生物发光监测小鼠过继转移自身免疫性糖尿病模型中的移植物存活

摘要

本方案描述了一种简单且微创的方法，用于在非肥胖型糖尿病（NOD）-重度联合免疫缺陷小鼠体内移植并成像NIT-1细胞，这些小鼠经来自自发性糖尿病NOD小鼠的纯化脾细胞攻击后建立疾病模型。

摘要

1型糖尿病的特征是胰腺中产生胰岛素的β细胞遭受自身免疫破坏。针对该疾病的一种有前景的治疗方法是移植干细胞来源的β细胞。然而，可能需要通过基因改造来保护移植细胞免受持续性自身免疫的攻击。糖尿病小鼠模型是初步评估保护移植细胞免受自身免疫攻击策略的有用工具。本文描述了一种微创方法，用于在小鼠过继转移性糖尿病模型中进行细胞移植物的移植与成像。本方案中，使用表达萤火虫荧光素酶转基因的鼠源性胰腺β细胞系NIT-1的细胞 luc2 被皮下移植到免疫缺陷的非肥胖型糖尿病（NOD）-重度联合免疫缺陷（scid）小鼠体内。同时，这些小鼠通过静脉注射来自自发性糖尿病NOD小鼠的脾细胞，以传递自身免疫反应。移植物被定期成像观察 通过 利用非侵入性生物发光成像技术监测细胞存活情况。将突变细胞的存活情况与移植至同一只小鼠体内的对照细胞进行比较。

引言

1型糖尿病（T1D）是由自身免疫反应导致胰腺中产生胰岛素的β细胞被破坏所引起的。β细胞质量的丧失导致胰岛素缺乏和高血糖。T1D患者需要每天多次注射外源性胰岛素，并在其一生中反复经历严重的高血糖和低血糖发作。这些发作相关的并发症包括糖尿病视网膜病变、肾功能下降以及神经病变¹。

胰岛素注射是1型糖尿病（T1D）的治疗方法，但并非治愈手段。然而，通过补充丢失的β细胞质量，有可能使患者恢复自主产生胰岛素的能力，从而逆转疾病进程。但尸体供体胰岛的供应十分有限²。干细胞来源的胰岛（SC-胰岛）可能为移植提供近乎无限的β细胞来源。多个研究团队已证实，人类胚胎干细胞（ESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）可被分化为具有功能的类β细胞^3,4,5。初步的临床试验数据令人鼓舞，表明这些细胞在移植后能够维持其功能，并可能使患者摆脱对外源性胰岛素的依赖⁶。然而，患者仍需长期接受免疫抑制治疗，从而增加了罹患癌症和感染的风险。此外，免疫抑制剂长期使用可能对移植物具有细胞毒性⁷。为了消除对免疫抑制的需求，可对SC-胰岛进行基因改造....

方案

图 1：在小鼠糖尿病过继转移模型中移植与成像移植物的工作流程。 表达萤火虫荧光素酶基因（luc2）的 NIT-1 细胞被皮下移植到 NOD-scid 小鼠体内。同时，将从自发性糖尿病 NOD 小鼠中分离的自身反应性脾细胞注射入这些小鼠。通过无创生物发光成像定期对移植物进行成像。图示由 BioRender.com 制作。缩写：NOD = 非肥胖型糖尿病；scid = 严重联合免疫缺陷。请点击此处查看该图的高清版本。

所有动物护理和研究方案均经乔斯林糖尿病中心机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并依照其规定执行。NO....

结果

方案的总体概述见图1。可比较两种细胞系（例如突变体与非靶向对照）的存活情况，也可在多组小鼠中测量一种细胞系的存活情况，例如药物处理小鼠与溶剂对照处理小鼠之间的比较。图3A显示了三只8周龄雌性NOD-scid小鼠，分别移植了非靶向对照（左）和突变体（右）细胞系。同时，这些小鼠还通过静脉注射自反应性脾细胞以诱导糖尿病。

小鼠在注射后的第0天、第5天、第10天、第14天和第18天进行成像。在三只小鼠中的两只中，对照移植物在第18天时已被破坏，表现为生物发光信号的消失，而突变型移植物则受到保护。在另一只小鼠中，突变型移植物被破坏，而对照移植物则未被破坏，这突显了动物之间的生物学差异。生物发光信号的量化方法如图3B所述。移植物存活率以相对于首次时间点的残余生物发光信号百分比表示（图3C）。此外，计算每只小鼠突变型与对照发光信号的比值，有助于可视化动物间的差异（

讨论

1型糖尿病是一种目前尚无治愈方法的严重疾病。β细胞替代疗法为该病患者提供了一种有前景的治疗手段，但该策略面临的关键障碍是移植的β细胞可能再次遭受自身免疫系统的攻击。通过对干细胞来源的β细胞进行基因工程改造以降低其免疫可见性或免疫易感性，是解决这一问题的潜在途径之一。本文介绍了一种在小鼠自身免疫性糖尿病的过继转移模型中，非侵入性成像移植β细胞并监测其存活情况的实验方案。

