利用鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型研究卵巢组织移植

摘要

本文介绍了一种建立人卵巢组织鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）异种移植模型的实验方案，并验证了该技术的有效性、移植物血管重建的时间进程以及在6天移植期内组织的存活能力。

摘要

卵巢组织冷冻保存与移植是保存生育力的有效策略，但存在一个主要缺点，即移植后由于卵泡异常激活和死亡，导致短期内发生大量卵泡丢失。啮齿类动物是研究卵泡激活的基准模型，但其成本、耗时及伦理问题日益突出，促使人们开发替代模型。鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型具有成本低、维护简便等优势，因而尤为吸引人 天然免疫缺陷持续至受精后第17天，使其成为理想的研究模型 人卵巢组织的短期异种移植。CAM 具有高度血管化的特点，已被广泛用作研究血管生成的模型。这使其相较于其他模型具有显著优势 体外 模型，并允许研究影响移植后早期毛囊丢失过程的机制。本文所述方案旨在描述一种用于人卵巢组织的CAM异种移植模型的建立，重点阐述该技术的有效性、移植物血管重建的时间进程，以及在6天移植期内组织的存活情况。

引言

近年来，出于肿瘤学和良性疾病治疗以及社会因素考虑，生育力保存的需求显著增加。然而，用于治愈恶性及非恶性疾病的多种治疗方法对性腺具有高度毒性，可能导致医源性早发性卵巢功能不全，最终引发不孕¹。目前 established 的生育力保存技术包括胚胎冷冻保存、未成熟或成熟卵母细胞玻璃化冷冻，以及卵巢组织冷冻保存^2,3,4。对于青春期前女孩或需要立即接受癌症治疗的女性，卵巢组织冷冻是目前唯一可用的生育力保存手段。卵巢组织移植后，超过95%的受试者可恢复内分泌功能，活产率介于18%至42%之间^5,6,7,8,9。

尽管冻融卵巢组织移植已取得成功，但仍存在改进空间。实际上，由于卵巢皮质碎片在移植时未进行血管吻合，因此会经历一段缺氧期，直至移植物重新建立血液供应

方案

该研究使用的人体组织已获得鲁汶天主教大学机构审查委员会的批准。患者已签署书面知情同意书，同意将其卵巢组织用于科研目的。

1. 订购极可能已受精的第0天卵

1. 寻找经过认证的实验室级Lohman选育的白来航鸡种蛋供应商，该供应商应报告较高的胚胎发育率，这主要取决于雏鸡的年龄。

2. 准备受精卵进行孵化

1. 在鸡蛋到达之前，将孵化箱组装好，并调节至37 °C，相对湿度保持在40%–60%。通过将温度计和湿度计放入孵化箱内，监测温度和空气湿度。确保孵化箱的盖子配有玻璃窗，以便在不打开箱盖的情况下检查内部参数（图1）。
2. 从经认证的实验级蛋品供应商处获得第0天的洛曼白来航鸡种蛋后，使用湿润的纸巾清洁蛋壳表面，并立即擦干。
   注意：由于蛋壳膜具有多孔性，可使用高压灭菌水清洁蛋壳表面，并用于控制孵化箱内的湿度，以尽量降低污染风险。
3. 使用记号笔对鸡蛋进行标记（例如日期和蛋编号）。
4. 将鸡蛋尖端朝下放入孵化箱中孵化，并定期翻转以促进绒毛尿囊膜（CAM）的发育。每天手动将鸡蛋翻转180°两到三次，或使用 自动旋转装置。
   注意：为确保鸡蛋确实被翻转，可用铅笔或记号笔在鸡蛋....

结果

鸡胚存活率
从开窗（胚胎发育第3天）到卵巢组织移植（胚胎发育第7天）期间，鸡胚的存活率为79%（33/42）。由于无法确定第0天受精蛋的比例，因此额外订购了Lohman选育的白来航鸡的第0天鸡蛋，以确保有足够数量的受精蛋可用于移植。共使用了23枚具有活力的第7天鸡蛋进行移植，其中1枚在移植后24小时内死亡，最终移植后的总体胚胎存活率为96%（22/23）。

移植物的大体形态
移植后1天，所有移植物（10/10）均呈现存活状态，且已至少部分黏附于尿囊绒毛膜（CAM），显示出血管化所需的轮辐状血管分布模式（图2A、B）。移植6天后，除两个未成功黏附于CAM的移植物外，其余所有植入物仍保持黏附状态（图2C）。这两个未黏附的移植物呈现坏死外观，被排除于后续分析之外（图3），因此移植6天后的组织存活.......

