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开源实时闭环电阈值追踪技术在转化疼痛研究中的应用

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DOI：

10.3791/64898

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2023年4月21日

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1Anaesthesia, Pain, and Critical Care Sciences, School of Physiology, Pharmacology, & Neuroscience, University of Bristol, 2Eli Lilly and Company, 3Department of Computer Science, University of Bristol, 4Department of Aerospace Engineering, University of Bristol, 5Research Computing, University of Bristol

本文内容

摘要

APTrack 是为 Open Ephys 平台开发的一款软件插件，可实现神经元动作电位的实时数据可视化以及闭环电阈值追踪。我们已成功将其应用于人体C纤维伤害性感受器以及小鼠C纤维和Aδ纤维伤害性感受器的微神经图记录。

摘要

伤害性感受器是一类初级传入神经元，可传递潜在有害的伤害性刺激信号。在急性和慢性疼痛状态下，伤害性感受器的兴奋性会升高，从而导致异常的持续性放电活动或对伤害性刺激的激活阈值降低。明确这种兴奋性增加的原因，对于开发和验证基于机制的治疗方法至关重要。单神经元电阈值追踪技术可用于量化伤害性感受器的兴奋性。因此，我们开发了一款应用程序以实现此类测量，并展示了其在人类和啮齿类动物中的应用。APTrack 通过时间序列点阵图（temporal raster plot）提供实时数据可视化和动作电位识别功能。算法通过阈值跨越检测动作电位，并监测其在电刺激后的潜伏期。插件随后采用上下法（up-down method）调节电刺激强度，以估算伤害性感受器的电阈值。该软件基于 Open Ephys 系统（V0.54）构建，使用 JUCE 框架以 C++ 编写，可在 Windows、Linux 和 Mac 操作系统上运行。开源代码可公开获取（https://github.com/Microneurography/APTrack）。电生理记录来自小鼠隐神经皮肤-神经标本（采用单纤维分离法）以及健康人类志愿者的腓浅神经微神经图记录。伤害性感受器根据其对热和机械刺激的反应，以及通过监测传导速度的活动依赖性减慢进行分类。该软件通过时间序列点阵图简化了动作电位的识别，从而为实验提供了便利。我们首次展示了在活体（ in vivo ）人微神经图记录中对单神经元动作电位进行实时闭环电阈值追踪的结果，同时也展示了在离体（ ex vivo ）小鼠C纤维和Aδ纤维电生理记录中的应用。我们通过实验证明，加热感受野可降低人热敏性C纤维伤害性感受器的电阈值，从而验证了该方法的可行性。该插件实现了对单神经元动作电位的电阈值追踪，可用于量化伤害性感受器兴奋性的变化。

引言

伤害性感受器是外周神经系统中的初级传入神经元，可被明显的或潜在的组织损伤事件激活，并在急性疼痛中发挥关键的保护作用1。在动物模型、健康人类志愿者以及患者中对C纤维和Aδ纤维伤害性感受器进行的电生理记录表明，在多种疼痛状况下均存在致敏现象和异常的自发放电活动2,3,4,5,6,7。了解患者伤害性感受器兴奋性改变背后的机制，有助于实现靶向治疗干预8。然而，目前可用于直接评估伤害性感受器兴奋性的工具较少，尤其是在患者中9，但此类工具的应用潜力已得到广泛认可10,11。

全神经电阈值追踪可用于检测人类轴突的兴奋性12。然而，由于粗大、有髓鞘的外周神经元对感觉复合动作电位的幅度贡献较大，全神经电阈值追踪无法评估C纤维的功能11,13。事实上，在一项既往研究中，针对糖尿病神经病变和化疗诱导的多发性神经病变等慢性神经病理性疼痛人群进行的全神经电阈值追踪显示，其轴突兴奋性并无差异11。

在之前的一项研究中，采用单神经元水平的电阈值追踪技术，通过单纤维分离记录来检测C纤维伤害性感受器的兴奋性 离体 大鼠皮肤-神经标本制备14作者证明，钾离子浓度升高、酸性环境以及缓激肽均可增加C纤维伤害性感受器的兴奋性，表现为动作电位产生的电阈值降低。此外，加热热敏感性伤害性感受器的感受野可降低其电阈值，而热不敏感性伤害性感受器的电阈值则升高。14这为单个神经元电阈值追踪的可行性及其应用价值提供了重要证据，但目前尚无可用的软件和/或硬件解决方案来支持此类研究，尤其是针对人类的研究。

在人体中，微神经记录术是目前唯一可用于直接评估C纤维电生理特性的方法15。该技术已被用于证明慢性疼痛患者中伤害感受器的功能障碍2,3,4,5,6,7。微神经记录术能够检测单个神经元的动作电位；然而，由于信噪比较低，研究人员通常采用标记技术来表征C纤维的活动16。在标记技术中，对皮肤中的C纤维感受野施加超阈值电刺激。该电刺激会引发一个具有恒定潜伏期的动作电位，该潜伏期由C纤维的传导速度决定。C纤维表现出活动依赖性传导减慢现象，即在动作电位发放期间，其传导速度降低，因而传导潜伏期延长17。在基础状态下，C纤维通常不会在无伤害性刺激的情况下产生动作电位，因此其对低频电刺激的反应潜伏期保持恒定。机械、热或药理学刺激若引发动作电位发放，会导致活动依赖性传导减慢，从而增加伴随的低频电刺激所诱发动作电位的潜伏期。这一特性使得在低信噪比背景下仍能客观识别非电刺激所引发的反应。因此，活动依赖性传导减慢可用于功能性地表征C纤维16。事实上，不同功能类型的C纤维在采用不同刺激频率的电刺激范式下，表现出独特的活动依赖性传导减慢模式18,19。C纤维动作电位潜伏期的这种变异性，为旨在监测这些信号的算法带来了挑战。

