利用鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型研究卵巢组织移植

摘要

本文介绍了一种建立人卵巢组织鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）异种移植模型的实验方案，并验证了该技术的有效性、移植物血管重建的时间进程以及在6天移植期内组织的存活能力。

摘要

卵巢组织冷冻保存与移植是保存生育力的有效策略，但存在一个主要缺点，即移植后由于卵泡异常激活和死亡，导致短期内发生大量卵泡丢失。啮齿类动物是研究卵泡激活的基准模型，但其成本、耗时及伦理问题日益突出，促使人们开发替代模型。鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型具有成本低、维护简便等优势，因而尤为吸引人 天然免疫缺陷持续至受精后第17天，使其成为理想的研究模型 人卵巢组织的短期异种移植。CAM 具有高度血管化的特点，已被广泛用作研究血管生成的模型。这使其相较于其他模型具有显著优势 体外 模型，并允许研究影响移植后早期毛囊丢失过程的机制。本文所述方案旨在描述一种用于人卵巢组织的CAM异种移植模型的建立，重点阐述该技术的有效性、移植物血管重建的时间进程，以及在6天移植期内组织的存活情况。

引言

近年来，出于肿瘤学和良性疾病治疗以及社会因素考虑，生育力保存的需求显著增加。然而，用于治愈恶性及非恶性疾病的多种治疗方法对性腺具有高度毒性，可能导致医源性早发性卵巢功能不全，最终引发不孕¹。目前 established 的生育力保存技术包括胚胎冷冻保存、未成熟或成熟卵母细胞玻璃化冷冻，以及卵巢组织冷冻保存^2,3,4。对于青春期前女孩或需要立即接受癌症治疗的女性，卵巢组织冷冻是目前唯一可用的生育力保存手段。卵巢组织移植后，超过95%的受试者可恢复内分泌功能，活产率介于18%至42%之间^5,6,7,8,9。

尽管冻融卵巢组织移植已取得成功，但仍存在改进空间。实际上，由于卵巢皮质碎片在移植时未进行血管吻合，因此会经历一段缺氧期，直至移植物重新建立血液供应^10,11,12。目前绝大多数研究人类卵巢组织移植的研究均采用异种移植模型，即将卵巢组织移植至免疫缺陷小鼠体内。异种移植物的完全再血管化大约需要10天时间，期间宿主和移植物的血管均参与功能性血管的形成^12,13,14。在再血管化完成前的这一缺氧窗口期内，约有50%–90%的卵泡储备量会丢失^10,15,16。大量证据表明，这种严重的卵泡丢失既包括直接的卵泡死亡（表现为移植后剩余卵泡绝对数量的减少），也包括原始卵泡生长的激活（表现为卵泡比例发生变化，生长中卵泡的比例升高）^17,18。

有趣的是，先前的研究使用多种动物的卵巢组织移植到鸡绒毛尿囊膜（CAM）上，该膜的结构模拟了典型的腹膜移植部位，结果报道了原始卵泡自发激活受到抑制，原始卵泡储备在长达10天内保持完整^19,20,21,22。我们团队 此前已证明，将冻融后的人类卵巢组织移植至CAM是一种可靠的方法，可用于研究人类卵巢组织移植后的早期缺血阶段²³ ，并最近进一步表明，该移植方法能够抑制卵泡的激活²⁴。

CAM 模型尤其具有吸引力，不仅因为鸡蛋比小鼠便宜得多，还因为 CAM 具有高度血管化的特性，便于研究卵泡激活与卵巢移植物再血管化之间的关联。事实上，禽类系统是研究血管生成最常用且最灵活的方法之一²⁵。鸡胚发育（ED）持续21天直至出壳，CAM 在发育最初4-5天内通过尿囊与绒毛膜融合而形成²⁶。值得注意的是，鸡胚在发育第17天之前天然处于免疫缺陷状态，因此异种移植实验可进行而无需担心移植物被排斥^27,28。此外，根据欧洲法律，CAM 模型不会引发任何伦理或法律问题²⁹，使其成为其他动物模型的诱人替代方案。在饲养条件方面，鸡胚仅需将孵卵器设定在37 °C、相对空气湿度为40%-60%的环境中即可。这些有限的实验需求与使用免疫缺陷小鼠相比，显著降低了研究成本。

本文所述方案旨在介绍人卵巢组织CAM异种移植模型的建立方法，并具体阐述该技术的有效性、移植物血管重建的时间进程，以及在6天移植期内组织的存活情况。该方案对于研究移植后早期卵泡丢失的机制，以及多种因子（生长因子、激素等）对这一现象的影响具有重要意义。

