL 的MH肉汤（Müller-Hinton broth）中。
- 在 37 °C（± 2 °C）下培养，使浊度达到 1 × 108 CFU/mL 或 2 × 108 CFU/mL。
注：本研究中使用McFarland比浊标准作为细菌悬浮液的参考标准；具体而言，0.5号标准大约相当于 1.5 × 108 个细胞/mL 的均匀 E. coli 悬浮液。使用紫外-可见分光光度计测定浊度。 - 取 1 mL 上述菌液加入 9 mL 无菌肉汤中，再取 200 µL 该稀释液加入 19.8 mL 无菌肉汤中，最终获得 5 × 105 CFU/mL 的浓度。
- 氧化镁纳米颗粒所需浓度的配制
- 使用超声波仪制备溶液。
- 将纳米材料悬浮于无菌水中，浓度为所需浓度的两倍，以制备系列稀释溶液。
- 将上述悬浮液加入含有MH肉汤的无菌试管中，以获得实验所需的新的浓度梯度。
注：微稀释实验中应用的MgO纳米颗粒浓度如下：30 ppm、60 ppm、120 ppm、250 ppm、500 ppm、1,000 ppm、2,000 ppm、3,000 ppm、4,000 ppm 和 8,000 ppm。
- 微稀释实验的制备15
- 准备一个新的无菌96孔微量滴定板（微孔板）。将微孔板第12列标记为无菌对照列，第11列为生长对照列。
- 向第1–10列各孔中加入120 µL不同浓度的纳米颗粒悬浮液。
- 向第1–10列各孔中接种120 µL细菌悬液（5 × 105 CFU/mL）。
注：本研究中，G行和H行为头孢曲松对照组，其浓度依据CLSI标准设定：8 ppm、4 ppm、2 ppm、1 ppm、0.5 ppm、0.25 ppm、0.125 ppm、0.06 ppm 和 0.03 ppm。 - 将96孔微孔板在37 °C（35 °C ± 2 °C）条件下培养24小时，最后观察各孔情况。
- 菌株的预培养
- 利用原子力显微镜（AFM）观察氧化镁纳米颗粒诱导的细菌菌株形态结构变化
- 从微稀释实验的各孔中取250 µL样品，与750 µL无菌水混合，在5 °C条件下以2,000 × g离心2至5分钟。
- 每次用1 mL无菌水洗涤沉淀物，共洗涤三次；洗涤结束后向沉淀中加入500 µL水。
- 为获取AFM图像，取每个起始孔最终悬浮液10–20 µL，在经超声清洗过的载玻片（清洗30分钟）上涂片，并在室温下干燥1小时。
4. 原子力显微镜测量
注意：此处使用的原子力显微镜在接触模式下安装于一个防震工作台，该工作台可将显微镜与任何机械振动源隔离，并保持系统水平。通过电源线滤波器和浪涌保护装置减少电干扰。此处使用的原子力显微镜可自动将激光束对准至光电探测器。
- 打开计算机和原子力显微镜（AFM），然后选择 接触模式，该 contAI-G探针，以及 自动斜率 软件工具中的选项。Z控制器的默认值为 设定值 = 20 nM, P增益 = 10,000, I-增益 = 1,000，D-增益 = 0，以及 尖端电压 = 0 mV.
- 将样品置于原子力显微镜接触模式下，使用一个 70 µm 扫描范围探头我们使用了弹簧常数为0.13 N/m的ContAI-G硅悬臂梁。
- 使用安装在扫描头内两个镜头上的相机设备，快速获取探头下方区域表面的图像。
- 手动在XY平面内移动，以选择目标区域。通过电子方式使探针接近样品表面，直至达到接触条件。通过减小XY方向的倾斜度，电子调节扫描器与样品表面的XY测量平面。
- 使用软件的标准参数： 每行256个点，每秒1行.