该方法的一个关键优势在于其方案的可适应性。本文应用该方法比较了突变细胞系与非靶向对照（图3），但该方案可适用于多种实验问题。可利用该方法探究多种遗传修饰、药物或其他处理对自身免疫攻击的保护作用。在评估某种药物或其他治疗手段对自身免疫的保护效果时，仅需使用表达荧光素酶且无其他遗传修饰的细胞。尽管本文采用同基因型移植来检测自身免疫保护作用，但该方法也可通过使用非同基因型的细胞系与小鼠品系组合（例如NIT-1细胞与C57BL/6J小鼠）进行调整，以评估同种异体免疫排斥反应。此外，该方案还可修改用于探究免疫细胞向移植物的浸润情况。可增加在不同时间点取出移植物的额外小.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶，0.53 mM EDTA	康宁	25-052-CI
293FT	Invitrogen	R70007	由SV40大T抗原转化的人胚胎肾细胞衍生的快速生长、高转染效率的克隆株
ACK裂解缓冲液	Gibco	A10492-01
70%异丙醇酒精消毒片	Amazon/Ever Ready 急救	B08NWF31DX
BD 5毫升注射器，鲁尔锁扣式针头	BD	309646
BD PrecisionGlide 针头 26G x 5/8（0.45 mm x 16 mm）皮下注射	BD	305115
BD 1 mL 结核菌素注射器，滑动针头接口	BD	309659
Blasticidin S HCl	康宁	30-100-RB
细胞滤网 高级 SureStrain，70 µ米，无菌	南方实验室器具	C4070	或使用孔径为40–70 μm的类似无菌滤网
CellDrop 自动细胞计数仪	Denovix	CellDrop BF-PAYG	或使用类似的细胞计数设备
Corning 100 mL 青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩	康宁	30-002-CI
一次性吸液管，聚苯乙烯材质，无菌，容量 = 2 mL	VWR	414004-265	或使用类似的吸液移液器
D-荧光素钾盐，分子生物学级，粉末状 >99%	Goldbio	LUCK-100
DMEM，高糖，含丙酮酸钠，不含谷氨酰胺	Gibco	10313039
Falcon BD 离心管，50 mL	Fisher Scientific	14-959-49A
胎牛血清	Gibco	10437-028
优质组织镊，1×2齿，5英寸，德国钢	Fisher Scientific	13-820-074
葡萄糖尿检试纸	加州宠物药房	u-tsg100	或使用类似的试纸检测尿液/血液中的葡萄糖
GlutaMAX–1 (100倍)	Gibco	35050-061
红外加热灯	Cole Parmer	03057-00	或使用类似的红外灯
胰岛素注射器 0.5 mL，U-100，29 G，0.5 英寸	Becton Dickinson	309306
异氟烷，USP	Piramal Critical Care	6679401725
IVIS Spectrum 活体成像系统	Perkin Elmer	124262	用于无创采集移植细胞生物发光图像的仪器
活体成像分析软件	Perkin Elmer	128113	用于采集和量化生物发光信号的软件
微量离心管密封盖，1.5 mL	USA Scientific	1615-5510	或使用类似的无菌微量离心管
NIT-1	ATCC	CRL-2055	源自NOD/Lt小鼠的胰岛β细胞系
NOD.Cg-Prkdcscid/J	杰克逊实验室	001303	严重联合免疫缺陷自发突变纯合小鼠 Prkdcscid，通常称为 scid 的特征是缺乏功能性 T 细胞和 B 细胞、淋巴细胞减少、低丙种球蛋白血症以及正常的造血微环境。
NOD/ShiLtJ	杰克逊实验室	001976	NOD/ShiLtJ品系小鼠（通常称为NOD）是一种多基因的自身免疫性1型糖尿病模型
PBS，pH 7.4	赛默飞世尔科技	10010031	无钙，无镁，无酚红
pCMV-VSV-G	Addgene	8454
pLenti-荧光素酶-blast	自制	质粒可应要求提供	参见补充文件1
pMD2.G	Addgene	12259
pMDLg/pRRE	Addgene	12251
聚乙烯亚胺，线性，分子量 25,000，转染级（PEI 25K）	Fisher Scientific	NC1014320
pRSV-Rev	Addgene	12253
大鼠固定器，布鲁姆式圆形1英寸	Fisher Scientific	01-288-32A
尖头剪刀	Fisher Scientific	08-940	或使用由手术级不锈钢制成的其他剪刀
经组织培养处理的培养皿	Millipore Sigma	CLS430167-20EA	或使用其他经无菌细胞培养处理的培养皿
精细中头镊/钳	Fisher Scientific	12-000-157