方案

该研究使用的人体组织已获得鲁汶天主教大学机构审查委员会的批准。患者已签署书面知情同意书，同意将其卵巢组织用于科研目的。

1. 订购极可能已受精的第0天卵

1. 寻找经过认证的实验室级Lohman选育的白来航鸡种蛋供应商，该供应商应报告较高的胚胎发育率，这主要取决于雏鸡的年龄。

2. 准备受精卵进行孵化

1. 在鸡蛋到达之前，将孵化箱组装好，并调节至37 °C，相对湿度保持在40%–60%。通过将温度计和湿度计放入孵化箱内，监测温度和空气湿度。确保孵化箱的盖子配有玻璃窗，以便在不打开箱盖的情况下检查内部参数（图1）。
2. 从经认证的实验级蛋品供应商处获得第0天的洛曼白来航鸡种蛋后，使用湿润的纸巾清洁蛋壳表面，并立即擦干。
   注意：由于蛋壳膜具有多孔性，可使用高压灭菌水清洁蛋壳表面，并用于控制孵化箱内的湿度，以尽量降低污染风险。
3. 使用记号笔对鸡蛋进行标记（例如日期和蛋编号）。
4. 将鸡蛋尖端朝下放入孵化箱中孵化，并定期翻转以促进绒毛尿囊膜（CAM）的发育。每天手动将鸡蛋翻转180°两到三次，或使用 自动旋转装置。
   注意：为确保鸡蛋确实被翻转，可用铅笔或记号笔在鸡蛋两侧相对的位置分别标记"X"和"O"。孵化箱盖上的玻璃窗可便于在不打开设备的情况下检查鸡蛋的翻转情况。

3. 胚龄第3天打开蛋壳

注意：在胚胎发育第3天于蛋壳上开一个矩形窗口。

1. 准备超净工作台，以确保在无菌条件下操作。将以下仪器放置于工作台内，并用70%乙醇消毒（若尚未灭菌）：
   -蛋架
   -检卵灯或聚焦冷光源
   -记号笔
   -无菌直针
   -无菌19 G针头
   -5 mL无菌注射器
   -曲线锯片
   -无菌镊子
   -胶带
2. 将一枚孵化箱中的鸡蛋转移至工作台内的蛋架上，并关闭蛋体旋转装置。
3. 在暗处，将检卵灯（或聚焦冷光源）贴近蛋壳，以确定气室位置。气室位于鸡蛋的钝端。使用记号笔在蛋壳上标出气室中心位置。
4. 打开灯光。用无菌直针在标记处轻轻旋转，于蛋壳上钻一小孔。通常直径约1 mm的小孔即可满足要求。
   注意：注意不要将针完全刺入蛋内。若发生此情况，应弃用该枚鸡蛋。
5. 将无菌19 G针头连接至无菌5 mL注射器上。
6. 在暗处，使用检卵灯（或聚焦冷光源）定位卵黄囊，并通过第3.4步所钻小孔，以45°角将无菌19 G针头朝蛋底方向刺入；操作时务必避免破坏卵黄囊。吸取1.5–2 mL蛋清，使绒毛尿囊膜（CAM）与蛋壳分离，随后用一小段胶带封闭小孔。
   注意：若在抽吸过程中卵黄囊破裂，注射器内吸出的液体将呈黄色而非透明（蛋清）。若发生此情况，应更换针头和注射器。若吸入较多卵黄，可能危及胚胎活性。
7. 打开灯光。将鸡蛋水平放置，用记号笔绘制一个1 cm × 1.5 cm的矩形窗口。窗口尺寸不应超过标准胶带的常规宽度。
8. 一手握住鸡蛋，另一手持曲线锯片，沿先前绘制的 矩形线轻轻锯切蛋壳。确保蛋壳不发生裂纹，且切勿 完全切至下陷的绒毛尿囊膜（CAM）处。操作过程中应定期吹气，以清除蛋壳粉尘和碎屑。
9. 将无菌镊子插入锯开的矩形蛋壳片下方，轻巧夹取并完整移除蛋壳片，避免损伤绒毛尿囊膜（CAM）。此外，应去除白色的外层壳膜，以便观察胚胎及其绒毛尿囊膜（CAM）。
   注意：若少量蛋壳粉尘或碎屑落入绒毛尿囊膜（CAM）上，可用无菌镊子小心清除，注意避免撕裂膜结构。
10. 识别具有活性的受精蛋。可通过清晰的蛋清以及胚胎周围可见的血管环进行判断，有时在此阶段（胚胎发育第3天）即可观察到心跳。弃用未受精或已死亡的胚胎。
11. 用胶带覆盖新打开的窗口，以防脱水。注意将一端折叠，以便后续易于揭开。
12. 将鸡蛋放回孵化箱，使开口窗口朝上，胶带不接触绒毛尿囊膜（CAM）。可用折叠的纸片或蛋架部分固定鸡蛋，防止滚动。确保旋转托盘处于关闭状态。
13. 重复步骤3.2–3.12，打开其余鸡蛋。