- 首先，对70 µm × 70 µm的区域进行全范围扫描；然后，使用 缩放工具原子力显微镜自动优化Z方向的图像范围。
注意：通过减少每秒扫描线数，总扫描时间会增加，扫描质量更加清晰，同时部分测量噪声也会被消除。 - 为从样品中选择新区域，需电子 retract 悬臂，并沿 XY 平面移动样品。使用步骤 4.5 和步骤 4.6 中所述程序进行新的扫描。
注意：所获得的扫描图像采用单色条形比例尺显示，其中浅色代表较高海拔，深色代表较低海拔。原子力显微镜（AFM）软件可生成扫描结果的三维视图，便于观察所测表面的细节。 - 使用以下方法进行数据处理 工具菜单中的逐行调平 滤波选择中图像的处理，这是最常用且最简单的均衡化方法。
注意：该平整化方法会对原子力显微镜图像中生成的每一条水平或垂直线进行多项式方程拟合。 - 优化右侧颜色条的最大值和最小值高度，以获得最佳图像分辨率。
- 使用以下方法进行图像分析 分析 在工具栏的菜单中选择所需工具后，通过选取起始点和终点来确定高度和距离。
注意：用户必须尝试该设备的不同滤光片 工具 菜单以避免因调平过程中使用的压平操作而导致的针尖图像伪影。图像伪影表现为条纹状线条，并在部分原子力显微镜（AFM）图像中可见。
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结果
S. aureus 和 P. hunanensis 菌株的形态、大小以及两种菌株的群体结构图像通过原子力显微镜接触模式拍摄获得。S. aureus 的图像显示，其群体以区域形式分布，包含成簇的球菌（图1A）。随着放大倍数的增加，菌群分布及球菌形态的细节更加清晰可见（图1B）。显微分析结果表明，S. aureus 相邻细胞间存在类半球状结构，但总体而言，细菌在分裂后呈典型的球菌状球形形态，这与原子力显微镜图像中先前观察到的结果一致。此外，原子力显微镜接触模式图像可用于测定球菌的尺寸，结果显示其平均宽度为 1.25 µm。对 20 个细胞进行测量所得的数据如 图2 所示。
P. hunanensis在玻璃载体表面呈现均匀分布，形成附着于载体上的细菌单层（图3A）...
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讨论
显微技术是生物实验室中常用的一种方法，可用于研究生物样本的结构、大小、形态以及细胞排列方式。为了改进该技术，可采用多种不同类型的显微镜，这些显微镜在光学或电子特性上有所差异，从而决定了仪器的分辨能力。
在科学研究中，表征细菌细胞需要使用显微镜技术；例如，显微镜已证明NaCl会影响大肠杆菌（E. coli）菌株的耐热性及细胞形态，五味子（Schisandra chinensis）提取物对金黄色葡萄球菌（S. aureus）具有抑菌作用，金黄色葡萄球菌（S. aureus）在亚致死热激后会产生耐热性，以及大肠杆菌（E. coli）能够生物矿化铂23,24,25,26,27。因...
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
Ramiro Muniz-Diaz 感谢 CONACyT 提供的奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | 已停产 | 测量介质 |
| 细菌接种环 | 不适用 | 不适用 | 用于细菌接种的仪器 |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | 矩阵安装试剂盒 |
| Bioedit | 不适用 | 版本 7.2.5 | 序列比对编辑器 |
| Cary 60 分光光度计 | Agilent Technologies | 不适用 | |
| 头孢曲松 | Merck | 不适用 | 抗生素 |
| 离心机 | Eppendorf | 不适用 | 用于去除干扰原子力显微镜（AFM）检测的颗粒 |
| ContAI-G 硅悬臂梁 | BudgetSensors | ContAl-G-10 | 测量介质 |
| 伊红美蓝琼脂 | Merck | 不适用 | 细菌培养基 |
| Escherichia coli | 美国模式培养物集存库 | ATCC 25922 | 细菌菌株 |
| GoTaq Flexi DNA 聚合酶 | Promega | M8295 | 16S rRNA 基因的 PCR 扩增 |
| 微孔板 | Thermo Scientific | 10558295 | 用于微量稀释分析 |
| Müller-Hinton 肉汤 | Merck | 不适用 | 细菌培养基 |
| 营养琼脂 | Merck | 不适用 | 细菌培养基 |
| 营养肉汤 | Merck | 不适用 | 细菌培养基 |
| 培养皿 | 不适用 | 不适用 | 用于细菌培养 |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | 不适用 | 不适用 | 由中国国家资源库（CNRG）从大蒜鳞茎中分离获得 |
| Sanger 测序 | Macrogen | 不适用 | 测序服务 |
| ScienceDesk 抗振动工作台 | ThorLabs | ||
| 载玻片 | 不适用 | 不适用 | 用于细菌样品分析的玻璃载体 |
| Staphylococcus aureus | 美国模式培养物集存库 | ATCC 25923 | 细菌菌株 |
| 热循环仪 | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR 扩增 |
| 胰蛋白胨大豆琼脂 | BD | BA-256665 | 培养基 |
| 超声波破碎仪 | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | 不适用 | 用于混合纳米颗粒稀释液 |
参考文献
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