尽管具有挑战性，肺内皮细胞的分离对于肺部炎症研究至关重要。本方案描述了一种高得率、高纯度分离大血管和微血管内皮细胞的操作步骤。
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本文内容
摘要
摘要
从健康和病变组织及器官中分离获得细胞，是实现个体化医学策略的关键要素。尽管生物样本库能够为生物医学研究提供大量原代细胞和永生化细胞，但仍无法满足所有实验需求，尤其是与特定疾病或基因型相关的研究需求。血管内皮细胞（ECs）是免疫炎症反应的关键组分，因此在多种疾病的发病机制中发挥着核心作用。值得注意的是，来自不同部位的内皮细胞具有不同的生化特性和功能特性，因此获取特定类型的内皮细胞（如大血管、微血管、动脉和静脉内皮细胞）对于设计可靠的实验至关重要。本文详细阐述了从肺动脉和肺实质中高效获取近乎纯化的人源大血管和微血管内皮细胞的简便方法。该技术可由任何实验室以相对较低的成本轻松重复，从而摆脱对商业来源的依赖，并获得目前尚未可及的内皮细胞表型或基因型。
引言
血管内皮衬于血管内表面，在调节血液凝固、血管张力以及免疫-炎症反应中发挥关键作用1,2,3,4尽管培养自人体标本分离的内皮细胞（ECs）对科研至关重要，但需指出的是，不同血管（动脉、静脉、毛细血管）来源的内皮细胞具有特定功能。这些功能无法完全由人脐静脉内皮细胞（HUVEC）再现，尽管后者来源便利，且在血管内皮病理生理学研究中被广泛使用。5,6例如，人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）通过调控白细胞的招募与积聚，在肺部炎症中发挥关键作用4,7因此，旨在高度真实地模拟肺部炎症的实验体系应包含人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）。另一方面，内皮细胞（EC）功能障碍可见于多种病理状态；因此，来自患者的内皮细胞对于构建可靠的模型至关重要 体外 疾病模型。例如，从囊性纤维化（CF）患者移植出的肺组织中分离出肺动脉内皮细胞（HPAECs）片段，使我们能够揭示该疾病中内皮功能障碍的机制8....
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方案
本研究已获得批准，并遵循基耶蒂-佩斯卡拉大学人类研究伦理委员会的指南（#237_2018bis）。图1展示了从因气胸或肺叶切除等不同原因接受胸外科手术的匿名人类受试者（已获得书面知情同意）的肺实质或肺动脉片段（长1-3 cm）中分离内皮细胞的过程。在后一种情况下，外科医生还采集了一段肺动脉组织。值得注意的是，外科医生被明确要求采集无癌组织样本。本方案经过优化，以获得尽可能高的细胞得率和纯度。
1. 实验准备
- 胶原酶重悬
- 将胶原酶粉末溶于不含 CaCl2 和 MgCl2 的磷酸盐缓冲液（PBS−−，参见材料表）中，配制成 2 mg/mL 的浓度，并使用 0.22 µm 孔径滤器过滤溶液。
- 分装成每份 5 mL，于 −20 °C 保存。使用前将其解冻并预热至 37 °C。
- 培养板包被
- 进行培养板包被时，将 1.5% 明胶溶液或 50 µg/mL 纤连蛋白（参见材料表）加入培养板中（500 µL 足以覆盖 6 孔板每个孔的表面），在 37 °C 下孵育 1 小时。
- 孵育后，吸除多余的明胶，并用 P....
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结果
HLMEC 的分离
在分离 HLMVEC 的过程中，主要问题是存在污染细胞，因为显微镜下的毛细血管难以与间质组织有效分离。因此，在分离过程的早期阶段实现尽可能高的纯度至关重要，以减少细胞传代次数，从而降低细胞衰老。同样，一个优化的分离方案应能获得尽可能高产量的纯 HLMVEC。为实现这些目标，本研究在先前报道的方案10,11,12,14,15基础上建立了一种新方法。
尽管肺实质血管丰富，是获取人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）的理想来源，但其主要由平滑肌细胞（SMCs）、胶原纤维和成纤维细胞构成。这些细胞，尤其是平滑肌细胞（SMCs），能够适应多种培养基，并且在几乎所有情况下均可快速增殖。 体外 比.......
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讨论
血管内皮细胞在人类病理生理学中发挥的多种作用使其成为不可或缺的研究工具 体外 致病机制与药理学研究。由于来自不同血管部位或器官的内皮细胞（ECs）具有独特的特征和功能，因此获取目标器官的健康与病变内皮细胞是理想的研究材料。例如，人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）对于肺部炎症研究至关重要；因此，建立一种高产量、高纯度分离这些细胞的方法将有益于多个研究领域。
分离人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）的方法已有多个研究团队报道10,11,12,14,15,17,18,
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披露
作者声明，本研究的开展不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系。
致谢
本工作获得了意大利大学与研究部（ex 60% 2021 和 2022）向 R. P. 提供的资金支持，以及意大利囊性纤维化基金会的资助。FFC#23/2014）以及意大利卫生部（L548/93）至 M. R.
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | 用于将细胞从培养板上解离 |
| 抗CD31抗体，克隆株WM59 | Dako | M0823 | 用于免疫细胞化学中的CD-31染色。使用稀释比例：1:50 |
| 抗vWF抗体 | 赛默飞世尔科技 | MA5-14029 | 用于免疫细胞化学中的血管性血友病因子染色。工作浓度：1:100 |
| 可高压灭菌手术剪 | 任何 | 用于切割样本 | |
| 细胞滤网 40 µm | 康宁 | 431750 | 用于第二次过滤过程中 |
| 细胞滤网 70 µm | 康宁 | 431751 | 首次过滤时使用 |
| 胶原酶，2型 | 沃辛顿 | LS004177 | 用于酶消化的 II 型胶原酶。工作浓度：2 mg/mL |
| 偶联的抗 CD31 抗体 | BD 生物科学 | 555445 | 用于细胞分选（1:20 稀释） |
| 杜尔贝科′磷酸盐缓冲液（PBS） CaCl2 和 MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | 用于换液前的细胞清洗 |
| 杜尔贝科′不含 CaCl 的磷酸盐缓冲液（PBS）2 和 MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | 用于胰蛋白酶消化前清洗手术标本和细胞 |
| 内皮细胞生长培养基 MV | PromoCell | C-22020 | 人肺微血管内皮细胞生长培养基 |
| 纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F0895 | 人血浆来源的纤连蛋白用于板包被。工作浓度：50 µg/mL |
| 猪皮明胶，A型 | Sigma-Aldrich | G2500 | 用于包被板 |
| A型明胶 | Sigma-Aldrich | g-2500 | 用于包被培养板的猪皮明胶。工作浓度：1.5% |
参考文献
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial ....
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重印与许可
