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方法文章

可视化患者来源卵巢癌类器官中的DNA损伤修复蛋白 通过 免疫荧光检测

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DOI：

10.3791/64881

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2023年2月24日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Washington University in St. Louis, 2University of California San Francisco

本文内容

摘要

本方案描述了在患者来源的卵巢癌类器官中评估DNA损伤修复蛋白的方法。内容包括全面的铺板和染色方法，以及详细且客观的定量分析流程。

摘要

免疫荧光是一种广泛使用的技术，可用于高灵敏度和高特异性地可视化目标抗原，从而准确鉴定和定位蛋白质、糖类及小分子。尽管该技术在二维（2D）细胞培养中已十分成熟，但其在三维（3D）细胞模型中的应用尚不明确。卵巢癌类器官是一种三维肿瘤模型，能够重现肿瘤细胞的克隆异质性、肿瘤微环境以及细胞间和细胞-基质间的相互作用，因此在评估药物敏感性和功能生物标志物方面优于传统细胞系。因此，能够在原代卵巢癌类器官上应用免疫荧光技术，对于深入理解该癌症的生物学特性具有重要意义。本研究描述了在高级别浆液性患者来源的卵巢癌类器官（PDOs）中检测DNA损伤修复蛋白的免疫荧光技术。在将PDOs暴露于电离辐射后，对完整类器官进行免疫荧光染色，以评估核内蛋白形成的焦点结构。通过共聚焦显微镜的z轴层扫成像采集图像，并利用自动焦点计数软件进行分析。所述方法可实现对DNA损伤修复蛋白在时间和空间上的招募动态分析，以及这些蛋白与细胞周期标志物的共定位研究。

引言

卵巢癌是导致妇科恶性肿瘤患者死亡的首要原因。大多数患者接受以卡铂为代表的DNA损伤类药物治疗，而同源重组修复（HRR）缺陷型肿瘤患者还可使用聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂1,2。然而，大多数患者会对这些疗法产生耐药性，并在确诊后5年内死亡。DNA损伤应答（DDR）的失调已被证实与卵巢癌的发生发展以及化疗和PARP抑制剂耐药密切相关3。因此，研究DDR对于理解卵巢癌的病理生理机制、潜在生物标志物以及开发新型靶向治疗策略至关重要。

目前评估DNA损伤应答（DDR）的方法主要采用免疫荧光（IF），因为该技术能够准确识别和定位DNA损伤相关蛋白及核苷酸类似物。当DNA发生双链断裂（DSB）时，组蛋白H2AX会迅速被磷酸化，形成DNA损伤修复蛋白聚集的焦点4。这种磷酸化可通过IF轻松检测；事实上，ɣ-H2AX检测已被广泛用于确认DSB的产生5,6,7,8,9。DNA损伤水平升高与铂类药物的敏感性及DNA损伤剂的疗效相关10,11,12，而ɣ-H2AX已被提出作为其他癌症治疗中化疗反应相关的生物标志物13。在发生DSB后，具备同源重组修复（HRR）能力的细胞会启动一系列事件，促使BRCA1和BRCA2招募RAD51，以取代复制蛋白A（RPA）并与DNA结合。HRR利用DNA模板精确修复DSB。然而，当肿瘤细胞HRR功能缺陷时，则依赖于非同源末端连接（NHEJ）等替代修复通路。NHEJ具有较高的错误倾向，会在细胞中造成较大的突变负荷，并以53BP1作为正向调控因子14。这些DNA损伤相关蛋白均可通过IF以焦点形式被准确识别。除了蛋白染色外，IF还可用于研究复制叉保护及单链DNA缺口的形成。复制叉的稳定性已被证实与铂类药物反应相关，而近期缺口检测方法显示出预测PARP抑制剂反应的潜力6,15,16,17。因此，在核苷酸类似物整合入基因组后对其进行染色，是研究DDR的另一种方法。

迄今为止，对卵巢癌中DNA损伤反应（DDR）的评估在很大程度上局限于同质性的二维细胞系，这些细胞系无法再现肿瘤的克隆异质性、微环境或组织结构 体内 肿瘤18,19近期研究表明，在研究DNA损伤应答（DDR）机制等复杂生物学过程时，类器官优于二维细胞系6. 本方法学评估类器官中RAD51、ɣ-H2AX、53BP1、RPA和geminin的表达。这些方法可检测完整类器官，并能够在更接近体内环境的条件下研究DNA损伤应答（DDR）机制 体内 肿瘤微环境。结合共聚焦显微镜和自动焦点计数技术，该方法有助于阐明卵巢癌中的DNA损伤应答通路，并为患者制定个体化治疗方案提供支持。