伤害性感受器的持续活动会导致其在低频电刺激下的潜伏期变异性增加，这再次归因于活动依赖性传导减慢。这种增大的变异性，即抖动（jitter），是可量化的兴奋性替代指标2。动作电位潜伏期变异性的其他原因还包括翻转-翻转现象（flip-flop），即单个神经元的不同终末分支交替受到刺激，导致诱发出的动作电位出现两个（或更多）互斥的基础潜伏期20。最后，外周神经元终末分支温度的变化也会以热力学方式引起动作电位潜伏期的改变，升温可提高传导速度，而降温则减慢传导速度19。因此，任何旨在实现伤害性C纤维电阈值闭环追踪的软件，都必须能够容许电刺激诱发的动作电位潜伏期发生变化。

为实现跨物种C纤维伤害性感受器电阈值追踪的目标，我们开发了APTrack，这是一个用于Open Ephys平台的开源软件插件。21，以实现实时闭环的电阈值追踪和潜伏期追踪。我们提供了概念验证数据，证明在人体微神经造影术中对C纤维伤害性感受器进行电阈值追踪是可行的。此外，我们还展示了该工具可在啮齿类动物中应用 离体 分离纤维电生理技术，从而促进人类与啮齿类动物之间的转化研究。本文将详细描述研究人员如何实施并利用该技术，以辅助其对伤害感受器功能与兴奋性的研究。

方案

人体微神经造影实验已获得布里斯托大学生命科学学院研究伦理委员会的批准（参考编号：51882）。所有研究参与者均签署了书面知情同意书。动物实验在布里斯托大学进行，经布里斯托大学动物福利与伦理审查委员会批准后，依照英国《1986年动物（科学程序）法案》执行，并由项目许可证涵盖。

1. 安装 Open Ephys GUI 和 APTrack

  1. 查阅软件文档，查找支持的最新版 Open Ephys 图形用户界面（GUI）(https://github.com/Microneurography/APTrack#readme)，然后下载并安装该 GUI。
  2. 从以下网址安装兼容版本的 GUI： https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases。
  3. 从 GitHub 下载最新版本： https://github.com/Microneurography/APTrack/releases。对于 Windows 计算机，将 .dll 文件复制到插件文件夹中，该文件夹通常位于 C:\Program Files\Open Ephys\plugins。对于 MacOS 计算机，将 .bundle 文件复制到程序包的 Contents/PlugIns 文件夹中。

