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方法文章

一种用于测量头部固定小鼠空间学习能力的开源虚拟现实系统

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DOI：

10.3791/64863

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2023年3月3日

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1Division of Systems Neuroscience, New York State Psychiatric Institute, 2Department of Psychiatry, Columbia University

本文内容

摘要

本文介绍了一种简化的开源硬件和软件系统，用于通过虚拟现实（VR）研究小鼠的空间学习能力。该系统利用微控制器网络和运行简易Python图形软件包的单板计算机，向固定头部的小鼠在跑轮上奔跑时呈现虚拟的直线轨道。

摘要

在小鼠中进行头部固定的行为实验，可让神经科学家在向动物传递精确感觉刺激的同时，利用高分辨率的电生理和光学成像工具观察神经环路活动。近年来，人类和啮齿类动物的研究表明，使用虚拟现实（VR）环境是揭示海马和大脑皮层中空间学习神经机制的重要工具，原因在于其能够对空间线索和情境线索等参数实现极为精确的控制。然而，为啮齿类动物的空间行为构建虚拟环境可能成本高昂，并需要工程学和计算机编程方面的深厚背景。本文介绍一种简单而强大的系统，该系统基于廉价、模块化、开源的硬件和软件，使研究人员能够利用虚拟现实环境研究头部固定小鼠的空间学习行为。该系统通过耦合的微控制器来测量动物运动并传递行为刺激，同时让头部固定的小鼠在跑轮上奔跑，与由单板计算机上运行的图形软件渲染的虚拟线性轨道环境同步。该系统强调分布式处理，使研究人员能够设计灵活、模块化的系统，以诱发并测量小鼠复杂的空间行为，从而确定哺乳动物大脑中神经环路活动与空间学习之间的关联。

引言

空间导航是一种具有重要生态学意义的行为，动物通过该行为将新环境的特征编码为认知地图，用于寻找潜在的奖励区域并避开可能的危险区域。空间导航与记忆密不可分，其背后认知过程依赖于海马体1和皮层的共同神经基础，这些脑区的神经回路整合传入的信息，并构建出可被后续回忆的环境与事件的认知地图2。尽管海马体中位置细胞的发现3,4以及内嗅皮层中网格细胞的发现5揭示了海马体内认知地图的形成机制，但关于特定神经元亚型、微环路以及海马体各个亚区（齿状回及CA3-1区）如何相互作用并参与空间记忆的形成与提取，仍有许多问题有待解答。

在体 双光子成像在揭示感觉神经生理学中的细胞及群体动态方面已成为一种有用的工具6,7；然而，通常需要对头部进行固定，这限制了该方法在研究哺乳动物空间行为中的应用。虚拟现实（VR）技术的出现8 通过让头部固定的 mice 在球体或跑步机上奔跑，同时呈现沉浸式且逼真的视觉空间环境，以研究海马体中的空间与情境编码，弥补了这一不足8,9,10 和皮层11此外，利用虚拟现实环境中的行为小鼠，神经科学研究人员能够通过精确控制虚拟现实环境的各个要素，来解析空间行为的组成部分。12 （例如视觉流、上下文调节），而这些方式在现实世界的空间学习实验中（如莫里斯水迷宫、巴恩斯迷宫或孔板任务）是无法实现的。

视觉虚拟现实（VR）环境通常由计算机的图形处理器（GPU）进行渲染，该处理器负责快速计算屏幕上实时显示动态三维环境所需的数千个多边形。由于处理需求较大，通常需要使用配备GPU的独立计算机，将视觉环境输出至显示器、多个屏幕13或投影仪14，同时记录动物在跑步机、转轮或泡沫球上的运动。因此，用于控制、渲染和投射VR环境的整套装置通常价格昂贵、体积庞大且操作不便。此外，文献中许多此类系统采用专有软件实现，这类软件不仅成本高昂，而且只能在专用计算机上运行。

基于这些原因，我们设计了一个开源的虚拟现实（VR）系统，利用树莓派（Raspberry Pi）单板计算机研究头固定小鼠的空间学习行为。该 Linux 计算机体积小、成本低，且内置 GPU 芯片用于 3D 渲染，可将虚拟现实环境灵活集成到不同个体实验装置的显示或行为设备中。此外，我们开发了一套基于 Python 编写的图形化软件包"HallPassVR"，该软件利用单板计算机通过图形用户界面（GUI）选择并重组自定义视觉特征，渲染出一个简单的视觉空间环境，即虚拟的直线轨道或走廊。该系统结合微控制器子系统（例如 ESP32 或 Arduino），用于测量运动行为并协调其他感官刺激或奖赏的传递，以促进强化学习。该系统为在双光子成像（或其他需要头部固定的实验技术）过程中向头固定小鼠提供视觉空间虚拟现实环境，提供了一种低成本、灵活且易于使用的替代方案，可用于研究空间学习行为背后的神经回路。

