高级别浆液性卵巢癌患者来源类器官的建立与培养

摘要

患者来源的类器官（PDO）是一种三维（3D）培养体系，可在体外模拟肿瘤微环境。in vitro。在高级别浆液性卵巢癌中，PDO 为研究新型生物标志物和治疗手段提供了一种模型。

摘要

类器官是一种三维动态肿瘤模型，可成功地从患者来源的卵巢肿瘤组织、腹水或胸腔积液中培养获得，有助于发现卵巢癌的新疗法和预测性生物标志物。这些模型能够重现克隆异质性、肿瘤微环境以及细胞间和细胞-基质间的相互作用。此外，研究已表明，类器官在形态学、细胞学、免疫组织化学和遗传学特征上均与原发性肿瘤相匹配。因此，类器官为肿瘤细胞及肿瘤微环境的研究提供了有力工具，优于传统的细胞系模型。本实验方案描述了从患者肿瘤组织、腹水和胸腔积液样本中建立患者来源性卵巢癌类器官的多种方法，成功率超过97%。患者样本通过机械和酶消化方法分离为单细胞悬液，随后将细胞接种于基底膜提取物（BME）中，并使用含有特定补充成分的优化培养基进行培养，以支持高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）类器官的生长。在初始类器官形成后，这些患者来源性类器官（PDOs）可实现长期培养，并可通过传代扩增用于后续实验。

引言

2021年，美国约有21,410名女性新被诊断为上皮性卵巢癌，其中12,940名女性死于该疾病¹。尽管在外科手术和化疗方面已取得一定进展，但超过70%的晚期患者会出现化疗耐药，并在确诊后5年内死亡^2,3。因此，迫切需要开发治疗这种致命疾病的新策略，以及适用于临床前研究的代表性且可靠的模型。

来源于原发性卵巢肿瘤的癌细胞系和患者来源的异种移植模型（PDX）是卵巢癌研究中使用的主要工具。癌细胞系的主要优势在于其可快速扩增。然而，长期培养会导致其表型和基因型发生改变，从而使癌细胞系偏离原始的原发性肿瘤样本。由于癌细胞系与原发性肿瘤之间存在差异，在细胞系中显示有效果的药物试验往往在临床试验中无法取得相同的效果²。为了克服这些局限性，研究人员采用PDX模型。这些模型通过将新鲜的卵巢癌组织植入免疫缺陷小鼠体内而建立。由于属于in vivo模型，它们能更准确地模拟人类生物学特征，因而对药物疗效的预测性也更强。然而，这些模型也存在显著的局限性，包括构建过程所需的成本、时间和资源⁴。

PDOs 为临床前研究提供了一种替代模型，克服了肿瘤细胞系和PDX模型的局限性。....

方案

所有用于研究的人类组织标本均根据机构审查委员会批准的方案获取。下述方案在无菌的人类组织培养环境中进行。已获得人类受试者的书面知情同意。符合条件的患者需确诊或疑似诊断为卵巢癌，愿意且能够签署知情同意书，且年龄至少为18岁。在患者手术时，从同意参与的患者处获取肿瘤组织（恶性原发肿瘤或转移灶）、腹水和胸腔积液。这些标本立即运送至实验室，并按照下述方法进行处理以用于类器官的生成。

1. 培养基制备

1. 完全类器官培养基制备
   1. 根据已发表文献的方法制备R-spondin 1/Noggin条件培养基⁷.
      注意：R-spondin-1/Noggin 条件培养基是市售重组蛋白的一种更具成本效益的替代品。稳定分泌 R-spondin-1 和 Noggin 的 HEK293T 细胞 通过 慢病毒介导的转导载体由圣路易斯华盛顿大学医学院的Ron Bose和纽约长老会/哥伦比亚大学欧文医学中心的Anil Rustgi慷慨馈赠。^8,9,10. 商业化的条件培养基可作为替代品使用（参见 材料列表).

结果

为生成患者来源类器官，样本经机械与酶消化处理为单细胞悬液。随后将细胞重悬于基底膜提取物中，并补充特定配制的培养基。图 3）。类器官的建立通常需要10天时间，此后培养体系中可观察到离散的类器官结构。图 4).