2. 记录与刺激装置的组装

  1. 使用制造商提供的电缆将采集板连接到计算机，并接通电源。
    注意：在进行人体微神经造影时，使用了USB 3.0隔离器，以实现受试者与计算机之间的电气隔离，并且数据采集板由便携式电池供电，而啮齿类动物研究中则使用市电电源供电。在人体研究期间，所有USB连接（步进电机控制板除外）均通过USB隔离器连接。
  2. 将I/O板连接到采集板的模拟输入端口。使用串行外设接口（SPI）电缆将Intan RHD记录头级连接到采集板。
    注意：此处使用了Intan 16通道双极性头戴式放大器，但也可使用其他单极性RHD2000系列头戴式放大器。
  3. 将 PulsePal 连接到计算机22使用PulsePal与模拟电压控制刺激器（例如DS4）组装时，参照小鼠单纤维记录的方法，执行步骤2.5.1-2.5.3；使用基于旋转编码器的刺激器（例如DS7）并配合步进电机组装时，参照人类微神经图记录的方法，执行步骤2.6.1-2.6.8图1).
  4. 按照下文所述，在图形用户界面中构建信号链。
    1. 通过左键单击并拖动，将 Rhythm FPGA 插件插入信号链中，以连接图形用户界面与采集板。确保已单击 ADC 按钮，以启动从 I/O 板读取 ADC 通道数据。当 ADC 按钮亮起橙色时，表示已开启。
      注意：如果需要回放先前记录的实验数据，可在开始时使用文件读取器（File Reader）插件替代 Rhythm FPGA。将此功能与 APTrack 结合使用，可实现对先前实验中动作电位的可视化及潜伏期追踪。
    2. 在信号通路中插入一个带通滤波器，其默认设置为300-6,000 Hz，适用于人和小鼠的记录。此外，在其后插入一个分路器。
    3. 在分路器的一侧信号链中插入 APTrack 插件，另一侧插入 LFP Viewer。LFP Viewer 提供类似传统示波器的电压轨迹视图，便于实验过程中观察。
    4. 在插件后插入一个记录节点。在下拉菜单中，将数据保存格式从二进制更改为Open Ephys。这完成了一个简单且运行良好的信号链图2）；然而，可根据实验需求添加其他组分。
      注意：如果在信号链中将记录节点置于插件之前，则不会保存动作电位追踪信息。
    5. 在图形用户界面的右上角，单击播放按钮以开始从采集板传输数据并进行可视化。要开始记录，单击播放按钮旁边的圆形录制按钮。
      注意：容易忘记点击开始记录；为避免此情况发生，我们从开始采集数据时即进行记录。
  5. 使用模拟电压控制刺激器进行组装时，请按照以下步骤操作。
    1. 打开一个通过模拟电压输入控制刺激幅度的恒流刺激器电源。本实验中使用了DS4。图1).
    2. PulsePal 输出通道 1 用于模拟电压指令。使用 BNC T 型分路器将该信号分路，然后分别连接至恒流刺激器输入端和 I/O 板，以记录指令电压。
    3. PulsePal 输出通道 2 用于电刺激 TTL 事件标记。将其连接至 I/O 板，以便记录刺激 TTL 事件标记，供插件使用及事后分析。
  6. 使用模拟电压控制刺激器进行组装时，请遵循以下步骤。
    1. 打开一个通过旋钮编码器调节刺激强度的恒流刺激器电源。本实验中使用的是DS7型刺激器（图1).
    2. 使用制造商提供的电缆和磁性支架将步进电机控制板连接到步进电机。
    3. 使用标准的 USB A 转 USB micro-B 数据线将控制板直接连接至计算机。请勿将控制板连接至USB隔离器的受试者侧，因为该侧还连接有12 V市电电源。
    4. 如果是首次使用控制板，请将 GitHub 上的步进电机脚本上传至控制板；此操作仅需执行一次，或在步进电机脚本发布任何软件更新时进行。
    5. 将恒流刺激器的刺激强度调节旋钮设置为 0 mA。使用定制安装支架将步进电机与刺激强度调节旋钮连接。这些支架可通过 3D 打印制作，从而实现低成本、快速且可定制的安装方案。请查阅 GitHub，确认是否已有针对所选刺激器设计的安装支架。
    6. 使用定制的转接套筒将步进电机套管连接至刺激幅度控制旋钮。出于强度和耐用性考虑，这些转接套筒应采用金属材料制造；不过，3D打印部件也可使用，尽管可能需要定期更换。请查阅GitHub，确认是否已有针对所选刺激器设计的套筒转接件。
    7. 使用定制支架和筒形适配器将控制板/步进电机装置松散地固定在刺激器控制旋钮上。
      注意：支架和镜筒适配器将在软件启动后进行紧固，此时步进电机会自动归位至零位。
    8. 按照方案步骤 2.5.2–2.5.3 所述连接 PulsePal（无需将输出通道 1 连接到刺激器），因为仍需生成 TTL 事件标记以用于分析及插件正常运行。此外，将输出通道 2 连接到 DS7 刺激器以触发其工作。
  7. 按照下述方法制备小鼠皮肤-神经标本。
    1. 提供2至4月龄的C57BL/6J小鼠（本研究中来自英国Charles River Laboratories），雌雄均可，并给予食物和水 随意摄取.
    2. 在通过腹腔注射戊巴比妥钠（≥200 mg/kg）过量麻醉处死小鼠并确认循环停止后，按照Zimmermann等所述方法，从小鼠后肢足底背侧皮肤及支配该区域的隐神经进行解剖分离。23.
    3. 将皮肤-神经标本保存在通有碳合气的合成间质液中（表1在定制的双室丙烯酸浴槽的一半中（灌流速率为15 mL/min，体积为30 mL），将神经穿过小孔进入充满矿物油的室，并用凡士林密封。矿物油可提供绝缘的记录环境，温度维持在30–32 °C。
    4. 使用超细镊子从神经干上分离出两条细丝，并将每条细丝分别悬挂于双极银/氯化银记录电极的两侧。
    5. 使用RHD2216 16通道双极头戴式放大器对神经信号进行数字化和放大，并通过采集板处理信号。以30 kHz的采样率对信号进行采样，带通滤波范围为300–6,000 Hz，并通过图形用户界面（GUI）对信号进行可视化。
    6. 使用钝头玻璃棒轻划标本的皮肤。利用低幅度的群体活动来确认标本具有生命活性。
  8. 按照以下所述进行人类C纤维微神经图记录术。
    1. 在参与者签署书面知情同意书后，按照先前所述方法进行微神经记录术24.
    2. 让受试者舒适地仰卧于床上，用枕头支撑身体。使用超声扫描仪定位腓浅神经，并在距外踝近端约5-10 cm、相当于小腿中部水平的位置标记目标区域。
    3. 使用含70%酒精的2%氯己定擦拭目标区域周围的皮肤进行消毒，并在预期记录位置附近的小腿中部水平皮下插入无菌参考电极。
    4. 在超声引导下，将无菌记录电极插入目标区域内的腓浅神经。
    5. 使用 RHD2216 16通道双极头戴式放大器对神经信号进行数字化和放大，并通过采集板处理信号。以 30 kHz 的采样率采集信号，带通滤波范围为 300–6,000 Hz，并通过图形用户界面（GUI）实时显示信号。
      注意：采集设备通过一个具有 5 kV RMS 隔离能力的 USB 3.0 隔离器与笔记本电脑进行电气隔离，并由其供电 通过 一个定制的12 V电池电源。
    6. 通过轻柔划动皮肤以诱发机械性群集放电，从而确认神经内定位成功。此外，受试者在神经内定位成功时通常会报告足部背外侧出现感觉异常。