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方案

本方案中的所有操作均经纽约州精神病学研究所机构动物护理和使用委员会批准。

注意：使用单板计算机显示虚拟现实（VR）视觉环境，该环境与头部固定的小鼠在转轮上的运动同步。运动信息由连接至转轮轴的旋转编码器获取，并通过ESP32微控制器以串行输入方式传送给单板计算机。VR环境利用树莓派（Raspberry Pi）GPU的OpenGL硬件加速进行渲染，渲染过程采用适用于树莓派的pi3d Python 3D程序包。渲染完成的环境画面随后被输出 通过 一个投影仪，将图像投射到环绕式紧凑型抛物面屏幕上，该屏幕以头部固定的小鼠的视野为中心15,16，而行为反应（例如，对空间奖励的舔舐反应）则由第二个行为记录用ESP32微控制器进行测量。图形化软件包可通过图形用户界面（GUI）创建虚拟线性轨道环境，该环境由沿虚拟走廊或通道重复排列的视觉刺激模式组成。该设计具有良好的参数化特性，因而可支持构建复杂的实验，用于研究大脑在空间学习过程中如何编码位置信息和视觉线索（见第4节）。本系统所需定制硬件组件（即跑步轮、投影屏幕和头部固定装置）的设计文件已存放在公共GitHub代码库中（https://github.com/GergelyTuri/HallPassVR）。建议在阅读本实验方案的同时查阅该代码库的文档，因为该网站将持续更新系统的后续改进内容。

1. 硬件设置：跑步轮、投影屏幕和头部固定装置的构建

注意：如果用户能够使用 3D 打印和激光切割设备，这些装置的定制组件可轻松自行制造，也可外包给专业制造或 3D 原型制作服务（例如 eMachinehop）。所有设计文件均以 .STL 3D 文件或 .DXF AutoCAD 文件格式提供。

  1. 跑轮与行为学实验装置（图1)
    注意：跑轮由一个透明亚克力圆柱体（直径6英寸，宽度3英寸，厚度1/8英寸）构成，圆柱体中心安装在轴上，轴由激光切割的亚克力支架悬吊固定 通过 滚珠轴承。然后将轮组安装到轻质铝制框架（T型槽）上，并牢固固定在光学面包板上图1C-).
    1. 从1/4英寸的亚克力板上激光切割出轮子和轴支架的侧面，使用亚克力胶将轮子侧面固定在亚克力圆筒上。将轴法兰拧入轮子侧面部件的中心位置。
    2. 将轴插入轮子中心凸缘，将球轴承卡入轴安装座，并将其固定到垂直铝制支撑杆上。
    3. 将轮轴插入安装好的球轴承中，使轴的一端伸出轴承外0.5至1英寸，用于安装旋转编码器。
    4. 将旋转编码器支架安装至与车轮相对的轴端，插入旋转编码器，然后使用联轴器将车轮轴与旋转编码器轴连接。
    5. 将舔舐口连接至柔性臂，然后使用T型槽螺母将其固定在铝制轮架上。使用1/16英寸管路将舔舐口连接至电磁阀，并将电磁阀连接至储水罐。
      注意：舔管必须由金属制成，并焊接导线以连接至行为记录ESP32的电容式触控感应引脚。
  2. 投影屏幕
    注意：该虚拟现实屏幕是一种小型抛物面背投屏幕（画布尺寸：54 cm × 21.5 cm），其设计源自 Christopher Harvey 实验室开发的方案。15,16. 所使用的LED投影仪的投影角度（梯形失真）与之前使用的激光投影仪不同；因此，通过将设备安装在屏幕下方并简化反射镜系统，对原始设计进行了轻微修改（图1A，B建议同时参考Harvey实验室的文档和我们的文档，以根据用户需求定制VR环境。15.
    1. 使用1/4英寸黑色哑光亚克力板激光切割投影屏幕的侧面。使用1/4英寸镜面亚克力板激光切割背投反射镜。
    2. 使用铝制杆组装投影屏幕框架，并用激光切割亚克力面板。
    3. 将半透明投影屏幕材料插入框架的抛物线形槽口中。将背投镜插入投影屏幕框架背面的槽口中。
    4. 将LED投影仪放置在投影屏幕框架内的底部安装板上。通过调整安装螺栓使投影仪对齐，以优化投影图像在抛物面背投屏幕上的位置。
    5. 必要时密封投影仪箱体单元，以防止光学传感器受到杂散光污染。
  3. 头部固定装置
    注意：该头部固定装置的设计包含两个相互咬合的3D打印管路组件，用于固定金属头部植入件图1E，F).
    1. 使用高分辨率SLM 3D打印机打印头部固定臂。
      注意：树脂打印的塑料件可为行为学实验提供稳定的头部固定；然而，对于单细胞记录或双光子成像等高灵敏度应用，为实现最大程度的稳定性，建议使用机械加工的金属部件（例如 eMachineShop）。
    2. 将3D打印的头部固定夹具安装到带有光学支架的双轴测角仪上，以便调整动物头部角度，使制备部位保持水平。
      注意：此功能对于长期实验至关重要 体内 在需要于后续成像实验中定位相同细胞群体的情况下，应进行成像实验。否则，可省略此功能以降低系统成本。
    3. 制作头部固定装置。
      注意：两种不同复杂程度（及价格）的头固定装置连同本说明一起存放在材料表提供的链接中。
      1. 根据实验类型，确定要使用的头杆。头杆由不锈钢制成，通常外包给本地机械加工车间或在线服务（例如 eMachineShop）进行制造。

