即用型冷冻神经元储备是评估突触功能的有力工具。本文介绍一种利用96孔板，从冷冻储备中建立简易低密度原代培养的方法。
本文内容
摘要
摘要
神经元培养是评估突触功能和药物筛选的有价值体系。特别是低密度的原代海马神经元培养，可用于研究单个神经元或亚细胞组分。我们已利用低密度原代海马神经元培养，通过免疫细胞化学方法展示了神经元内亚细胞蛋白的定位、神经元极性、突触形态及其发育过程中的变化。近年来，即用型冷冻保存的神经元已实现商业化供应。这些冷冻保存的神经元可减少动物实验准备所需时间，同时有助于减少实验动物的使用数量。本文介绍了一种基于96孔板的可重复的低密度原代培养方法。我们使用了来自大鼠胚胎海马的商业化冷冻保存神经元。通过在特定时间点抑制胶质细胞的生长，这些神经元可实现长期稳定培养而无需更换培养基。这种基于低密度培养的高通量检测方法，可实现对突触可塑性的可重复成像评估。
引言
建立一种能够评估学习和记忆相关突触功能的体外实验系统具有重要意义。神经元培养是一种用于在体外评估突触功能的重要体系。神经元培养技术最早于20世纪80年代开始应用，到90年代发展出了原代海马神经元的低密度培养方法1,2,3，可用于研究单个神经元的亚细胞蛋白定位、蛋白质转运、神经元极性、树突棘形态、突触发育及可塑性4,5,6,7,8。然而，该技术涉及多个步骤：动物交配、胚胎解剖、培养器皿准备，以及持续3周、每周更换一次培养基的细胞培养过程。此外，该技术还需要较高的操作技巧3。
我们已制备了来自大鼠胚胎的离体海马神经元的冻存细胞库9,10。这些神经元冻存细胞可直接使用，培养过程中无需复杂的预处理技术11,12。换句话说，从冻存细胞库中培养神经元不依赖实验人员的技术水平。该方法避免了动物实验（例如申请动物实验许可、安排定时交配的孕鼠以及解剖大鼠胚胎），从而减少了实验动物的使用数量。近年来，高质量且可直接使用的神经元冻存细胞已实现商业化供应。本研究中，我们采用了来自胚胎第18天（E18）大鼠海马组织的商业化冻存神经元细胞13,14,15。从冻存细胞库中培养神经元无需使用胶质细胞条件培养基，也无需与胶质细胞共培养。仅使用不含额外血清的普通原代培养基即可完成细胞培养，因此可以获得可重复的实验数据。此外，由于胶质细胞的增殖受到抑制，在细胞接种后三周内无需更换培养基（图1）。
树突棘是大多数兴奋性突触的突触后区室，其中包含受体蛋白、突触后支架蛋白以及肌动蛋白细胞骨架蛋白。我们重点关注一种肌动蛋白结合蛋白drebrin5,6,7,16,17,18。drebrin在成熟神经元的树突棘头部富集19，我们曾报道drebrin可作为突触状态的标志物15,17,20,21,22,23。近期，我们以drebrin为读出指标进行高内涵分析，报道了苯环己哌啶类似物对N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受体（NMDARs）的抑制作用10，以及天然化合物和粗提药物对突触状态的NMDAR依赖性效应15。
本文详细介绍了如何在低密度条件下培养冻存的神经元。此外，我们展示了利用96孔板通过drebrin成像评估突触状态的方法。
方案
1. 包被平板
- 用多聚-L-赖氨酸（1 mg/mL，溶于 0.1 M 硼酸盐缓冲液 [pH: 8.5]，每孔 100 µL）包被 96 孔微孔板，37 °C 下孵育过夜。
注意：仅包被需要使用的孔。本实验中使用中间的 60 个孔。硼酸盐缓冲液通过将 50 mM 硼酸和 12 mM 硼酸盐溶于无菌水配制而成。 - 用无菌水洗涤微孔板两次（每孔 250 µL）。
- 用不含添加剂的新鲜培养基洗涤微孔板一次（每孔 250 µL）。
- 在洁净台中干燥微孔板 20 分钟。
- 用铝箔纸包裹微孔板，4 °C 保存备用（有效期为 1 个月）。
2. 细胞接种
- 向包被好的孔板中每孔加入 50 µL 培养基，置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 30 分钟至 1 小时。将周边孔中加入无菌水（200 µL/孔）。
注意：培养基的配制方法是将 50 倍 B-27 添加物、400 倍 Glutamax 和 100 U/mL 青霉素/链霉素加入神经基础培养基中（详见材料表）。 - 从液氮罐中取出神经元冻存管。此处使用的神经元为 DMSO 冻存的神经元11。
- 将冻存管浸入 37 °C 金属加热块中，最多加热 3 分钟，使内容物部分融化。避免过度加热。一旦融化，立即转移至 50 mL 离心管中。
- 使用带宽孔枪头的 1 mL 移液器，以逐滴方式（50 µL/s）缓慢将冻存管中的内容物转移至无菌 50 mL 离心管中。
- 用 1 mL 培养基（室温；RT）冲洗空的冻存管，并将此 1 mL 培养基以逐滴方式（50 µL/s）转移至含有细胞悬液的 50 mL 离心管中。
