可视化患者来源卵巢癌类器官中的DNA损伤修复蛋白 通过 免疫荧光检测

摘要

本方案描述了在患者来源的卵巢癌类器官中评估DNA损伤修复蛋白的方法。内容包括全面的铺板和染色方法，以及详细且客观的定量分析流程。

摘要

免疫荧光是一种广泛使用的技术，可用于高灵敏度和高特异性地可视化目标抗原，从而准确鉴定和定位蛋白质、糖类及小分子。尽管该技术在二维（2D）细胞培养中已十分成熟，但其在三维（3D）细胞模型中的应用尚不明确。卵巢癌类器官是一种三维肿瘤模型，能够重现肿瘤细胞的克隆异质性、肿瘤微环境以及细胞间和细胞-基质间的相互作用，因此在评估药物敏感性和功能生物标志物方面优于传统细胞系。因此，能够在原代卵巢癌类器官上应用免疫荧光技术，对于深入理解该癌症的生物学特性具有重要意义。本研究描述了在高级别浆液性患者来源的卵巢癌类器官（PDOs）中检测DNA损伤修复蛋白的免疫荧光技术。在将PDOs暴露于电离辐射后，对完整类器官进行免疫荧光染色，以评估核内蛋白形成的焦点结构。通过共聚焦显微镜的z轴层扫成像采集图像，并利用自动焦点计数软件进行分析。所述方法可实现对DNA损伤修复蛋白在时间和空间上的招募动态分析，以及这些蛋白与细胞周期标志物的共定位研究。

引言

卵巢癌是导致妇科恶性肿瘤患者死亡的首要原因。大多数患者接受以卡铂为代表的DNA损伤类药物治疗，而同源重组修复（HRR）缺陷型肿瘤患者还可使用聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂^1,2。然而，大多数患者会对这些疗法产生耐药性，并在确诊后5年内死亡。DNA损伤应答（DDR）的失调已被证实与卵巢癌的发生发展以及化疗和PARP抑制剂耐药密切相关³。因此，研究DDR对于理解卵巢癌的病理生理机制、潜在生物标志物以及开发新型靶向治疗策略至关重要。

目前评估DNA损伤应答（DDR）的方法主要采用免疫荧光（IF），因为该技术能够准确识别和定位DNA损伤相关蛋白及核苷酸类似物。当DNA发生双链断裂（DSB）时，组蛋白H2AX会迅速被磷酸化，形成DNA损伤修复蛋白聚集的焦点⁴。这种磷酸化可通过IF轻松检测；事实上，ɣ-H2AX检测已被广泛用于确认DSB的产生^5,6,7,8,

方案

在获得患者知情同意后，采集肿瘤组织和腹水样本，样本来源于圣路易斯华盛顿大学机构审查委员会（IRB）批准的妇科肿瘤生物样本库。纳入患者均为晚期高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）。除非另有说明，所有操作均在室温下于实验台进行。所有试剂均在室温下配制（另有说明除外），并储存于 4 °C。

1. 类器官生成

1. 按照先前发表的文献报道生成类器官²⁰。

2. 类器官的铺板与辐照

1. 在培养物中使用类器官时，通过手动操作移液枪头将类器官从培养皿上分离下来。将类器官收集至15 mL锥形管中。
2. 在4 °C条件下，以1,650 × g离心5分钟。使用移液器小心吸除上清液。
3. 向沉淀中加入1,000 µL无动物来源的重组酶（参见材料表）。混匀溶液，并在37 °C下孵育15分钟。
4. 在4 °C条件下，以1,650 × g离心5分钟。使用移液器小心吸除上清液。
5. 离心和吸除上清后，将沉淀重悬于1,000 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中。
6. 取10 µL溶液转移至1.5 mL微量离心管中，并与10 µL台盼蓝混合。
....