2. 电子硬件/软件的设置（单板计算机、ESP32 微控制器，图2）

  1. 配置单板计算机。
    注意：套件中包含的单板计算机 材料表 （Raspberry Pi 4B）是此设置的最佳选择，因为它内置GPU，可支持VR环境的渲染，并配备两个HDMI端口，分别用于实验控制/监控和VR投影。其他具备类似特性的单板计算机或许也可替代使用，但以下部分操作说明可能专属于Raspberry Pi。
    1. 将单板计算机成像应用程序下载到电脑，并在 microSD 卡（16 GB 以上）上安装操作系统（当前为 Raspberry Pi OS r.2021-05-07）。插入该卡，启动单板计算机。
    2. 配置单板计算机以使用 pi3d Python 3D 库：（菜单栏） 偏好设置 > 树莓派配置.
      1. 点击 显示 > 屏幕空白 > 禁用.
      2. 点击 界面 > 串行端口 > 启用.
      3. 点击 性能 > GPU内存 > 256 (MB)
    3. 升级 pi3d 的 Python 图像库包：（终端）> sudo pip3 install pillow --upgrade
    4. 为单板计算机安装 pi3d Python 3D 软件包：（终端）> sudo pip3 install pi3d
    5. 提高投影仪的HDMI输出电平：（终端）> sudo nano /boot/config.txt，取消注释 config_hdmi_boost=4，保存并重新启动。
    6. 从 arduino.cc/en/software 下载并安装集成开发环境（IDE）（例如 arduino-1.8.19-linuxarm.tar.gz），用于将代码加载到旋转编码器和行为学实验中的 ESP32 微控制器上。
    7. 在集成开发环境（IDE）中安装 ESP32 微控制器支持：
      1. 点击 文件 > 偏好设置 > 附加的 Board Manager 网址 = https://raw.githubusercontent.com/espressif/arduino-esp32/gh-pages/package_esp32_index.json
      2. 点击 工具 > 板 > 看板管理员 > ESP32 （由 Espressif 提供）。安装 v.2.0.0 版本（当前在 v2.0.4 版本上传失败）。
    8. 从 Processing 官网下载并安装 Processing 集成开发环境 https://github.com/processing/processing4/releases（例如 processing-4.0.1-linux-arm32.tgz），该资源对于在虚拟现实（VR）期间记录小鼠行为并进行在线绘图至关重要。
      注意：可根据需要将 Arduino 和 Processing 环境运行在与 VR 单板计算机不同的独立 PC 上。
  2. 设置旋转编码器与ESP32的连接。
    注意：与轮轴耦合的旋转编码器可测量小鼠运动时的轮子转动，转动信号由ESP32微控制器计数。位置变化随后被发送至单板计算机的GPIO串行端口，用于通过图形化软件包控制虚拟环境中的运动，同时发送至行为控制ESP32以调控奖励区域图2).
    1. 将旋转编码器组件与旋转ESP32之间的导线连接。旋转编码器通常有四根导线：+、GND、A 和 B（用于正交编码器的两根数字线）。连接这些导线 通过 跳线连接至 ESP32 的 3.3 V、GND、25 和 26 引脚（根据所附代码的情况）。
    2. 将旋转编码器端ESP32与行为记录端ESP32的串行RX/TX线连接。在旋转编码器端ESP32的Serial0 RX/TX（接收/发送）与行为记录端ESP32的Serial2端口（TX/RX，引脚17、16；见OMwSmall PCB右侧的Serial2端口）之间建立简单的双线连接。该连接将把来自旋转编码器的运动信息传输至行为记录系统，用于识别空间区域（如奖励区域）。
    3. 将旋转式 ESP32 的串行 RX/TX 线与单板计算机的 GPIO 引脚（或通过直接 USB 连接）相连。在单板计算机的 GPIO 引脚 14、15（RX/TX）与旋转式 ESP32 的 Serial2（TX/RX，引脚 17、16）之间建立两线连接。该连接将把来自旋转编码器的运动信息传输至运行在单板计算机上的图形化软件程序。