- 向 50 mL 离心管中逐滴加入 9 mL 培养基（RT）（0.5 mL/s），最终体积为 11 mL。不要反复吹打，仅需缓慢混匀细胞悬液。
- 计数细胞数量（可使用细胞计数仪或血细胞计数板）。
- 将全部细胞悬液转移至储液槽中，使用带宽孔枪头的多通道移液器将细胞悬液分配至 96 孔板（每孔 1.0 × 104 个细胞）。为减少培养基蒸发，将周边孔中加入无菌水（步骤 2.1）。
注意：本研究证实，在为期 3 周且不更换培养基的培养过程中，培养基蒸发量较小。培养基减少率为 3.6%（n = 120 孔）。因此，在 3 周的孵育期间，渗透压变化不会显著。 - 将神经元置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 1–2 小时。
- 每孔更换为 100 µL 预热的培养基（37 °C），放回 37 °C、5% CO2 培养箱中继续培养（培养期间无需更换培养基）。
3. 阿糖胞苷处理
- 4天时 体外 （DIV），加入阿糖胞苷（cytosine β-D-arabino-furanoside, Ara-C），使每孔终浓度为 0.2 µM，以抑制胶质细胞生长。
4. 药物处理
- 21天时 体外用感兴趣的药物处理细胞。
- 在药物处理期间，将培养板的温度保持在 37 °C。
- 作为阳性对照，在固定前用100 µM谷氨酸（每孔终浓度）处理细胞10分钟。
5. 固定
- 固定时，使用含 4% 多聚甲醛的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（100 µL/孔）。
- 固定约 20 分钟后，用磷酸盐缓冲液（PBS；250 µL/孔）洗涤孔板，每次 5 分钟，共洗 2 次。
6. 免疫细胞化学
- 用 PBS（每孔 250 µL）洗涤细胞 1 次，每次 5 分钟。
- 用含 0.1% Triton X-100 的 PBS（每孔 100 µL）对细胞进行透化处理，持续 5 分钟。
- 用 PBS（每孔 250 µL）洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
- 封闭时使用含 3% 牛血清白蛋白的 PBS（PBSA；每孔 100 µL），在室温下孵育 1 小时。
- 在 4 °C 下，用抗 drebrin 抗体（1:1）和抗微管相关蛋白 2（MAP2）抗体（1:1000）（每孔 60 µL）孵育细胞，过夜。
- 用 PBS（每孔 250 µL）洗涤细胞 4 次，每次 5 分钟。
- 在室温下，用相应的二抗和 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI；1:1000）溶于 PBSA（每孔 60 µL）中孵育细胞 2 小时。
- 用 PBS（每孔 250 µL）洗涤细胞 4 次，每次 5 分钟。
- 将细胞保存在含 0.1% 叠氮化钠的 PBS 中（每孔 150 µL）。
7. 图像采集与分析
- 为获取图像，使用合适的显微镜。
- 为识别神经元的胞体，请结合 MAP2 阳性和 DAPI 阳性区域进行判断。
- 为识别神经元的树突，请观察不含胞体的 MAP2 阳性信号。
- 为识别 drebrin 簇，请在 MAP2 阳性树突上观察 drebrin 阳性信号的分布。
结果
按照实验方案，将神经元在96孔板中培养21天，随后用谷氨酸处理（图1）。在连续3周未更换培养基的情况下，神经元仍能正常发育（图2）。我们使用多种浓度的谷氨酸（1 µM、3 µM、10 µM、30 µM 和 100 µM，用无菌水稀释）处理细胞10分钟，随后进行固定。进行免疫细胞化学染色，并利用配备sCMOS相机的自动荧光显微镜获取drebrin和MAP2的荧光图像。如图3所示，沿MAP2阳性树突可清晰观察到drebrin阳性树突棘。已有研究表明，谷氨酸刺激可通过NMDAR引起Ca2+内流，导致drebrin从树突棘中移出，从而降低drebrin簇的密度5,17。相应地，我们观察到在谷氨酸刺激下，drebrin簇密度呈剂量依赖性降低10（图4）。如图5所示，若以drebrin作为突触状态的标记物，该方法具有高度可重复性。