3. 软件设置及外周神经元的识别与表型分析

  1. 按照以下说明设置软件。
    1. 打开图形用户界面（图3）。如果步进电机控制板已连接到计算机，系统将自动检测并将其位置设为零。在刺激器的刺激幅度旋钮和步进电机均处于零位的情况下，拧紧步骤2.6.5–2.6.7中所述的定制安装架和筒夹适配器。
      注意：如果步进电机和刺激幅度旋钮未同时归零"zeroed"，可能导致步进电机试图将控制旋钮转动超出其范围，从而造成损坏。
    2. 在选项菜单中选择触发通道，并选择包含来自PulsePal输出通道2的电刺激TTL标记的ADC通道。
    3. 在选项菜单中选择数据通道，并选择包含电生理数据的通道。
    4. 在刺激控制面板中，使用滑块定义初始、最小和最大刺激幅度。确保当前刺激设置高于0，以生成TTL标记。
      注意：某些刺激器的输入-输出缩放比例并非1:1；在选择适当的刺激幅度时应考虑这一点。例如，某些刺激系统可选择1:10的输出比例，以从恒流刺激器获得更高的输出。
    5. 在刺激控制面板中，点击F以加载包含刺激指令的文件。电刺激方案以逗号分隔值（CSV）文件形式存储，文件中包含所需的刺激频率和持续时间，使用户能够为其实验创建复杂的刺激范式。示例模板可在此处获取： https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv
    6. 在刺激控制面板中，点击>以开始执行已加载的刺激范式。默认情况下，APTrack会请求PulsePal生成持续时间为0.5 ms、幅度可变的正向方波脉冲，以控制恒流刺激器的刺激幅度。
    7. 时间序列点阵图将开始实时更新，显示对电刺激的响应，每次新的刺激响应将以右侧新增的一列形式呈现。
  2. 可视化并识别单个神经元的动作电位。
    1. 为成功检测单个神经元的动作电位，设置合适的图像阈值至关重要。在时间序列点阵图面板中，调整低、检测和高图像阈值。
      1. 在选项菜单中选择一种配色方案。在白热（White Hot, WHOT）模式（默认）下，低于低图像阈值的电压以黑色编码；介于低图像阈值与检测阈值之间的电压以灰度编码；高于检测阈值的电压以绿色编码；高于高图像阈值的电压以红色编码。
    2. 外周神经元在低刺激频率（<0.25 Hz）下表现出恒定潜伏期的响应，这些响应由其传导速度以及刺激位点与记录位点之间的距离决定。在设置合适的图像阈值后，算法检测到的阈值跨越事件将以绿色编码（图4）。
    3. 系统性地在被记录神经所支配的皮肤区域移动刺激电极，每个位点至少进行三次刺激。在时间序列点阵图中监测每次电刺激后在同一时间点出现的阈值跨越事件（以绿色标记）。
      注意：在小鼠实验中，采用5 mA的搜索刺激。在人体实验中，经皮电搜索刺激的幅度根据受试者的主观疼痛评分进行滴定，且从不超过7/10。
    4. 检查是否在同一潜伏期和相同刺激位置连续出现三个阈值跨越事件（绿色条带），这表明已识别出一个外周神经元的动作电位。
    5. 通过确定目标神经感受野中电敏感性最高的点来优化刺激电极的位置，并将电极固定。在人体微神经图记录中，此时应改用皮内电针灸针（直径0.2 mm）进行双极电刺激；在小鼠实验中 ，使用定制的经皮刺激探针，以保持刺激位置恒定。
  3. 对外周神经元进行分类及感觉表型分析。
    1. 通过手动调节刺激幅度或根据需要使用APTrack（见步骤4.1–4.2）来估算目标动作电位的电阈值。
    2. 在整个感觉表型分析过程中，以估算电阈值的2倍强度、0.25 Hz的频率刺激感受野。
    3. 通过将传导距离除以传导潜伏期来计算神经元的传导速度。C纤维可通过≤2 m/s的传导速度进行识别。
    4. 使用von Frey纤维丝机械刺激感受野，以确定激活的机械阈值。机械感觉可通过电压轨迹上可见的诱发电位以及（如果是C纤维）在施加足够力量后神经元潜伏期的增加来识别。
    5. 加热神经元的感受野，再次观察电压轨迹上是否出现动作电位，以及（如果是C纤维）在施加足够热量后潜伏期是否增加。对热不敏感的神经元由于热力学对轴突传导的影响，其潜伏期会缩短。
      注意：在人体微神经图记录中，使用TSC-II设备实现快速而精确的温度控制。在小鼠制备中，将加热或冷却的合成间质液加入覆盖在感受野上的铝制隔离室，以便接触神经末梢的同时限制热量快速散失至周围液体中。使用热电偶记录温度。
    6. 冷却感受野，再次观察电压轨迹上是否出现动作电位，以及（如果是C纤维）在施加足够冷刺激后潜伏期是否显著增加。所有神经元由于热力学对轴突传导的影响，其潜伏期均会增加，因此仅凭潜伏期增加来判断神经元是否为冷敏感时需谨慎。