结果

本方案可成功对类器官中的细胞核DNA损伤修复蛋白进行染色、成像和定量。该技术被用于在照射前后对患者来源的类器官（PDO）进行染色和评估。PDO接受10 Gy辐射处理，并检测以下生物标志物：ɣ-H2AX（图1），DNA损伤标志物；RAD51（图2），同源重组修复（HRR）标志物；53BP1，非同源末端连接（NHEJ）标志物；RPA，复制应激标志物（图3）；以及geminin，G2/S期细胞周期标志物¹⁴。选择10 Gy剂量是基于先前研究卵巢癌中DNA损伤的已发表文献^6,22。采用JCountPro软件识别细胞核，并根据图示参数对细胞核内焦点数量进行定量分析¹³（图4）。该软件首先识别细胞核（<.......

讨论

DNA损伤应答在卵巢癌的发生发展以及化疗耐药性中均发挥着关键作用。因此，深入理解DNA修复机制至关重要。本文介绍了一种用于在三维完整类器官中研究DNA损伤修复蛋白的方法。该方法建立了一套可重复且可靠的实验流程，利用标志性抗体来评估DNA损伤、同源重组、非同源末端连接以及复制应激。重要的是，本研究通过基因修饰的对照样本验证了这些方法的特异性和灵敏度。

本方案中最关键的步骤是类器官的铺板和固定。该方案特别要求在固定过程中，将类器官在2%多聚甲醛（PFA）中孵育10分钟，并在固定期间密切监测基底膜提取物（BME）的状态。这与其它类器官免疫荧光染色方案不同，后者通常建议使用4% PFA固定10至60分钟^23,24,25。研究发现，如果BME的胶状结构长时间暴露于高浓度PFA中，其结构会解聚，并在后续操作中容易被吸除。值得注意的是，特定BME产品的制造商通常会提供有关固定的建议。另一个需要讨论的重要问题是类.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含钙镁的1×磷酸盐缓冲液（PBS++）	Sigma	14-040-133
不含钙镁的1×磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific	ICN1860454
Ant-53BP1 抗体	BD Biosciences	612522	用染色缓冲液按1:500稀释
Ant-Geminin 抗体	Abcam	ab104306	用染色缓冲液按1:200稀释
Anti-Geminin 抗体	ProteinTech	10802-1-AP	用染色缓冲液按1:400稀释
Anti-RAD51 抗体	Abcam	ab133534	用染色缓冲液按1:1000稀释
Anti-γH2AX 抗体	Millipore-Sigma	05-636	用染色缓冲液按1:500稀释
Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) 抗体	Bethyl Laboratories	A300-245A-M	用染色缓冲液按1:200稀释
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher Scientific	BP1605 100
离心机；Sorvall St 16R 离心机	Thermo Scientific	75004240
共聚焦显微镜，Leica SP5 共聚焦系统 DMI4000	Leica	389584
15 mL 圆锥形离心管	Corning	14-959-53A
Countess 3 FL 全自动细胞计数仪（细胞计数仪）	Thermo Scientific	AMQAF2000
Countess 细胞计数板载玻片	Thermo Scientific	C10228
盖玻片	LA Colors		任何透明的指甲油均可使用
Cultrex  RGF 基底膜提取物，2型	R&D Systems	3533-010-02	可能可使用 Matrigel 或其他 BME 基质
DAPI	Thermo Scientific	R37606	NucBlue 固定细胞即用型试剂，用1× PBS稀释
甘氨酸	Fisher Scientific	NC0756056
JCountPro	JCountPro		如需获取软件，请发送电子邮件至：jcountpro@gmail.com
微量离心管	Fisher Scientific	07-000-243
指甲油	StatLab	SL102450
2% 多聚甲醛（PFA）	Electron Microscopy Sciences	157-4	将4% PFA在PBS++中稀释以获得2% PFA
通透缓冲液	实验室自制		PBS++中含0.2% Triton X-100
移液器	Rainin	17014382
移液器吸头	Rainin	17014967
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Thermo Scientific	P36930
染色缓冲液	实验室自制		PBS++中含0.5% BSA、0.15% 甘氨酸和0.1% Triton X-100
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II 腔室载玻片系统	Thermo Scientific	12-565-8
Triton X-100	Sigma-Aldrich	11332481001
0.4% 台盼蓝溶液	Thermo Scientific	15250061
TrypLE Express	Invitrogen	12604013	无动物来源，重组酶
X-RAD 320 生物辐照仪	Precision X-Ray Irradiation	X-RAD320