      注意：仅当旋转式 ESP32 未连接时，此步骤才必要 通过 一个USB（即它是一个GPIO串行连接） "/dev/ttyS0"），但 HallPassVR_wired.py 代码的其余部分必须修改以使用 "/dev/ttyUSB0"此有线连接将在未来版本中被无线蓝牙连接所取代。
    4. 将旋转式 ESP32 USB 插入单板计算机的 USB 接口（或运行 IDE 的其他 PC）以上传初始旋转编码器代码。
  3. 设置行为学实验用 ESP32 与行为学硬件的连接（通过 OpenMaze PCB）
    注意：ESP32 微控制器将控制所有非虚拟现实（VR）的动物交互行为（包括传递非 VR 刺激和奖励、检测小鼠舔舐动作），这些组件通过通用印刷电路板（PCB）连接。 "breakout board" 对于 ESP32， "OMwSmall"，其设计可通过 OpenMaze 网站（www.openmaze.org）获取。该印刷电路板包含驱动机电组件所需的电子元件，例如用于递送液体奖励的电磁阀。
    1. 将12 V液体电磁阀连接到OMwSmall PCB最左侧的ULN2803集成电路输出端（在示例设置和代码中为第12引脚）。该集成电路通过行为学ESP32微控制器的GPIO输出控制向奖励用电磁阀提供12 V电源的通断。
    2. 将舔舐端口连接到 ESP32 的触摸输入引脚（例如，示例代码中的 T0，GPIO4）。ESP32 在特定引脚上具有内置的电容式触摸感应功能，行为控制 ESP32 代码利用该功能检测小鼠在虚拟现实行为实验中舔舐所连接的金属舔舐端口的动作。
    3. 将行为记录ESP32的Serial2（引脚16、17）与旋转编码器ESP32的Serial0之间的串行RX/TX线连接（参见步骤2.2.2）。
    4. 将USB插入单板计算机的USB端口（或其他PC）以上传适用于不同实验范式（如奖励区域的数量/位置）的行为ESP32新程序，并使用配套的Processing程序采集行为数据。
    5. 将12 V直流电源适配器插入行为学ESP32 OMwSmall PCB上的2.1 mm桶形插孔连接器，以为奖励用电磁阀提供电源。
    6. 将单板计算机的HDMI #2输出端口连接至投影仪的HDMI端口，以将单板计算机GPU渲染的虚拟现实环境传输至投影屏幕。
    7. （可选）将同步线（引脚 26）连接至神经成像或电生理记录装置。系统将每 5 秒发送一个 3.3 V 晶体管-晶体管逻辑（TTL）信号，以实现接近毫秒级精度的系统同步。
  4. 设置软件：将固件/软件加载到旋转编码器 ESP32 上图2B）和行为 ESP32（图2E）使用集成开发环境（IDE），并将VR Python软件下载到单板计算机上。参见 https://github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software.
    1. 首先将旋转编码器ESP32插入单板计算机的USB端口——该设备将自动被命名 "/dev/ttyUSB0" 由操作系统。
    2. 加载旋转编码器代码：打开文件 RotaryEncoder_Esp32_VR.ino 在集成开发环境（IDE）中，然后选择 ESP32 工具 > 板 > ESP32 开发模块. 通过点击选择 ESP32 端口 工具 > 端口 > /dev/ttyUSB0，然后点击 上传.
    3. 将行为记录用的 ESP32 插入单板计算机的 USB 端口，该设备将被命名为 "/dev/ttyUSB1"由操作系统。
    4. 将行为序列代码加载到行为 ESP32（IDE， ESP32 开发模块 已选择），然后单击 工具 > 端口 > /dev/ttyUSB1，然后点击 上传：wheel_VR_behavior.ino.
    5. 通过在集成开发环境（IDE）中为每个ESP32选择相应的串行端口来测试串行连接工具 > 端口 > /dev/ttyUSB0，或 /dev/ttyUSB1）然后点击 工具 > 串行监视器 （波特率：115,200）以观察来自旋转控制板（USB0）或行为控制板（USB1）的串行输出。旋转转轮，可在USB0上查看来自旋转ESP32的原始运动输出，或在USB1上查看来自行为ESP32的格式化运动输出。
    6. 从以下地址下载图形化软件包的 Python 代码： https://github.com/GergelyTuri/HallPassVR/tree/master/software/HallPassVR（复制到 /home/pi/Documents 目录）。该文件夹包含运行图形软件包所需的全部文件，前提是此前已正确安装 pi3d Python3 软件包（步骤 2.1）。