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方案

在获得患者知情同意后，采集肿瘤组织和腹水样本，样本来源于圣路易斯华盛顿大学机构审查委员会（IRB）批准的妇科肿瘤生物样本库。纳入患者均为晚期高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）。除非另有说明，所有操作均在室温下于实验台进行。所有试剂均在室温下配制（另有说明除外），并储存于 4 °C。

1. 类器官生成

  1. 按照先前发表的文献报道生成类器官20。

2. 类器官的铺板与辐照

  1. 在培养物中使用类器官时，通过手动操作移液枪头将类器官从培养皿上分离下来。将类器官收集至15 mL锥形管中。
  2. 在4 °C条件下，以1,650 × g离心5分钟。使用移液器小心吸除上清液。
  3. 向沉淀中加入1,000 µL无动物来源的重组酶（参见材料表）。混匀溶液，并在37 °C下孵育15分钟。
  4. 在4 °C条件下，以1,650 × g离心5分钟。使用移液器小心吸除上清液。
  5. 离心和吸除上清后，将沉淀重悬于1,000 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中。
  6. 取10 µL溶液转移至1.5 mL微量离心管中，并与10 µL台盼蓝混合。
  7. 取10 µL台盼蓝染色的细胞悬液加入细胞计数板载玻片中，然后插入细胞计数仪（参见材料表）进行计数。
  8. 将每20 µL基底膜提取物（BME）中接种40,000个细胞至8孔玻璃腔室载玻片中（参见材料表）。此条件可维持类器官生长3–5天，使细胞形成类器官并生长至合适大小。
  9. 为诱导DNA双链断裂，使用10 Gy的ɣ射线照射已接种的类器官（辐照设备详情参见材料表）。
    注意：该过程可能需要5–10分钟。
  10. 将类器官置于含培养基的湿润培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下孵育4小时。

3. 免疫荧光染色

注意：体积指每孔8孔板的用量（约300 µL）。

  1. 照射并孵育类器官后，用移液器吸去培养基，操作时需小心以免破坏3D基质。用300 µL PBS洗涤。
  2. 用300 µL的2%多聚甲醛（PFA）固定类器官10分钟。
    注意事项：固定时间不宜过长，否则基底膜提取物（BME）可能发生去聚合，导致被吸除。
  3. 用300 µL染色缓冲液（见材料表）洗涤类器官。置于摇床上振荡5分钟。
  4. 进行通透处理时，轻柔加入300 µL通透缓冲液（见材料表），孵育20分钟。随后用300 µL染色缓冲液洗涤，置于摇床上振荡5分钟。
  5. 加入300 µL染色缓冲液以封闭通透步骤。置于摇床上孵育30分钟。用移液器吸去染色缓冲液。
  6. 加入300 µL用染色缓冲液稀释的一抗溶液（兔抗RAD51、鼠抗Geminin、兔抗RPA、鼠抗ɣH2AX、兔抗Geminin、鼠抗53BP1；见材料表），4 °C孵育16小时。
    注意事项：避免使用同一宿主动物来源的抗体进行共染。孵育时保持盖子打开，防止抗体扩散至邻近孔中。
  7. 移除一抗溶液。在摇床上用300 µL染色缓冲液洗涤三次，每次5分钟。
  8. 加入300 µL用染色缓冲液稀释的二抗溶液（山羊抗鼠Alexa Fluor 488和山羊抗兔Alexa Fluor 647；见材料表），避光孵育1小时。
    注意事项：后续所有步骤均需在避光条件下进行。
  9. 吸除二抗溶液。加入300 µL稀释的DAPI溶液。置于摇床上振荡5分钟。
  10. 在摇床上用300 µL染色缓冲液洗涤三次，每次5分钟。吸去染色缓冲液，并使用腔室载玻片配套的拆卸试剂盒将腔室拆下（见材料表）。
    注意事项：拆卸时注意不要过度推进，以免破坏3D基质。
  11. 使用剪去尖端的p200移液器吸头，加入封片介质（见材料表），使每孔类器官区域被覆盖（例如，每个类器官区域加20–30 µL）。
  12. 将盖玻片覆盖在样本上，避免产生气泡。
  13. 用透明指甲油沿盖玻片边缘涂抹，密封载玻片。静置1小时使其硬化，然后置于-20 °C保存。
    ​注意事项：成像后，载玻片可在荧光信号基本不损失的情况下保存至少6个月。