4. 潜伏期与电阈值追踪

  1. 按照以下说明进行潜伏期追踪。
    1. 在时间序列点阵图上识别出单个神经元的动作电位后，移动时间序列点阵图右侧的灰色线性滑块，以调整搜索框的位置。
    2. 在时间序列点阵图下方，调节搜索框宽度的旋钮滑块至合适宽度。将搜索框设得较窄可降低瞬时噪声尖峰、自发发放的动作电位或其他邻近的固定潜伏期动作电位被误识别为目标动作电位的可能性。
    3. 要开始追踪目标动作电位，请点击多单位追踪表格下方的 + 按钮。表格中将新增一行，包含目标动作电位的详细信息，包括潜伏期位置、在2–10次刺激中的放电百分比（可在选项菜单中调整）以及检测到的峰值幅度。
    4. 一旦动作电位被添加至多单位追踪表格，潜伏期追踪算法（图5）将在每次后续电刺激时自动对该动作电位执行。
    5. 如果在时间序列点阵图上可见多个离散的动作电位，可按照上述方法将其逐一添加至多单位追踪表格。理论上，可同时进行潜伏期追踪并添加至该表格的动作电位最大数量为32位整数的最大值。
    6. 在多单位追踪表格中勾选追踪尖峰复选框，可使搜索框根据潜伏期追踪算法确定的位置自动移动至对应动作电位的适当位置。这有助于实时监测潜伏期追踪情况，并确保追踪按预期跟随目标动作电位。其他尖峰的潜伏期追踪将在后台正常继续。
    7. 使用每行末尾的删除按钮，可从多单位追踪表格中移除已追踪的动作电位。
  2. 按照以下说明进行电阈值追踪。
    1. 在刺激控制面板中将递增和递减速率调整为0.1 V至0.5 V之间。保持这两个值相等，除非实验设计要求在实验过程中进行调整，否则不应更改。
    2. 确保刺激频率设置为适当水平，通常为0.25–0.5 Hz，除非调节刺激频率本身是实验范式的一部分。提高伤害性感受器的放电频率可能改变其电阈值。
    3. 当某一动作电位被成功追踪后，在多单位追踪表格中勾选追踪阈值复选框，将启动电阈值追踪算法（图6）。
      注：电阈值追踪仅针对目标动作电位运行；然而，随着刺激幅度的变化，多单位追踪表格中其他动作电位的放电率也将相应更新。
    4. 手动调节刺激幅度至接近电阈值的估计值，以缩短确定电阈值所需的等待时间。建立可靠电阈值所需的时间取决于刺激频率、递增和递减速率，以及初始刺激幅度与神经元电阈值之间的差异。
    5. 软件采用上下法（up-down method）估算神经元的电阈值。在多单位追踪表格中，放电率基于此前2–10次刺激的结果确定（可在选项菜单中选择）。选择需考虑的刺激事件数量；数值越高，阈值估计的可靠性越高，但所需时间也更长。
    6. 在人体微神经图记录过程中，应密切监测电刺激引起的疼痛程度，以避免受试者过度不适；在研究伤害性感受器（尤其是静息/休眠C纤维）时，一定程度的不适难以避免。在电阈值追踪过程中，随着刺激幅度增加，应定期询问受试者的疼痛评分，并始终停留在恒流刺激器附近，以便在受试者要求时立即关闭刺激。
      注：也可通过用户界面关闭电刺激，方法是在刺激控制面板中点击[ ] 按钮。
    7. 当放电率达到50%时，表明已大致确定电阈值。
    8. 在进行电阈值追踪的同时，可对感受野施加实验性干预，例如温度或药物干预，以追踪这些干预对伤害性感受器电阈值的影响。
      注：实验干预后，应留出足够时间以识别新的伤害性感受器阈值。

结果

软件控制实验的一个代表性示例如图7所示。该软件采用上下法迭代调整刺激强度，以有效确定单个伤害性感受器的电阈值。我们首次展示了在人类微神经图记录期间实现单神经元电阈值实时追踪的可行性（图7A）。此外，我们还展示了在小鼠Aδ纤维中进行的电阈值追踪（图7B）。如本研究中所采用的，通过阈值跨越来识别动作电位，足以实现对电阈值随时间变化的追踪。我们建议用户采取措施尽量减少记录过程中的电噪声，例如使用法拉第笼和带通滤波器以提高信噪比。

为了证明电阈值追踪可用于评估人类伤害性感受器兴奋性的变化，我们进行了阶梯式加热范式下的电阈值追踪（图8）。升高伤害性感受器末梢的温度会降低引发动作电位所需的电刺激电流，反映出伤害性感受器兴奋性增加（图8C）。这可能是由于C纤维伤害性感受器中表达的热敏感离子通道产生了感受器电位所致14。在最高温度阶跃（44 °C）时，热刺激诱发了动作电位（图8A，刺激编号86–96）。这会导致电阈值升高，因为伤害性感受器在高频放电后可能处于不应期状态。与预期一致，随着温度升高，所追踪动作电位的潜伏期缩短。这被认为是由温度对传导机制的热力学效应引起，从而提高了C纤维的传导速度。该C纤维还可能表现出翻转现象（图8B，刺激编号47–54），如果动作电位落在算法搜索窗口之外，则可能导致后续电刺激的幅度被错误地增加。

电生理实验示意图，显示电刺激器与记录电极的装置设置。
图1：在啮齿类动物和人类中使用APTrack进行伤害感受器电阈值追踪所需的设备设置和电缆连接示意图。 注意两种不同的刺激强度控制方法：在人体实验装置中，使用步进电机手动调节刺激器；在啮齿类动物实验装置中，使用PulsePal控制输入电压的刺激器。1运行 Open Ephys 平台插件的个人电脑（Windows、Mac 或 Linux）。2) 一个用于操作 DS7 上刺激强度旋钮的步进电机。3) 一种经批准可用于人体的恒流刺激器；本实验中使用的是 DS7。4) 一个USB 3.0光电隔离器，用于将受试者与计算机隔离开（可选，仅在人体研究中需要）。5) 使用 PulsePal V2 脉冲发生器，该设备可生成与请求刺激幅度相对应的 TTL 时间戳（输出通道 2）和电压阶跃信号（输出通道 1）。6) 用于动物实验的恒流刺激器；本实验中使用的是 DS4。7) 用于该系统的直流电源（啮齿类实验装置使用市电直流电源，人体实验装置使用电池直流电源）。8) 一个采集板。9) 用于连接传输待记录信号（如热电偶输出和TTL标记）的BNC同轴电缆的I/O板。10正在进行伤害性感受器电生理记录的小鼠皮肤-神经标本。11一名人类受试者正在接受来自腓浅神经C纤维的微神经记录。12) 用于记录信号采集与数字化的 Intan RHD2216 头级放大器。13) 一个Intan电极适配板，用于连接记录电极，并将信号传递至RHD2216前置放大器。14一种可输出温度的热刺激系统 通过 BNC 同轴连接。15一个由3.3 V电池供电的按钮/脚踏开关，用于标记机械刺激事件和药物施加时间点。 请点击此处以查看此图的放大版本。

音频处理软件界面；信号链图；ADC、信号记录、数据文件管理。
图 2：模板信号链。 红色箭头指向用于启用来自I/O板ADC输入的按钮。黄色箭头指示用于选择Open Ephys文件格式的下拉菜单。绿色箭头指示播放和录制按钮。 请点击此处查看此图的放大版本。

