肺源性样本中微血管和大血管内皮细胞的分离与纯化

摘要

尽管具有挑战性，肺内皮细胞的分离对于肺部炎症研究至关重要。本方案描述了一种高得率、高纯度分离大血管和微血管内皮细胞的操作步骤。

摘要

从健康和病变组织及器官中分离获得细胞，是实现个体化医学策略的关键要素。尽管生物样本库能够为生物医学研究提供大量原代细胞和永生化细胞，但仍无法满足所有实验需求，尤其是与特定疾病或基因型相关的研究需求。血管内皮细胞（ECs）是免疫炎症反应的关键组分，因此在多种疾病的发病机制中发挥着核心作用。值得注意的是，来自不同部位的内皮细胞具有不同的生化特性和功能特性，因此获取特定类型的内皮细胞（如大血管、微血管、动脉和静脉内皮细胞）对于设计可靠的实验至关重要。本文详细阐述了从肺动脉和肺实质中高效获取近乎纯化的人源大血管和微血管内皮细胞的简便方法。该技术可由任何实验室以相对较低的成本轻松重复，从而摆脱对商业来源的依赖，并获得目前尚未可及的内皮细胞表型或基因型。

引言

血管内皮衬于血管内表面，在调节血液凝固、血管张力以及免疫-炎症反应中发挥关键作用^1,2,3,4尽管培养自人体标本分离的内皮细胞（ECs）对科研至关重要，但需指出的是，不同血管（动脉、静脉、毛细血管）来源的内皮细胞具有特定功能。这些功能无法完全由人脐静脉内皮细胞（HUVEC）再现，尽管后者来源便利，且在血管内皮病理生理学研究中被广泛使用。^5,6例如，人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）通过调控白细胞的招募与积聚，在肺部炎症中发挥关键作用^4,7因此，旨在高度真实地模拟肺部炎症的实验体系应包含人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）。另一方面，内皮细胞（EC）功能障碍可见于多种病理状态；因此，来自患者的内皮细胞对于构建可靠的模型至关重要 体外 疾病模型。例如，从囊性纤维化（CF）患者移植出的肺组织中分离出肺动脉内皮细胞（HPAECs）片段，使我们能够揭示该疾病中内皮功能障碍的机制^8,9.

因此，旨在优化从不同来源/器官以及疾病状态下分离内皮细胞（ECs）的实验方案至关重要，可为研究人员提供宝贵的研究工具，尤其是当这些工具无法通过商业途径获得时。人肺微血管内皮细胞（HLMVEC）和人肺动脉内皮细胞（HPAEC）的分离方案此前已有报道^{10,11,12,13,14,15,16,17,18,19}在所有情况下，肺组织样本的酶消化均得到混合细胞群体，随后通过以下方法进行纯化： 特设的 选择性培养基以及基于磁珠或流式细胞术的细胞分选。这些方案的进一步优化必须解决内皮细胞分离中的两个主要问题：（1）细胞和组织污染，应在尽可能早的培养代次中予以解决，以最大限度减少内皮细胞的复制性衰老²⁰；以及（2）原代EC分离物的低产量。

本研究描述了一种高产量、高纯度分离人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）和人肺动脉内皮细胞（HPAECs）的新方案。该方法步骤简便，仅需几步即可获得近乎纯化的微血管和大血管内皮细胞。

方案

本研究已获得批准，并遵循基耶蒂-佩斯卡拉大学人类研究伦理委员会的指南（#237_2018bis）。图1展示了从因气胸或肺叶切除等不同原因接受胸外科手术的匿名人类受试者（已获得书面知情同意）的肺实质或肺动脉片段（长1-3 cm）中分离内皮细胞的过程。在后一种情况下，外科医生还采集了一段肺动脉组织。值得注意的是，外科医生被明确要求采集无癌组织样本。本方案经过优化，以获得尽可能高的细胞得率和纯度。