图1：方法示意图。 神经元在96孔板中培养21天后，用谷氨酸处理。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：使用 96 孔板培养神经元的明场图像。 使用共聚焦定量成像细胞仪获取各发育阶段（DIV 1、7、14、21）的相差图像。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：免疫染色培养神经元的代表性图像。（左）drebrin（绿色）与MAP2（红色）的荧光叠加图像。中间和右侧面板分别显示drebrin与MAP2各自的荧光图像。白色矩形框示下方放大区域。比例尺：上方面板：50 µm，下方面板：20 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：谷氨酸剂量依赖性对标准化drebrin簇密度的影响。（A）代表性荧光图像，使用drebrin（绿色）和MAP2（红色）进行免疫染色，分别来自经0 µM、10 µM和100 µM谷氨酸处理的孔（从左至右）。比例尺：50 µm。（B）drebrin簇密度以对照组（0 µM）的平均值进行标准化。0 µM，N = 58个孔；1 µM，N = 46；3 µM，N = 54；10 µM，N = 45；30 µM，N = 54；100 µM，N = 55，数据来自13次使用不同批次试剂的实验。** P < 0.01，与对照组（0 µM）相比，经ANOVA分析后采用Dunnett多重比较检验。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：谷氨酸依赖性剂量反应对 drebrin 簇密度的影响。 来自六次使用不同批次样品的实验的原始数据。每个浓度（0 µM、3 µM、10 µM、30 µM 和 100 µM）包含 N = 4 个孔。数值以均值 ± 标准误（SEM）表示。请点击此处查看该图的放大版本。
图 6：冻存神经元细胞用于电生理实验的应用。（A）使用微电极阵列（MEA）板进行电生理实验的方案。包被：在接种细胞前一天，将每块48孔MEA板用聚乙烯亚胺（PEI：0.1%）溶液预先包被，并在37 °C下孵育1小时。随后用无菌水清洗3次，干燥1小时。然后将MEA板在4 °C下保存过夜。高密度培养：将50,000个细胞/孔的神经元接种至48孔MEA板中。细胞接种步骤如上文方案第2节所述进行。使用添加了层粘连蛋白（20 µg/mL）的培养基（向Neurobasal培养基中添加2 v/v% B-27、2.5 mM Glutamax和100 µg/mL青霉素/链霉素）接种神经元。此后，神经元在37 °C、5% CO2条件下用培养基进行培养。在DIV 1时完全更换培养基，直至DIV 3。在DIV 4时加入阿糖胞苷（Ara-C）（终浓度0.2 µM）。从DIV 5开始，每周两次更换50%培养基。使用MEA系统记录MEA板每个孔中神经元的活性。（B）在DIV 21时，使用MEA系统在37 °C、5% CO2环境下以每通道12.5 kHz的采样率记录自发性神经元活动。图中显示了一个孔内16个通道中的4个通道的记录结果。所有记录均应用了Butterworth带通滤波器（200–3,000 Hz）。箭头指示同步簇状放电的发生时间。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
该方法中的一个关键步骤是解冻细胞悬液。在细胞悬液尚未变得过热之前进行转移非常重要。然而，为避免渗透压的快速变化，切勿将细胞悬液一次性转移至大量培养基中。以滴加方式加入培养基也至关重要，可避免渗透压的突然变化。
神经元可以在其他培养容器中进行培养：24孔板、8孔腔室、60 mm培养皿或MED探针。然而，在这些情况下，需要调整阿糖胞苷（Ara-C）的终浓度及其添加时间。此外，神经元的密度需根据不同类型的实验进行优化。例如，电生理学实验需要高密度培养，此时需要每周更换两次培养基（图6）。因此，低密度培养所需的步骤少于高密度培养。
低密度神经元培养通常需要先进的技术；然而，使用即用型冻存细胞库可解决这一问题。所述方法不依赖实验人员的技术水平。冻存细胞库的质量稳定，只要将其保存在液氮中并避免温度变化，可稳定培养长达4年。
在不更换培养基的情况下培养细胞3周，会引发关于是否存在显著渗透压变化或培养基蒸发的疑问。然而，我们已证实培养基的蒸发量很小（减少率为3.6%）。突触蛋白的定位以及神经元的形态在3周后均保持正常。因此，在不更换培养基的情况下进行为期3周的培养不会引起显著的渗透压变化，从而影响培养神经元的状态。在Ara-C处理后将培养板置于培养箱中，也是减少蒸发的重要措施。
对于冷冻保存的神经元的使用没有限制。然而，低密度培养方法存在一些局限性。我们已证实，低密度培养可用于神经元形态学观察、突触功能评估以及GFP转染实验。但尚未进行活细胞成像研究。此外，如上所述，进行电生理学实验需要采用高密度培养。
突触成熟通常需要3周时间7，直到培养结束前我们都无法确认培养的神经元是否具有正常的突触。如果3周后突触成熟情况不佳，则必须重新进行培养。若能在实验开始前了解神经元的质量，便可节省这3周时间。因此，为了高效开展实验，最好在实验前预先检测神经元的质量。冷冻储备品使得提前检测神经元质量成为可能。每批冷冻储备品均来自同窝大鼠，我们可以从每批中取出一份样品用于质量检测。Drebrin是评估神经元质量的良好标志物。如前所述，drebrin会在成熟神经元的树突棘头部富集，并且能对突触刺激产生反应。因此，我们可以利用drebrin作为标志物来检测冷冻储备品中神经元的质量。