3. 运行和测试图形化软件包

注意：运行图形化软件包的图形用户界面（GUI），以启动虚拟现实（VR）线性轨道环境，校准VR软件和行为ESP32代码中的距离，并使用附带的Processing语言程序测试小鼠奔跑和舔舐行为的数据采集及在线绘图功能。

  1. 打开单板计算机中的终端窗口，并导航至 HallPassVR 文件夹（终端：> cd /home/pi/Documents/HallPassVR/HallPassVR_Wired）
  2. 运行 VR 图形用户界面（GUI）：（终端）> python3 HallPassVR_GUI.py（GUI 窗口将打开，图 3A）。
  3. 图形化软件 GUI
    1. 从列表框中选择并添加四个元素（图像），或选择下方预存的模式，然后点击 上传（Upload），为轨道上的三种模式分别设置，之后点击 生成（Generate）。
      注意：新的图像文件（.jpeg）可在运行 GUI 前放入文件夹 HallPassVR/HallPassVR_wired/images/ELEMENTS 中。
    2. 从下拉菜单中选择地板和天花板图像，并将本示例代码中的轨道长度设置为 2 m（该值必须等于行为控制 ESP32 代码和 Processing 代码中的 trackLength，单位为毫米 [mm]）。
    3. 可选择为该模式命名（将被存储在 HallPassVR_wired/images/PATH_HIST 文件夹中）。
    4. 点击 开始（Start） 按钮（点击其他位置前请等待 VR 窗口启动）。VR 环境将显示在屏幕 #2 上（投影屏幕，图 3B、C）。
  4. 运行 Processing 程序以采集并绘制行为数据/运动轨迹。
    1. 在 Processing IDE 中打开 VRwheel_RecGraphSerialTxt.pde 文件。
    2. 修改 animal = "yourMouseNumber"; 变量，并将 sessionMinutes 设置为行为实验会话时长（单位：分钟）。
    3. 点击 Processing IDE 上的 运行（Run） 按钮。
    4. 查看 Processing 绘图窗口，当转轮旋转时，应显示小鼠在虚拟线性轨道上的当前位置，以及奖励区域和每 30 秒更新一次的舔舐、圈数和奖励的运行直方图（图 3D）。手动转动跑轮以模拟小鼠奔跑进行测试，或在初始设置时使用测试小鼠。
    5. 点击绘图窗口，然后按键盘上的 q 键以停止采集行为数据。当 sessionMinutes 时间结束或用户按下 q 键退出时，系统将保存一个包含行为事件及其时间戳的文本文件（通常每会话小于 <2 MB）以及最终绘图窗口的图像文件（.png）。
      注意：由于输出的 .txt 文件体积较小，估计单板计算机的 SD 卡可存储数千次以上的行为记录。数据文件可保存至U盘用于后续分析，或在连接本地网络的情况下实现远程数据管理。
  5. 校准行为轨道长度与 VR 轨道长度。
    1. 手动转动跑轮，同时观察 VR 走廊及小鼠位置（在 Processing 绘图中）。如果 VR 走廊在小鼠到达行为图终点之前/之后结束，请逐步增加/减少 VR 轨道长度（HallPassVR_wired.py 中的 corridor_length_default，单位为厘米 [cm]），直至两个系统中的轨道同时重置。
      ​注意：当前代码针对使用 256 位四象限旋转编码器的 6 英寸直径跑轮进行了校准，因此用户可能需要根据其他配置调整 VR 代码（HallPassVR_wired.py 中的 corridor_length_default，单位为厘米 [cm]）和行为代码（wheel_VR_behavior.ino 中的 trackLength，单位为毫米 [mm]）。然而，系统会在每次 VR 圈数循环时重置行为位置，以保持两个系统之间的同步。