4. 成像

  1. 使用共聚焦显微镜（见材料表）在63倍油镜下获取图像。
    注：若成像目标为核蛋白，63倍物镜更优，但40倍物镜也可接受。
  2. 使用DAPI通过目镜定位类器官。根据所用荧光染料选择合适的显微镜滤光片。设置采集z轴层扫图像的参数。
    注：本研究中使用的荧光染料为DAPI、488和647。开启405、488和638激光器以观察染色情况。
    注：推荐的z轴层扫范围取决于物镜的分辨能力。
  3. 调整实时图像：设置焦距、激光强度等。
    注：激光强度越高，样品发生光漂白的可能性越大。因此，应选择最佳激光强度。
  4. 采集z轴层扫图像。
    注：此过程可能需要5至10分钟。
  5. 从z轴层扫采集的图像中，每个层扫至少截取三张图像。
    注：应确保在整个层扫范围内获取截图，以避免在定量分析时重复计数细胞核。
  6. 将每个文件保存为TIFF格式，并进入下一步分析（步骤5）。

5. 分析

注意：所有图像分析均使用 JCountPro 软件，操作步骤参照先前发表的报告21。如需获取该软件，请参考相关出版物。

  1. 在程序顶部的“对象分析”面板中，于程序底部的“文件选择”选项卡内，选择 TIFF 文件。
  2. 点击 添加 将所选文件移至已选文件组，然后选择 显示。
  3. 在“分割”选项卡下，选择 蓝色 作为细胞核的颜色。选择 自动分割 以优化细胞核的阈值。
    注意：如果自动分割未能准确识别对象，用户可调整精细调节和原始调节参数，或参考用户手册进一步优化分割效果。
  4. 在“对象”面板中，选择 自动分割大对象 并优化细胞核的大小。
    注意：细胞核的无条件大小通常为 5,000 像素，条件大小为 1,500 像素。请参阅用户手册以进一步优化对象大小。
  5. 选择 识别对象 以测试参数。
    注意：如果这些参数不准确，可调整大小和调谐参数以及其他设置。请参阅用户手册了解进一步优化的说明。
  6. 在根据图像调整好参数后，选择 在所有图像中识别对象，以在所有选定图像中识别细胞核。
  7. 选择程序顶部的 焦点分析 面板。
  8. 在程序底部的“选择文件”选项卡中，选择用于对象分析的 TIFF 文件，并点击 箭头按钮（>>）将图像移至图像文件组。
  9. 在已移动图像文件下方的目录组中，双击 手动编辑 文件夹，并将 ioc 文件移至对象集合文件组。
    注意：所有选定的 TIFF 文件必须有对应的 ioc 文件。
  10. 点击 选择 将文件移至已选文件组，然后选择程序底部的 焦点计数 选项卡。
  11. 按照以下步骤优化参数：
    1. Top hat 设置索引：12。
    2. 焦点通道：选择焦点的颜色（绿色：ɣ-H2AX；红色：RAD51）。
    3. H dome 设置：穹顶高度 %：30；阈值 %：28 和 28。
    4. 形状/大小设置：最小焦点大小，像素：5。选择 应用形状/大小。最大焦点大小（条件）：32。最小圆度，×100：96。最大焦点，像素：60。
    5. 噪声滤波器：大小 1。
      注意：若需判断细胞核是否为 geminin 染色阳性，请在第二通道下选择绿色，在分析下选择强度。
  12. 为测试所设参数，请依次选择以下按钮：Top Hat > H-Dome > 焦点计数。
    注意：如果这些参数无效，可调整大小和调谐参数以及其他设置。请参阅用户手册了解如何进一步优化图像。
  13. 当所选图像的参数已优化后，选择 自动计数 以对每张图像中每个细胞核的焦点进行计数。如需使用第二通道，程序将测定可用于分析的强度值。

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结果

本方案可成功对类器官中的细胞核DNA损伤修复蛋白进行染色、成像和定量。该技术被用于在照射前后对患者来源的类器官（PDO）进行染色和评估。PDO接受10 Gy辐射处理，并检测以下生物标志物：ɣ-H2AX（图1），DNA损伤标志物；RAD51（图2），同源重组修复（HRR）标志物；53BP1，非同源末端连接（NHEJ）标志物；RPA，复制应激标志物（图3）；以及geminin，G2/S期细胞周期标志物14。选择10 Gy剂量是基于先前研究卵巢癌中DNA损伤的已发表文献6,22。采用JCountPro软件识别细胞核，并根据图示参数对细胞核内焦点数量进行定量分析13（图4）。该软件首先识别细胞核（<...