4. 将冻融的人卵巢组织移植到CAM上

注意：理想情况下，应于胚胎发育第7至10天之间开始在CAM上进行移植。

1. 按照 elsewhere³⁰ 中描述的方案，在超净台内解冻冻存的卵巢皮质条。
2. 将皮质条切成三段 4 mm × 2 mm × 1 mm 的组织片段。取其中一段作为未移植对照，其余两段分别用于移植 1 天或 6 天。
   注意：若有足够组织，建议设置重复实验。
3. 从培养箱中取出一枚鸡蛋，置于超净台内的蛋架上，使开窗面朝上。
4. 撕去窗口处的胶带，检查胚胎是否存活。此阶段的存活胚胎应具有丰富的血管网络、清晰的蛋白、可见的心跳以及一定的胚胎活动。
5. 通过在上皮表面放置一条 1 cm² 的无菌乙醚提取滤纸并立即移除，轻柔地损伤 CAM 上的一小片区域，以制备移植位点。
   注意：CAM 是一种不可穿透的屏障，除非通过去除双层上皮的上层表皮层造成损伤，而基底层保持完整。该技术还可通过激活伤口愈合过程促进再血管化。若无菌乙醚提取滤纸在 CAM 上停留过久，膜可能粘附于滤纸并发生撕裂。一旦发生此情况，应弃用该枚鸡蛋。 
6. 用显微外科镊夹取一段冻融后的卵巢皮质组织（4 mm × 2 mm × 1 mm），将其髓质面朝向 CAM 放置于受损的 CAM 上。每枚鸡蛋移植一段组织。
7. 用胶带封住窗口，小心地将鸡蛋放回培养箱。确保蛋壳开口朝上且鸡蛋放置稳固。
8. 对所有剩余组织重复步骤 4.1–4.7。
   注意：每次移植当天均应检查植入物，以评估胚胎存活状态并监测血管系统的变化。

5. 收集移植物

注意：异种移植瘤最迟应在胚胎发育第17天收获，因为胚胎的免疫系统从第18天开始逐渐成熟并具备功能。

1. 将鸡蛋放置在支架上，并扩大蛋壳上的窗口，以便更清晰地观察移植物并便于操作。
2. 对移植物进行大体观察，特别注意绒毛尿囊膜（CAM）对移植物的血管反应。拍摄数码照片或视频以记录结果。
3. 用镊子夹住组织或周围的绒毛尿囊膜，使用剪刀或解剖刀小心地将移植物从绒毛尿囊膜上切除。
   注意：移植物在移植后约第3天开始被第二层绒毛尿囊膜覆盖，并最终被包裹。到第6天时，移植物可能已移入蛋内，导致在某些情况下难以取出。
4. 根据具体实验需求，采用适当的方法分析切除的组织。 在本研究中，组织样本经多聚甲醛固定、石蜡包埋后，按以下步骤进行苏木精-伊红染色：
   1. 将组织碎片在4%多聚甲醛中固定24小时，并使用自动包埋仪按照表1中所述步骤进行石蜡包埋。
   2. 将石蜡包埋的组织块在4°C下放置过夜，随后用切片机切成5 µm厚的切片。
   3. 将组织切片展铺于置于加热板（30 °C）上的载玻片上，先室温干燥2小时，再于37 °C烘箱中继续干燥24小时。
   4. 随后，按照已有文献描述的方案进行苏木精-伊红染色³¹。之后使用切片扫描仪对样本进行数字化，并利用图像分析软件进行分析。

结果

鸡胚存活率
从开窗（胚胎发育第3天）到卵巢组织移植（胚胎发育第7天）期间，鸡胚的存活率为79%（33/42）。由于无法确定第0天受精蛋的比例，因此额外订购了Lohman选育的白来航鸡的第0天鸡蛋，以确保有足够数量的受精蛋可用于移植。共使用了23枚具有活力的第7天鸡蛋进行移植，其中1枚在移植后24小时内死亡，最终移植后的总体胚胎存活率为96%（22/23）。

移植物的大体形态
移植后1天，所有移植物（10/10）均呈现存活状态，且已至少部分黏附于尿囊绒毛膜（CAM），显示出血管化所需的轮辐状血管分布模式（图2A、B）。移植6天后，除两个未成功黏附于CAM的移植物外，其余所有植入物仍保持黏附状态（图2C）。这两个未黏附的移植物呈现坏死外观，被排除于后续分析之外（图3），因此移植6天后的组织存活...