该方法可用于评估药物对突触状态的影响。在突触可塑性的初始阶段，树突棘中的drebrin会发生外流22。因此，通过药物处理诱导的drebrin簇减少可表明该药物能够激活突触并引发突触可塑性。此外，为了确定这种减少是否依赖于NMDAR，使用2-氨基-5-磷酸戊酸（APV，一种NMDAR拮抗剂）进行实验具有重要意义。利用drebrin作为标记物，甚至可以明确判断NMDAR依赖性10,15。所述方法在药物筛选、安全性药理学研究以及突触功能评估中具有重要应用价值。
披露
Tomoaki Shirao 是 AlzMed 公司的首席执行官。本研究由 AlzMed 公司资助（向 NK 提供 500,000 日元，用于名为“突触功能高通量分析”的项目）。
致谢
感谢神山一美和川端真奈在实验中的协助。本工作由日本学术振兴会科学研究费补助金（JSPS KAKENHI，课题编号19K08010，授予N.K.）以及日本医疗研究开发机构（AMED）（课题编号JP19bk0104077和JP22bm0804024，授予T.S.）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96 孔板 | Zeon Corporation | 赠品 | |
| 96 孔板 | greiner | 655986 | |
| 抗 drebrin 抗体 (M2F6) | MBL | D029-3 | 小鼠单克隆抗体（稀释比例 1:1） |
| 抗 MAP2 抗体 | Millipore | AB5622 | 兔 （稀释比例 1:1000） |
| 抗小鼠 Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11031 | 稀释比例 1:500 |
| 抗兔 Alexa Fluor | Thermo Fisher Scientific | A11008 | 稀释比例 1:500 |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | MEA 板中终浓度为 2 v/v%；普通板中为 50 倍稀释 |
| 硼砂 | Sigma | B-9876 | 终浓度 12 mM |
| 硼酸 | WAKO | 021-02195 | 终浓度 50 mM |
| 牛血清白蛋白 | Millipore | 12659-100G | 终浓度：PBS 中含 3% |
| 共聚焦定量图像细胞仪 CellVoyager CQ1 | YOKOGAWA | 相差图像 | |
| 胞嘧啶 β-D-阿拉伯呋喃糖苷 (Ara-C) | Sigma | C-6645 | 溶于 dH2O（终浓度：0.2 µM） |
| DAPI | FUJIFILM | 340-07971 | 稀释比例 1:1000 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | MEA 板中为 2.5 mM；普通板中为 400 倍稀释 |
| In Cell Analyzer 2200 | Cytiva | 荧光图像 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma | 114956-81-9 | 终浓度：20 µg/mL |
| Maestro | Axion Biosystems | MEA 记录 | |
| MEA 板 | Axion Biosystems | M768-tMEA-48W | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| 多聚甲醛 | nacalai tesque | 26126-25 | 终浓度：PBS 中含 4% |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | 普通板中为 100 U/mL |
| 青霉素/链霉素 | nacalai tesque | 26253-84 | MEA 板中为 100 µg/mL |
| 聚乙烯亚胺 | Sigma | 9002-98-6 | 终浓度：0.1% |
| 多聚-L-赖氨酸 | Sigma | P2636 | 溶于硼酸缓冲液（终浓度：1 mg/mL） |
| SKY Neuron | AlzMed , Inc. | ARH001 | 1.0 × 106 个细胞/管 |
| 叠氮化钠 | FUJIFILM | 195-11092 | 0.1% |
| L(+)-谷氨酸钠一水合物 | WAKO | 194-02032 | 溶于 dH2O（终浓度：1 µM、3 µM、10 µM、30 µM、100 µM） |
参考文献
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