4. 小鼠训练与空间学习行为

注意：小鼠首先进行头部固定植入手术，适应头部固定后，再训练其在跑轮上奔跑，并逐步学会为获取液体奖励而持续舔舐（"随机觅食"）。对于能够稳定完成奔跑和舔舐行为的小鼠，进一步在虚拟现实环境中进行空间隐藏奖励任务训练，即在虚拟直线轨道上，根据视觉线索呈现单一奖励区域。空间学习能力通过小鼠在奖励区域前特定位置舔舐行为的选择性增强来评估。

  1. 头部定位螺钉植入手术：该操作在本期刊及其他期刊中已有详细描述，具体操作步骤请参考相关文献。7,17,18,19,20,21.
  2. 浇水计划
    1. 在首次操作前24小时开始进行限水处理（见下文），并允许 随意摄取 每次适应或头部固定行为训练后提供饮水。在适应期的三天内，逐渐将饮水时间减少至约5分钟，并根据每只小鼠的情况调整饮水量，使其体重不低于限制饮水前体重的80%。每天监测每只动物的体重，并观察其是否出现脱水迹象。22体重无法维持在限制饮食前80%以上或出现脱水症状的小鼠应从实验中剔除，并给予自由饮水。
      注意：需要对小鼠进行限水处理，以激励其通过跑轮获取液体奖励，并利用空间舔舐行为作为小鼠在轨道上学习位置的指标。不同机构对于该操作的具体指导可能存在差异，因此操作者必须咨询所在机构的动物护理委员会，以确保限水期间动物的健康与福利。
  3. 操作：每天对植入小鼠进行操作，使其适应与人类的接触，之后限制 随意摄取 可将饮水作为强化物给予（每天1-5分钟，持续2天至1周）。
  4. 头部固定适应训练
    1. 将小鼠置于头部固定装置中，并通过间歇给予水滴作为奖励，使其逐渐适应头部固定，且每次适应时间逐步延长，以减少头部固定带来的应激反应。
    2. 从5分钟头部固定开始，每天以5分钟为 increments 逐步增加固定时间，直至小鼠能够耐受长达30分钟的固定。若小鼠出现挣扎或几乎不动的情况，应立即将其从固定装置中移除。然而，小鼠通常在数次训练后会自发地在跑轮上奔跑，表明其已准备好进入下一阶段的训练。
      注意：对于在头部固定过程中反复挣扎，或不通过奔跑和舔舐获取奖励的小鼠，应退回至前期训练阶段；若经过三次此类补救性训练周期后仍无进展，则应将其从研究中剔除（参见 表1).
  5. 运行/舔舐训练（随机觅食）
    注意：为了在虚拟现实环境中执行空间学习任务，小鼠必须首先学会在跑轮上奔跑，并为偶尔获得的奖励而持续舔舐。操作性行为参数的进展需加以控制 通过 ESP32 微控制器的行为
    1. 随机觅食与非操作性奖励
      1. 运行带有任意视觉元素路径的图形化软件GUI程序（由用户选择，参见步骤3.3）。
      2. 将行为程序上传至带有多个非操作性奖励的行为 ESP32（代码变量： isOperant=0, numRew=4, isRandRew=1让小鼠适应跑步和舔舐行为。每次训练持续20–30分钟，训练小鼠每 session 至少跑20圈，并对随机位置呈现的奖励进行舔舐反应（训练1至4个 session）。
    2. 交替圈次中基于操作性奖赏的随机觅食
      1. 上传行为程序 altOpt=1 （交替进行操作性与非操作性 laps），训练小鼠直至其对非操作性和操作性奖励区域均产生舔舐反应（1 至 4 个训练阶段）。
    3. 完全可操作的随机觅食
      1. 上传包含四个操作性随机奖励区域的行为程序（行为 ESP32 代码变量： isOperant=1, numRew=4, isRandRew=1）。在本训练阶段结束时，小鼠应能够持续奔跑，并在整个轨道长度上执行测试舔舐动作（1至4个训练 session； 图4A).
  6. 空间学习
    注意：通过选择一条2 m长的走廊，在轨道两侧设置深色面板，并在中间位置（0.9–1.1 m处）设置一个高对比度视觉刺激面板作为视觉线索，进行一项空间学习实验，其中隐藏奖励区域距离该视觉线索一定距离，类似于近期关于空间嗅觉线索的实验。20小鼠需要在虚拟线性轨道环境中，于视觉线索远处的位置（1.5–1.8 m处）舔舐奖励区域。
    1. 运行图形软件程序，显示一条黑暗走廊的路径，中央有一个单一视觉线索（例如，棋盘，参见步骤 3.3） 图3A).
    2. 将包含单个隐藏奖励区域的行为程序上传至行为实验用ESP32（行为ESP32代码变量： isOperant=1, isRandRew=0​, numRew=1, rewPosArr[]= {1500}).
    3. 轻轻将小鼠放入头部固定装置中，调整舔舐管至小鼠口部前方适当位置，并将小鼠跑轮置于投影屏幕区域的中心。完成最终调整后，确保小鼠头部距离屏幕约12–15 cm。
    4. 在 Processing 草图中设置动物的名称，然后点击运行 处理 IDE 开始采集并绘制行为学数据（参见步骤 3.4）。
    5. 以单个隐藏奖励区域和单个视觉线索的虚拟现实走廊，对小鼠进行每次30分钟的训练。
    6. 离线：从 Processing 草图文件夹中下载 .txt 数据文件，并分析空间舔舐行为（例如，使用附带的 procVRbehav.m 和 vrLickByLap.m 文件在 Matlab 中进行分析）。
      注意：小鼠最初应在整个虚拟轨道上执行测试舔舐动作"随机觅食"）随后根据虚拟现实（VR）视觉线索，在奖励位置附近开始有选择性地舔舐图4).