讨论

本方案中最具挑战性的步骤是在蛋壳上打一个小孔，以抽吸蛋白，从而在开窗前将绒毛尿囊膜（CAM）与蛋壳分离。施加过大的压力可能导致穿刺过深，甚至使蛋壳破裂，从而对CAM及其血管系统造成不可逆的损伤。为了在初次尝试分离CAM时尽量减少失误，强烈建议使用直头针在未受精的市售鸡蛋蛋壳上练习打小孔。此外，鉴于不同批次鸡蛋的受精率存在天然差异，并且并非所有胚胎都能存活通过该操作，建议从鸡蛋供应商处获取额外的备用鸡蛋。为了获得最佳的胚胎存活率和充分发育的CAM，鸡蛋必须在理想的条件下孵化。如果胚胎活力较低，可能由多种因素导致，需逐一排查。应联系鸡蛋供应商，因为当前供应商提供的胚胎活力本身可能较低。低孵化率也可能源于孵化箱设置不准确或不恰当，这会损害CAM的发育。使用独立的湿度计和温度计可确保环境参数准确且稳定，但具体的故障排查说明应由设备制造商提供。最后，也有研究指出，过于频繁地检查移植后的鸡蛋可能导致温度和湿度波动，从而对移植物胚胎产生不利影响³³。

在本实验方案中，于胚胎发育第3天（ED第3天）通过吸取约2 mL蛋白液使绒毛尿囊膜（CAM）与蛋壳...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Agani 皮下注射针头，19 G	泰尔茂欧洲	AN*1950R1	用19 G针头抽吸蛋清
Terumo 注射器，5 mL 同轴鲁尔锁	泰尔茂欧洲	SS*05LE1	5 mL无菌注射器
Caseviewer v2.2	3DHISTECH		图像分析软件
乙醚	默克化学公司	603-022-00-4	无菌乙醚用于损伤CAM
0.5% 伊红Y水溶液	默克	1098441000	染色液
4% 甲醛水溶液（10% 福尔马林缓冲液）	VWR	97139010	用于组织固定的甲醛
冰箱	Liebherr	7081260	4°C冰箱 °用于石蜡包埋的 C
加热板	Schott	SLK2	用于烘干载玻片的加热板
培养箱	Thermo Forma Scientific 3111	10365156	用于玻片孵育的烘箱
Leica CLS 150 XE 显微镜冷光源	Leica	CLS 150 XE	使用局部冷光源对卵进行透照
镜头清洁纸，541级	VWR	111-5003	组织在无菌乙醚中浸泡以损伤CAM
迈耶氏苏木精	默克	1092491000	染色液
甲醇	VWR	20847307	甲醇
切片机	ThermoScientific-MICROM	HM325-2	切片机
Pannoramic P250 Flash III	3DHISTECH	/	20倍放大倍率的切片扫描仪
多聚甲醛	默克	1,04,00,51,000	石蜡包埋液
Paraplast Plus R	Sigma	P3683-1KG	石蜡
培养皿，60×15 mm，无菌	格雷纳	628161	无菌培养皿
针持	Fine Science Tools	26016-12	针持
多孔孵化	Brinsea	CP01F	带有自动旋转装置的鸡蛋孵化箱
132毫米线锯刀片	Sencys	/	锯片用于在蛋壳上开窗
不锈钢插针	Fine Science Tools	26007-02	用直针在蛋壳上打孔
Steril-Helios	Angelantoni Industrie	ST-00275400000	层流罩
Superfrost Plus 载玻片杆é90 秒°	VWR	631-9483	载玻片
Tissue-Tek VIP 6Al	Sakura	60320417-0711 VID6E3-1	自动包埋装置
钛合金镊子	Fine Science Tools	11602-16	用于去除卵壳和操作卵巢组织的镊子
甲苯，对	VWR	28701364	石蜡包埋液