1. 实验准备

1. 胶原酶重悬
   1. 将胶原酶粉末溶于不含 CaCl₂ 和 MgCl₂ 的磷酸盐缓冲液（PBS⁻⁻，参见材料表）中，配制成 2 mg/mL 的浓度，并使用 0.22 µm 孔径滤器过滤溶液。
   2. 分装成每份 5 mL，于 −20 °C 保存。使用前将其解冻并预热至 37 °C。
2. 培养板包被
   1. 进行培养板包被时，将 1.5% 明胶溶液或 50 µg/mL 纤连蛋白（参见材料表）加入培养板中（500 µL 足以覆盖 6 孔板每个孔的表面），在 37 °C 下孵育 1 小时。
   2. 孵育后，吸除多余的明胶，并用 PBS⁻⁻ 洗涤各孔。吸去 PBS⁻⁻，并在无菌操作台中让培养板自然干燥。
      注意：明胶重悬时，将粉末溶于水中配制成 1.5% 溶液，随后进行高压灭菌，并于 4 °C 保存。1.5% 明胶在 4 °C 下不呈液态，因此在包被前必须加热使其融化。或者，也可使用任何适用于细胞培养的市售明胶溶液进行包被。

2. 样品制备

1. 肺实质
   1. 将收集的样品浸入含有 PBS⁻⁻ 的 50 mL 离心管中进行洗涤。
   2. 将样品转移至无菌培养皿中，使用手术剪手动剪碎（最佳尺寸：>2 cm），切成每块约 3–4 mm 的小片段。
2. 动脉节段
   1. 将收集的样品浸入含有 PBS⁻⁻ 的 50 mL 离心管中进行洗涤。
   2. 将其转移至无菌培养皿中，不要剪碎，因为碎片化会增加动脉节段横截面的表面积，从而增加分离出非内皮细胞（非-ECs）的可能性。

3. 酶消化

1. 用 PBS⁻⁻ 将切碎的肺实质或肺动脉段清洗两次。此步骤可去除大部分残留血液。
2. 将样品置于 15 mL 离心管中，加入 5 mL Ⅱ型胶原酶（见材料表），在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 10 分钟。在此孵育过程中，细胞外基质的降解会释放出单个细胞和细胞团块。

4. 消化细胞的回收

1. 将一个无菌的钢制/金属滤网（例如网孔尺寸约为 1 mm 的茶滤器）放置在 50 mL 收集管的管口上方。
2. 将 15 mL 离心管中的全部内容物倒入滤网中，用刮勺轻轻揉搓消化后的组织，并用 PBS⁻⁻ 冲洗样品，直至收集管被充满。
   ​注意：此步骤可去除毫米级的大块组织碎片，从而提高后续过滤步骤的效率。

5. 通过过滤去除非内皮细胞

1. 使用孔径为 70 µm 的细胞筛过滤在步骤 4.2 中收集的流出液，并将滤液收集到一个新的 50 mL 离心管中。
2. 接着，使用孔径为 40 µm 的细胞筛过滤，将滤液收集到另一个新的 50 mL 离心管中。将此管标记为 "tube 1"。
   ​注意：步骤 5.1 和步骤 5.2 中的这些过滤步骤将去除较大的细胞聚集体，这些聚集体通常由多种细胞群体混合组成。

6. 细胞簇的沉降与细胞接种

1. 在室温下以 30 x g 离心样品 5 分钟，使细胞团沉淀。
2. 使用无菌移液管小心吸除上清液（不要倾倒），并将上清液转移至新的 50 mL 离心管（"tube 2"）中。
3. 将沉淀重悬于 "tube 1" 中，并用 PBS⁻⁻ 补充至 50 mL；同时用 PBS⁻⁻ 将 "tube 2" 补充至 50 mL。
   注意：从本步骤开始，两根离心管需进行相同处理。
4. 在室温下以 300 x g 离心样品 5 分钟。
5. 用 2 mL 培养基（见材料表）重悬沉淀，并将细胞悬液接种至预先包被的 6 孔板的两个独立孔中（步骤 1.2）。
   ​注意：从本步骤开始，每隔 2 天用培养基换液一次，直至细胞达到汇合状态（约 1 周，具体时间取决于样品大小），以获得足够数量的细胞用于分选。

7. 细胞扩增

1. 用 2 mL 含 CaCl₂ 和 MgCl₂ 的 PBS（PBS⁺⁺，参见材料表）洗涤细胞，以去除残留的血细胞（使用 PBS⁺⁺ 对避免细胞脱落至关重要）。
2. 移除 PBS⁺⁺，加入新鲜培养基。
3. 重复步骤 7.1 和步骤 7.2，直至细胞达到汇合状态（约 1 周，具体时间取决于样本大小）。