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结果

这一开源的虚拟现实行为实验装置使我们能够在头固定小鼠穿越虚拟线性轨道环境时，通过量化舔舐行为来反映空间学习能力。将7只4月龄、两性混合的C57BL/6小鼠置于限水方案中，首先训练它们在跑轮上持续以低频率舔舐，以获取随机空间奖励（“随机觅食”），此阶段不使用虚拟现实（VR）。当转移到配备2米随机走廊模式的VR投影屏幕装置时，小鼠的表现起初受到影响，但在数次VR训练后恢复至先前水平（图4A）。其中，有六只小鼠（共七只，占86%）在VR条件下成功建立随机觅食策略（一只小鼠因无法持续奔跑而被排除），随后被要求在一条2米长、无其他视觉特征的虚拟轨道中，依据位于中央的单一视觉位置线索，在0.5米处的无提示操作性奖励区域进行舔舐以获得水奖励（“隐藏奖励任务”）。根据本系统目前的初步数据，七只小鼠中有四只（57%）能够在两到四次训练内学会利用单一视觉线索完成隐藏奖励任务，表现为在奖励区域附近舔舐行为的选择性逐渐增强（表1，图4B、C），该结果与我们此前使用非VR跑台的...

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讨论

该开源小鼠VR系统只有在旋转装置与行为记录用的ESP32微控制器和单板计算机之间正确建立串行连接后才能正常运行（步骤2），可通过IDE串行监视器确认连接状态（步骤2.4.5）。要获得成功的实验行为结果（步骤4），小鼠必须适应实验装置，并能够舒适地在转轮上奔跑以获取液体奖励（步骤4.3–4.5）。这需要实施充分但不过度的饮水限制，因为给予过多饮水的动物将无法有效参与任务 随意 家庭笼中的水不会流动，小鼠无法通过舔舐来获取奖励（即无法通过舔舐行为表明其感知位置），且脱水小鼠可能表现出嗜睡状态而不再在转轮上奔跑。还需注意的是，存在无需采用限水方式即可激励小鼠行为的替代方法24；然而，我们在此并未测试这些方法。对于训练程序，最初不跑动的动物可给予 特设的 （即非空间性的）由实验人员给予的水奖励 通过 一个可选的附加按钮按压，或可轻柔移动轮子以促进运动。为了发展随机觅食行为，对于那些奔跑但不舔舐的小鼠，应使用非操作性奖励进行训练（行为ESP32代码： isOperant = 0;，步骤 4.5.1）直到它们能够自主奔跑并舔舐以获...