图 3患者样本构建为类器官的示意图。 患者组织、腹水或胸腔积液通过机械或酶消化处理。随后将单细胞悬液接种于基底膜提取物中，在针对高级别浆液性卵巢癌定制的专用生长培养基支持下进行培养增殖。

讨论

卵巢癌由于在诊断时通常已处于晚期，且常出现化疗耐药，因此致死率极高。尽管研究人员通过使用癌细胞系和PDX模型在卵巢癌研究中取得了诸多进展，但仍明显缺乏更具代表性且成本较低的模型 体外 模型。PDOs 已被证实能够准确代表其原发肿瘤的肿瘤异质性、肿瘤微环境以及基因组和转录组特征，因此是多种研究方法的理想临床前模型，例如将类器官模型应用于药物治疗研究。¹⁶.

本文所述方案非常有效且可靠，成功率达到97%。需要特别指出的是，本方案中存在若干关键步骤，需格外注意。首先，在从组织中收获类器官时，必须确保样品完全均质化；必要时可多次运行解离程序。如果样品不均匀，残留的组织碎片可能会影响类器官的生长。其次，由于基底膜提取物（BME）的工作温度为2–8 °C，因此所有涉及该试剂的操作均需在冰上进行，以防止其发生聚合。此外，在用BME重悬和铺板时，必须避免产生气泡，否则会导致铺好的类器官分装物不稳定，从而从培养板上脱落。最后，本方案中使用的BME来源于Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）肿瘤，因此不同批次之间可能存在成.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% HEPES	Life Technologies	15630080
1% 青霉素-链霉素	Fisher Scientific	30002CI
1.5 mL 离心管	Genesee Scientific	14125
10 cm 细胞培养皿	TPP	93100
10 mL 血清移液管
100 µm 细胞滤膜	MidSci	100ICS
15 mL 离心管	Corning	430052
2 mL 冻存管	Simport Scientific	T301-2
2% 多聚甲醛固定液	Sigma-Aldrich
37 °C 水浴箱	NEST	602052
3dGRO R-脊椎蛋白-1 条件培养基补充剂	Millipore Sigma	SCM104
6 孔板	TPP	92006
70% 乙醇	Sigma-Aldrich	R31541GA
A83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
高级 DMEM/F12 培养基	ThermoFisher	12634028
琼脂	Lamda Biotech	C121
B-27	Life Technologies	17504044
离心机
Cultrex Type 2	R&D Systems	3533-010-02	基底膜提取物
DNase I	New England Bio Labs	M0303S
DNase I 反应缓冲液	New England Bio Labs	M0303S
EGF	PeproTech	AF-100-15
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
FGF-10	PeproTech	100-26
FGF2	PeproTech	100-18B
gentleMACS C 管	Miltenyi BioTech	130-096-334
带加热模块的 gentleMACS Octo 组织解离器	Miltenyi BioTech	130-096-427	我们使用厂商提供的操作方案。
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	二肽，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
苏木精和伊红染色试剂盒	Fisher Scientific	NC1470670
Histoplast 石蜡	Fisher Scientific	22900700
微量离心机
Mr. Frosty 冻存容器	Fisher Scientific	07202363S
N-乙酰半胱氨酸	Sigma-Aldrich	A9165
烟酰胺	Sigma-Aldrich	N0636
p1000 移液器及吸头
p200 移液器及吸头
9" 帕斯特移液管	Fisher Scientific	1367820D
PBS	Fisher Scientific	MT21031CM
移液控制器
前列腺素 E2	R&D Systems	2296
嘌呤霉素	ThermoFisher	A1113802
重组小鼠 Noggin 蛋白	PeproTech	250-38
Recovery 无血清细胞冻存液	Invitrogen	12648010
红细胞裂解缓冲液	BioLegend	420301
ROCK 抑制剂 (Y-27632)	R&D Systems	1254/1
SB202190	Sigma-Aldrich	S7076
T75 培养瓶	MidSci	TP90076
细胞培养超净台
组织包埋盒
TrypLE Express	Invitrogen	12604013	无动物来源，重组酶
II 型胶原酶	Life Technologies	17101015
涡旋振荡器