8. 细胞分选

1. 使用 500 µL 胰蛋白酶-EDTA（0.05%，参见材料表）消化细胞，离心后用 190 µL PBS⁻⁻ 重悬细胞沉淀。
2. 加入 10 µL 荧光标记的抗人 CD31-FITC 抗体（1:20 稀释，参见材料表），将细胞悬液在 4 °C 下孵育 30 分钟。
3. 用 10 mL PBS⁻⁻ 洗涤细胞，在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，然后将细胞沉淀重悬于 300 µL PBS⁻⁻ 中。
4. 使用 100 μm 喷嘴通过荧光激活细胞分选（FACS）分离并收集 CD31 阳性（CD31+）细胞，并将其收集至离心管中。
   1. 根据设门策略，首先利用侧向散射面积参数 SSC-A 和 FSC-A 确定细胞形态；然后通过 FSC-面积/FSC-高度或 SSC-面积/SSC-高度散点图筛选单细胞；通过与未染色对照样本比较，确定标记样本中的阳性细胞，并将荧光阳性细胞分选至收集管中²¹。
5. 将细胞悬液在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，将沉淀重悬于 2 mL 生长培养基中，接种至预先包被的 6 孔板孔中。

9. 分选后扩增

1. 细胞分选后两天，将条件培养基更换为新鲜的生长培养基。
2. 每两天重复一次步骤 7.1 和步骤 7.2，以进行细胞扩增。

结果

HLMEC 的分离
在分离 HLMVEC 的过程中，主要问题是存在污染细胞，因为显微镜下的毛细血管难以与间质组织有效分离。因此，在分离过程的早期阶段实现尽可能高的纯度至关重要，以减少细胞传代次数，从而降低细胞衰老。同样，一个理想的分离方案应能获得尽可能高的纯 HLMVEC 产量。为实现这些目标，本研究在先前报道的方案^{10,11,12,14,15}基础上建立了一种新方法。

尽管肺实质血管丰富，是获取人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）的理想来源，但其主要由平滑肌细胞（SMCs）、胶原纤维和成纤维细胞构成。这些细胞，尤其是平滑肌细胞（SMCs），能够适应多种培养基，并且在几乎所有情况下均可增殖。 体外 比其...

讨论

血管内皮细胞在人类病理生理学中发挥的多种作用使其成为不可或缺的研究工具 体外 致病机制与药理学研究。由于来自不同血管部位或器官的内皮细胞（ECs）具有独特的特征和功能，因此获取目标器官的健康与病变内皮细胞是理想的研究材料。例如，人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）对于肺部炎症研究至关重要；因此，建立一种高产量、高纯度分离这些细胞的方法将有益于多个研究领域。

分离人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）的方法已有多个研究团队报道^{10,11,12,14,15,17,18,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA 1X	GIBCO	25300-054	用于将细胞从培养板上解离
抗CD31抗体，克隆株WM59	Dako	M0823	用于免疫细胞化学中的CD-31染色。使用稀释比例：1:50
抗vWF抗体	赛默飞世尔科技	MA5-14029	用于免疫细胞化学中的血管性血友病因子染色。工作浓度：1:100
可高压灭菌手术剪	任何		用于切割样本
细胞滤网 40 µm	康宁	431750	用于第二次过滤过程中
细胞滤网 70 µm	康宁	431751	首次过滤时使用
胶原酶，2型	沃辛顿	LS004177	用于酶消化的 II 型胶原酶。工作浓度：2 mg/mL
偶联的抗 CD31 抗体	BD 生物科学	555445	用于细胞分选（1:20 稀释）
杜尔贝科′磷酸盐缓冲液（PBS）  CaCl2 和 MgCl2	Sigma-Aldrich	D8662	用于换液前的细胞清洗
杜尔贝科′不含 CaCl 的磷酸盐缓冲液（PBS）2 和 MgCl2	Sigma-Aldrich	D8537	用于胰蛋白酶消化前清洗手术标本和细胞
内皮细胞生长培养基 MV	PromoCell	C-22020	人肺微血管内皮细胞生长培养基
纤连蛋白	Sigma-Aldrich	F0895	人血浆来源的纤连蛋白用于板包被。工作浓度：50 µg/mL
猪皮明胶，A型	Sigma-Aldrich	G2500	用于包被板
A型明胶	Sigma-Aldrich	g-2500	用于包被培养板的猪皮明胶。工作浓度：1.5%