显示潜伏期反应、刺激控制、追踪表格、选项菜单和数据分析的时间序列点阵图。
图 3：图形用户界面。 该图形用户界面包含四个主要组件。（1）时间序列点阵图面板（绿色），用于数据可视化以及控制绘图的相关设置。绿色箭头指示了表现出渐进性活动依赖性减慢的恒定潜伏期反应。（2）刺激控制面板（黄色），用于设置刺激幅度参数并加载刺激范式脚本。（3）多通道单元追踪表（蓝色），用于添加需追踪的动作电位，并启动潜伏期和电阈值追踪功能。（4）选项菜单，用于选择数据及TTL触发信号的输入通道与配色样式。请点击此处查看该图的放大版本。

动作电位、刺激伪迹图表；带有神经信号分析用户界面的电压轨迹。
图4：通过 APTrack 在时间点阵图上进行实时数据可视化，促进恒定潜伏期动作电位的识别。 这是一个高信噪比的示例。时间点阵图中展示的数据来自微神经图记录期间从人体腓浅神经采集的C纤维信号。电压轨迹是 Open Ephys 中类似示波器的局部场电位（LFP）查看器插件。APTrack 用户界面是该插件的图形用户界面。绿色箭头标示了被追踪的动作电位，时间点阵图边缘的圆形滑块用于控制搜索框的位置，算法将在该区域内搜索达到阈值的事件。电压轨迹上的电刺激伪迹以蓝色标记。模拟电压指令的刺激幅度以红色标示；请注意，该幅度可能与刺激电流的实际幅度不同，具体取决于刺激器上设置的缩放系数。请点击此处查看该图的放大版本。

潜伏期追踪算法；电压记录方程图；方法学示意图。
图 5：潜伏期追踪算法的图形化表示。 简而言之，当通过阈值跨越检测到动作电位时，搜索窗口将调整其位置，使其时间中心对准峰值电压时刻。 请点击此处查看该图的放大版本。

电阈值追踪算法示意图；V，Vt 方程；电压刺激过程。
图6：电阈值追踪算法的图示。 简而言之，若通过阈值跨越检测到动作电位，则刺激幅度将按递减速率降低；若未检测到动作电位，则刺激幅度将按递增速率增加。请点击此处查看该图的放大版本。

电生理反应图表，刺激与时间关系，刺激电流（mA），数据对比。
图7：以0.25 Hz刺激频率进行单个神经元动作电位的自动电阈值追踪。 （A）在微神经图记录实验期间，来自人类腓浅神经C纤维的连续记录迹线。（B）在皮肤-神经标本分离纤维电生理实验期间，来自小鼠隐神经Aδ纤维的连续记录迹线。当检测到动作电位时，迹线被标记为红色，导致刺激幅度下降。该软件算法可有效确定引发50%放电概率所需的刺激幅度。 请点击此处查看此图的放大版本。

神经反应分析，刺激与时间的点阵图，电生理实验结果。
图 8：在热刺激人类C纤维伤害感受器期间，以0.25 Hz刺激频率进行的电阈值追踪。 y轴表示从实验范式开始起的刺激次数。(A) 电刺激后4,000 ms内的电压轨迹，阈值跨越事件以红色标记。(B) 来自A的电压轨迹，在被追踪的动作电位附近放大显示。当检测到被追踪的动作电位时，轨迹被染成红色。垂直蓝色线表示被追踪神经元的基线潜伏期。(C) APTrack命令的刺激电流。垂直蓝色线表示基线电阈值。(D) 受体区TCS-II热刺激探头的温度。请点击此处查看该图的放大版本。

化合物浓度
NaCl107.8 mM
NaHCO326.2 mM
KCl3.5 mM
NaH2PO41.67 mM
CaCl21.53 mM
MgSO40.69 mM
Sodium Gluconate9.64 mM
Sucrose7.6 mM
Glucose5.55 mM

表1：小鼠皮肤-神经标本用人工间质液的成分23。

讨论

APTrack 是一个用于 Open Ephys 平台的软件插件。我们选择该平台是因为其开源、灵活且实施成本低廉。在撰写本文时，除恒流刺激器外，启动该插件所需的所有设备购置费用约为 5,000 美元。我们希望这将使研究人员能够更便捷地在其外周神经电生理学研究中应用 APTrack。此外，研究人员可自由修改该软件以满足其特定实验需求。重要的是，该工具首次实现了在人体中对单个 C 纤维伤害性感受器进行电阈值追踪。

信噪比越高，算法识别动作电位的能力就越强。在微神经图记录过程中，我们大多数记录的信噪比均足够理想，但使用者必须警惕信号随时间推移而退化的风险。这一点对于较长时间的实验方案尤为重要，因为如果追踪的动作电位幅度降至检测阈值以下，刺激强度将被错误地增加；实验人员可通过监控插件并在必要时调整设置来缓解这一问题。带通滤波有助于提高信噪比，但如果较大的瞬态信号出现在搜索时间窗内，仍可能被误识别为动作电位。通过缩小插件搜索动作电位的时间窗以及优化阈值设置，可降低将瞬态噪声误判为动作电位的风险。然而，仍可能存在一些影响插件性能的情况。如果大振幅的动作电位出现在算法的搜索时间窗内，自发性活动可能会造成干扰，导致这些电位被误识别为目标动作电位。此外，若所关注神经元的自发活动导致电刺激落在其不应期内，则可能无法成功诱发动作电位。当初级传入神经元表现出“翻转-翻转”（flip-flop）现象时，使用该软件也可能遇到困难：即单个神经元的不同终末分支交替被激活，导致诱发出的动作电位具有两个（或更多）互斥的基础潜伏期20。在对具有“翻转-翻转”现象且信噪比较高的神经元进行记录时，我们通过扩大搜索时间窗以涵盖该神经元表现出的所有可能传导速度，成功实现了潜伏期和电阈值的追踪。然而，电阈值可能会因被兴奋的神经元终末分支不同而有所变化，这可能部分归因于电刺激部位到不同伤害性感受器终末之间的距离差异。未来可进一步改进动作电位识别过程，例如引入模板匹配等方法，这些技术有望整合至本软件中。此外，若开发出用于信号链前端的带阻滤波或自适应噪声滤波的图形用户界面（GUI）插件，也可在APTrack之前使用。