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讨论

DNA损伤应答在卵巢癌的发生发展以及化疗耐药性中均发挥着关键作用。因此，深入理解DNA修复机制至关重要。本文介绍了一种用于在三维完整类器官中研究DNA损伤修复蛋白的方法。该方法建立了一套可重复且可靠的实验流程，利用标志性抗体来评估DNA损伤、同源重组、非同源末端连接以及复制应激。重要的是，本研究通过基因修饰的对照样本验证了这些方法的特异性和灵敏度。

本方案中最关键的步骤是类器官的铺板和固定。该方案特别要求在固定过程中，将类器官在2%多聚甲醛（PFA）中孵育10分钟，并在固定期间密切监测基底膜提取物（BME）的状态。这与其它类器官免疫荧光染色方案不同，后者通常建议使用4% PFA固定10至60分钟23,24,25。研究发现，如果BME的胶状结构长时间暴露于高浓度PFA中，其结构会解聚，并在后续操作中容易被吸除。值得注意的是，特定BME产品的制造商通常会提供有关固定的建议。另一个需要讨论的重要问题是类...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Pavel Lobachevsky 博士在建立本方案过程中提供的指导。同时，我们谨向圣路易斯华盛顿大学医学院妇产科及妇科肿瘤学部、华盛顿大学院长学者项目、妇科肿瘤学组基金会以及生殖科学家培养项目致以谢意，感谢他们对本项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含钙镁的1×磷酸盐缓冲液（PBS++）Sigma14-040-133
不含钙镁的1×磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher Scientific ICN1860454
Ant-53BP1 抗体 BD Biosciences612522用染色缓冲液按1:500稀释
Ant-Geminin 抗体 Abcamab104306用染色缓冲液按1:200稀释
Anti-Geminin 抗体 ProteinTech10802-1-AP用染色缓冲液按1:400稀释
Anti-RAD51 抗体 Abcamab133534用染色缓冲液按1:1000稀释
Anti-γH2AX 抗体 Millipore-Sigma05-636用染色缓冲液按1:500稀释
Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) 抗体Bethyl Laboratories A300-245A-M用染色缓冲液按1:200稀释
牛血清白蛋白（BSA）Fisher Scientific BP1605 100
离心机；Sorvall St 16R 离心机Thermo Scientific 75004240
共聚焦显微镜，Leica SP5 共聚焦系统 DMI4000Leica 389584
15 mL 圆锥形离心管Corning 14-959-53A
Countess 3 FL 全自动细胞计数仪（细胞计数仪） Thermo Scientific AMQAF2000
Countess 细胞计数板载玻片Thermo Scientific C10228
盖玻片LA Colors任何透明的指甲油均可使用
Cultrex  RGF 基底膜提取物，2型 R&D Systems 3533-010-02可能可使用 Matrigel 或其他 BME 基质 
DAPI Thermo Scientific  R37606NucBlue 固定细胞即用型试剂，用1× PBS稀释 
甘氨酸 Fisher Scientific NC0756056
JCountProJCountPro如需获取软件，请发送电子邮件至：jcountpro@gmail.com 
微量离心管 Fisher Scientific 07-000-243
指甲油 StatLabSL102450
2% 多聚甲醛（PFA） Electron Microscopy Sciences 157-4将4% PFA在PBS++中稀释以获得2% PFA
通透缓冲液实验室自制PBS++中含0.2% Triton X-100 
移液器Rainin17014382
移液器吸头 Rainin 17014967
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Thermo Scientific  P36930
染色缓冲液 实验室自制PBS++中含0.5% BSA、0.15% 甘氨酸和0.1% Triton X-100 
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II 腔室载玻片系统 Thermo Scientific 12-565-8
Triton X-100Sigma-Aldrich 11332481001
0.4% 台盼蓝溶液Thermo Scientific 15250061
TrypLE ExpressInvitrogen12604013无动物来源，重组酶
X-RAD 320 生物辐照仪 Precision X-Ray Irradiation X-RAD320

参考文献

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