讨论

本方案中最具挑战性的步骤是在蛋壳上打一个小孔，以抽吸蛋白，从而在开窗前将绒毛尿囊膜（CAM）与蛋壳分离。施加过大的压力可能导致穿刺过深，甚至使蛋壳破裂，从而对CAM及其血管系统造成不可逆的损伤。为了在初次尝试分离CAM时尽量减少失误，强烈建议使用直头针在未受精的市售鸡蛋蛋壳上练习打小孔。此外，鉴于不同批次鸡蛋的受精率存在天然差异，并且并非所有胚胎都能存活通过该操作，建议从鸡蛋供应商处获取额外的备用鸡蛋。为了获得最佳的胚胎存活率和充分发育的CAM，鸡蛋必须在理想的条件下孵化。如果胚胎活力较低，可能由多种因素导致，需逐一排查。应联系鸡蛋供应商，因为当前供应商提供的胚胎活力本身可能较低。低孵化率也可能源于孵化箱设置不准确或不恰当，这会损害CAM的发育。使用独立的湿度计和温度计可确保环境参数准确且稳定，但具体的故障排查说明应由设备制造商提供。最后，也有研究指出，过于频繁地检查移植后的鸡蛋可能导致温度和湿度波动，从而对移植物胚胎产生不利影响³³。

在本实验方案中，于胚胎发育第3天（ED第3天）通过吸取约2 mL蛋白液使绒毛尿囊膜（CAM）与蛋壳.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Agani 皮下注射针头，19 G	泰尔茂欧洲	AN*1950R1	用19 G针头抽吸蛋清
Terumo 注射器，5 mL 同轴鲁尔锁	泰尔茂欧洲	SS*05LE1	5 mL无菌注射器
Caseviewer v2.2	3DHISTECH		图像分析软件
乙醚	默克化学公司	603-022-00-4	无菌乙醚用于损伤CAM
0.5% 伊红Y水溶液	默克	1098441000	染色液
4% 甲醛水溶液（10% 福尔马林缓冲液）	VWR	97139010	用于组织固定的甲醛
冰箱	Liebherr	7081260	4°C冰箱 °用于石蜡包埋的 C
加热板	Schott	SLK2	用于烘干载玻片的加热板
培养箱	Thermo Forma Scientific 3111	10365156	用于玻片孵育的烘箱
Leica CLS 150 XE 显微镜冷光源	Leica	CLS 150 XE	使用局部冷光源对卵进行透照
镜头清洁纸，541级	VWR	111-5003	组织在无菌乙醚中浸泡以损伤CAM
迈耶氏苏木精	默克	1092491000	染色液
甲醇	VWR	20847307	甲醇
切片机	ThermoScientific-MICROM	HM325-2	切片机
Pannoramic P250 Flash III	3DHISTECH	/	20倍放大倍率的切片扫描仪
多聚甲醛	默克	1,04,00,51,000	石蜡包埋液
Paraplast Plus R	Sigma	P3683-1KG	石蜡
培养皿，60×15 mm，无菌	格雷纳	628161	无菌培养皿
针持	Fine Science Tools	26016-12	针持
多孔孵化	Brinsea	CP01F	带有自动旋转装置的鸡蛋孵化箱
132毫米线锯刀片	Sencys	/	锯片用于在蛋壳上开窗
不锈钢插针	Fine Science Tools	26007-02	用直针在蛋壳上打孔
Steril-Helios	Angelantoni Industrie	ST-00275400000	层流罩
Superfrost Plus 载玻片杆é90 秒°	VWR	631-9483	载玻片
Tissue-Tek VIP 6Al	Sakura	60320417-0711 VID6E3-1	自动包埋装置
钛合金镊子	Fine Science Tools	11602-16	用于去除卵壳和操作卵巢组织的镊子
甲苯，对	VWR	28701364	石蜡包埋液