我们认为电阈值是指在用户定义的若干次电刺激（通常为2-10次）中，能够引发动作电位50%所需电流强度。电刺激的波形为持续时间0.5 ms、正向的方波脉冲。该定义不同于常用神经元兴奋性指标——阈强度（rheobase）的测定。尽管本插件可被调整用于测定阈强度，但我们选择了一个更简单的指标，因为在兴奋性的动态变化（例如加热过程中可能发生的改变）情况下，相较于阈强度的变化，我们所采用的电阈值估算方法更易于量化。

该软件可用于人体和啮齿类动物实验，这得益于其对电刺激系统的灵活支持。该软件可与任何接受模拟命令电压的刺激器配合使用，或通过步进电机进行手动连接的刺激器。在微神经图记录中，我们将其与一款通过CE认证的恒流刺激器结合使用，该刺激器专为人体研究设计，其刺激强度通过旋钮控制。接受模拟电压指令的刺激器可能产生噪声，因为在刺激间隔期间电路不会断开，这意味着模拟输入端上的任何50/60 Hz嗡鸣或噪声都会传递到记录信号中。理想情况下，应使用需要额外TTL触发信号来接通电路的刺激器，从而生成与模拟电压输入相对应电流的刺激脉冲，这类刺激器最适合与该插件配合使用。这种方式可防止刺激间隔期间的噪声传递至记录信号中。

该软件采用简单的上下法来估算电阈值，这种方法已在心理物理学测试中使用了数十年25。根据上下法，用于调节刺激强度的电阈值追踪算法在计算下一次刺激强度时，仅考虑前一次刺激的强度及其响应。这意味着刺激强度将在真实电阈值附近波动，从而在阈值稳定的情况下产生50%的放电率。每次增加或减少的最小步长为0.01 V；假设刺激器具有1 V:1 mA的输入-输出比例，并具备足够分辨率以实现如此小的步进变化，则该值相当于0.01 mA。每当在用户定义的前若干次刺激（2–10次）中达到50%放电率时，插件将更新对目标动作电位电阈值的实时估计。事后分析中，我们建议采用最近2–10次刺激强度的滑动平均值来估算电阈值，需注意该估计值仅在放电率相对稳定于50%时才准确。无论是实时估计还是事后 估计电阈值，都需要权衡分辨率、可靠性和所需时间。使用更小的增减步长可提高电阈值估计的准确性，但会延长初始寻找新电阈值以及受到干扰后重新调整所需的时间。基于更多前序刺激计算电阈值可提高估计的可靠性，但也会增加获得准确估计所需的时间。

APTrack 旨在用于外周神经记录，特别适用于在实验性或病理性的干扰过程中追踪 C 纤维的动作电位阈值，尤其是在动作电位潜伏期可能随基础神经元活动而变化的时间段内。该方法将有助于研究健康志愿者和患者中轴突兴奋性以及伤害感受器发生器电位。我们预计，其他电生理学领域也可能采用并调整此工具，用于任何需要对与刺激同步的活动进行电阈值追踪的实验。例如，该工具也可轻松改造用于光遗传学刺激，通过 APTrack 驱动光脉冲。该插件为开源软件，研究人员可在 GPLv3 许可协议下自由使用。它基于 Open Ephys 平台构建，后者是一种可扩展、低成本、开源的数据采集系统。该插件提供了额外的接口，供下游插件提取动作电位信息，并提供附加的用户界面或自适应实验范式。该插件提供了一个简洁的用户界面，用于实时可视化动作电位及其潜伏期追踪。它还可以回放先前记录的数据，并使用时间点阵图进行可视化。此外，它还能在回放历史数据时执行潜伏期追踪。尽管目前已有其他可用于实时潜伏期追踪的软件包，但它们并非开源，也无法实现电阈值追踪26,27。与传统方法相比，APTrack 具有优势，传统方法依赖电压轨迹识别恒定潜伏期的动作电位，而 APTrack 采用时间点阵图进行数据可视化。此外，我们在低信噪比实验中使用该工具的经验表明，时间点阵图的可视化方法能够识别出传统方法可能遗漏的恒定潜伏期动作电位。

全神经阈值追踪是一种广泛用于评估轴突兴奋性的方法13。单神经元电阈值追踪技术此前已被用于量化啮齿类动物C纤维伤害感受器的兴奋性14，其在人类中的应用价值也已被认识10,11；然而，直到目前，该技术在人类中的实现尚不可行。我们提供了一种新颖的开源工具，可直接在啮齿类动物和人类的外周神经电生理研究中测量单个伤害感受器的兴奋性。APTrack首次实现了在人类中对单个神经元动作电位进行实时、开源的电阈值追踪。我们预期该工具将促进啮齿类动物与人类之间伤害感受器的转化医学研究。

披露

G.W.T.N. 获得英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）与布里斯托大学及礼来公司合作的博士培训伙伴项目资助（BB/T508342/1）。A.P.N. 目前受雇于礼来公司，可能持有该公司股票。