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披露

Clay Lacefield 是 OpenMaze.org 的创始人和维护者，该网站提供本实验方案中所用 OMwSmall 印刷电路板（PCB）的设计文件，可免费下载。

致谢

我们感谢Harvey实验室的Noah Pettit在本手稿方案开发过程中提供的讨论和建议。本工作得到了BBRF青年研究者奖和NIMH 1R21MH122965（G.F.T.）以及NINDS R56NS128177（R.H.，C.L.）和NIMH R01MH068542（R.H.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1/4 " 直径铝棒McMaster-Carr9062K26长度 3"，用于轮轴
1/4"-20 顶丝，长 3/4"（x2）Amazon.comB09ZNMR41V用于将头部固定夹具固定到光学支架上
2"×7" T型槽铝条（x2）8020.net1020轮子/动物安装框架
6" 直径、3" 宽的亚克力圆筒（厚度 1/8"）Canal Plastics33210090702跑步轮（在 canalplastics.com 定制切割宽度）
8-32 × 1/2" 内六角圆柱头螺钉McMaster-Carr92196A194用于将头部固定夹具固定到光学支架上 
可调节臂（14"）Amazon.comB087BZGKSL用于固定/调节舔水口
分析代码（MATLAB）自定义编写文件位于 github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software/Analysis code
轴安装法兰，内径 1/4"Pololu1993用于将轮子安装到轴上
球轴承（外径 5/8"，内径 1/4"，x2）McMaster-Carr57155K324用于将轮轴安装到框架上
行为控制 ESP32 代码自定义编写文件位于 github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software/Arduino code/Behavior board
黑色不透明哑光亚克力板（厚度 1/4"）Canal Plastics32918353422激光切割文件位于 github.com/GergelyTuri/HallPassVR/hardware/VR screen assembly
透明亚克力板（厚度 1/4"）Canal Plastics32920770574激光切割文件位于 github.com/GergelyTuri/HallPassVR/hardware/VR wheel assembly
ESP32 devKitC v4（x2）Amazon.comB086YS4Z3F用于行为控制和旋转编码器的微控制器
ESP32 扩展板OpenMaze.orgOMwSmall说明见 www.openmaze.org（https://claylacefield.wixsite.com/openmazehome/copy-of-om2shield）。ZIP 格式 Gerber 文件位于：https://github.com/claylacefield/OpenMaze/tree/master/OM_PCBs
紧固件和支架 8020.net4138, 3382,3280用于轮子框架的安装
角度调节器（goniometers）Edmund Optics66-526, 66-527行为实验可选，成像时用于精细调节头部位置
HallPassVR Python 代码自定义编写文件位于 github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software/HallPassVR
头部固定夹具自定义设计3D 设计文件位于 github.com/GergelyTuri/HallPassVR/hardware/VR head mount/Headpost Clamp
LED 投影仪Texas InstrumentsDLPDLCR230NPEVM或其他小型 LED 投影仪
舔水口VWR20068-638（或约 16 G 金属皮下注射针管）
M 2.5 × 6 定位螺钉McMaster-Carr92015A097用于固定头部固定杆 
哑光白色扩散纸Amazon.com屏幕材料
金属头部固定杆自定义设计3D 设计文件位于 github.com/GergelyTuri/HallPassVR/hardware/VR head mount/head post designs
其他管路及管接头（内径 1/16"）用于构建供水管路
光学面包板Thorlabs根据用户需求
光学支架，直径 1/2"（x2）ThorlabsTR4用于头部固定装置
Processing 代码自定义编写文件位于 github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software/Processing code
Raspberry Pi 4Braspberry.com, adafruit.com用于渲染 HallPassVR 环境的单板计算机
直角夹具ThorlabsRA90用于头部固定装置
旋转编码器（正交型，256 步）DigiKeyENS1J-B28-L00256L用于测量轮子旋转
旋转编码器 ESP32 代码自定义编写文件位于 github.com/GergelyTuri/HallPassVR/software/Arduino code/Rotary encoder
SCIGRIP 10315 亚克力胶Amazon.com
轴联轴器McMaster-Carr9861T426用于连接旋转编码器轴与轮轴
银色镜面亚克力板Canal Plastics32913817934激光切割文件位于 github.com/GergelyTuri/HallPassVR/hardware/VR screen assembly
电磁阀Parker003-0137-900用于给予水奖励

参考文献

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