致谢

我们感谢以下资助方的支持：医学科学院（J.P.D.，A.E.P.）、Versus Arthritis（J.P.D.，A.E.P.）、Jean Golding研究所种子基金（J.P.D.，A.E.P.，G.W.，A.C.S.，M.M.P.），以及生物技术和生物科学研究理事会与礼来公司合作培训项目博士生奖学金（G.W.T.N.）。我们向所有为APTrack开发做出贡献的人员致以诚挚谢意。同时，我们感谢参与微神经图实验的志愿者，以及患者与公众参与和协作项目的合作者们，感谢他们宝贵的支持与贡献。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12V 直流电源 NANA用于为 uStepper S-lite 供电。适用于旋钮控制型刺激器。
36 针电极适配板Intan TechnologyC3410APTrack 依赖组件。用于将电极输入连接至前置放大器。截至 2021 年 3 月，价格为 255 美元。
APTrack 插件NANAhttps://github.com/Microneurography/APTrack
双极 Ag/AgCl 记录电极定制NA用于皮肤-神经标本的记录电极。或等效产品。
双极同心刺激电极World Precision InstrumentsSNE-100用于小鼠皮肤-神经标本的电刺激。或等效产品。
双极经皮刺激电极定制NA在微神经图记录期间寻找单个神经元动作电位时，用于经皮电刺激。
BNC T 型分路器（1 个以上）NANAAPTrack 依赖组件。任何标准 BNC T 型分路器均可。
BNC 转 BNC 电缆（3 根以上）NANAAPTrack 依赖组件。任何标准 BNC 电缆均可。 
C6H11NaO7MerckS2054皮肤-神经标本合成组织间液成分。或等效产品。
CaCl2MerckC5670皮肤-神经标本合成组织间液成分。或等效产品。
Digitimer DS4 恒流刺激器DigitimerDS4用于动物研究的恒流刺激器。截至 2022 年 9 月，价格为 1,695 英镑。£ 
Digitimer DS7 恒流刺激器DigitimerDS7A用于人体研究的恒流刺激器。截至 2022 年 9 月，价格为 3,400 英镑。£ 
Electroaccupuncture Classic Plus 刺激电极Harmony MedicalNA用于在人体微神经图记录期间，对足背进行固定位置的皮内电刺激。
葡萄糖Fisher ScientificG/0450/60皮肤-神经标本合成组织间液成分。或等效产品。
HDMI 电缆NANAAPTrack 依赖组件。任何标准无源 HDMI 电缆均可。用于连接 OE I/O 板与 OE 采集板。
KClMerckP9541皮肤-神经标本合成组织间液成分。或等效产品。
MgSO4Acros Organics213115000皮肤-神经标本合成组织间液成分。或等效产品。
矿物油Merck330779用于皮肤-神经标本中神经记录的电绝缘。或等效产品。
NaClMerckS9888皮肤-神经标本合成组织间液成分。或等效产品。
NaHCO3MerckS6014皮肤-神经标本合成组织间液成分。或等效产品。
NaHCO3MerckS0751皮肤-神经标本合成组织间液成分。或等效产品。
Open Ephys 采集板Open EphysNAAPTrack 依赖组件。包含用于连接计算机的 USB 电缆和电源插座供电装置。截至 2022 年 9 月，价格为 2,955 欧元。€
Open Ephys 图形用户界面Open EphysNAhttps://github.com/open-ephys/plugin-GUI
Open Ephys I/O 板Open EphysNAAPTrack 依赖组件。用于通过 BNC 电缆进行 ADC 电压输入。截至 2022 年 9 月，无连接器版本价格为 12.5 欧元，带连接器版本价格为 85 欧元。€€
PulsePal V2Sanworks1102APTrack 依赖组件。开源 DAC 与脉冲序列发生器。截至 2022 年 9 月，预组装版本价格为 725 美元，自行组装约需 275 美元。
RHD 6 英尺 SPI 电缆Intan TechnologyC3206APTrack 依赖组件。用于连接前置放大器与 OE 采集板。截至 2021 年 3 月，价格为 295 美元。
RHD2216 16 通道双极前置放大器Intan TechnologyC3313APTrack 依赖组件。用于数据采集与数字化。截至 2021 年 3 月，价格为 725 美元。或等效的 RHD2000 系列前置放大器。
蔗糖Fisher ScientificS/8560/60皮肤-神经标本合成组织间液成分。或等效产品。
TCS-II 热刺激器QST.LabNA用于在人体微神经图记录期间对伤害性感受器感受野进行热刺激。
钨微电极对（主动电极 + 参考电极）FHC30085用于微神经图记录。长度为 35 mm。
超声扫描仪 iQ+ Butterfly NetworkNA用于在微神经图记录期间引导电极插入的超声成像。
USB 3.0 5 kV RMS 隔离器Inota Technology7055-D用于将人体微神经图记录受试者与计算机隔离。截至 2022 年 9 月，价格为 459 欧元。€
USB-A 转 micro USB-B 电缆（2 根）NANAAPTrack 依赖组件。用于将计算机连接至 PulsePal 和 uStepper S-lite（若使用步进电机刺激器接口）。 
uStepper S-lite + NEMA17 电机uStepperNA通过控制旋钮与刺激器连接。截至 2022 年 9 月，价格为 50 欧元。€
von Frey 纤维丝Ugo Basile37450-275用于在伤害性感受器感觉表型分析期间对其感受野进行机械刺激。

参考文献

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伤害性感受器兴奋性闭环刺激实时电生理学人体微神经图描记皮肤-神经制备动作电位检测慢性疼痛生物标志物外周神经记录开源疼痛研究
开源实时闭环电阈值追踪技术在转化疼痛研究中的应用
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