本文介绍了两种无需使用表皮撕取法的表型分析方法，用于鉴定调控气孔发育的基因。第一种方法展示了如何利用甲苯胺蓝O染色的植物表皮来分析气孔表型。第二种方法描述了如何鉴定气孔配体并监测其生物学活性。
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本文内容
摘要
摘要
气孔是陆生植物表面参与气体交换和水蒸气释放的小孔，其功能对植物的生产力和生存至关重要。因此，了解气孔发育和排列模式的机制具有重要的农艺价值。本文介绍了两种利用Arabidopsis子叶的表型分析方法，可用于鉴定调控气孔发育和模式形成的基因。首先介绍的是使用甲苯胺蓝O染色子叶分析气孔表型的操作流程。该方法快速可靠，无需使用表皮剥离技术——后者虽广泛用于表型分析，但需要专门的培训。由于EPF肽含有多个半胱氨酸残基，其生物活性肽的鉴定与合成在气孔发育研究中一直存在挑战。因此，本文其次介绍了一种通过生物测定法鉴定气孔配体并监测其生物活性的实验流程。该方法的主要优势在于能够相对简便地获得可重复的数据，同时减少所需肽溶液的用量以及表征肽在调控气孔模式与发育中作用所需的时间。总体而言，这些设计良好的实验方案提高了研究潜在气孔调控因子的效率，包括那些因具有高度复杂结构而发挥活性的富含半胱氨酸的分泌肽。
引言
气孔在光合作用和蒸腾作用这两个基本生物学过程中的功能依赖于其正确的模式形成和分化，这一过程由EPF肽类信号通路调控。拟南芥中三种分泌型富含半胱氨酸的多肽EPF1、EPF2和STOMAGEN/EPFL9调控气孔发育的不同方面，并被细胞表面受体组分所感知，这些受体包括ERECTA家族受体激酶（ER、ERL1和ERL2）、SERK蛋白以及TMM1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。这种识别随后通过依赖MAPK的途径导致促进气孔分化的转录因子表达下调11。这些核心气孔相关基因的发现主要依赖于对表皮发育缺陷突变体的表型筛选。本文介绍了一些相对简单且高效的表型分析方法，用于观察气孔及其他表皮细胞，这些方法对于....
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方案
1. 染色 拟南芥 用TBO染色的子叶
- 种子灭菌与生长条件
- 在微型离心管中，每种基因型取约30粒 Arabidopsis 种子，加入1 mL种子灭菌液（33%商用漂白剂，0.1% Triton X-100），室温（RT）轻柔振荡10–12分钟进行灭菌。
注：为获得对照样本，需灭菌约30粒野生型 Arabidopsis 生态型Columbia（Col-0）种子和/或约60粒携带化学诱导型基因的转基因植株种子（例如 Est::EPF27），并将这些转基因 幼苗种植于不含诱导剂（如β-雌二醇）的1/2 Murashige和Skoog（MS）琼脂平板（2.16 g/L，含0.8%琼脂[w/v]）上（图1 和 图2）。 - 吸除灭菌液，在超净工作台中用1 mL无菌水洗涤种子四次，然后将种子重悬于约200 μL无菌0.1%琼脂中。
- 使用移液器将每种基因型约30粒种子播种于1/2 MS琼脂平板或含诱导剂的1/2 MS琼脂平板（例如含10 µM β-雌二醇）上，以实现转基因（例如 Est::EPF27....
- 在微型离心管中，每种基因型取约30粒 Arabidopsis 种子，加入1 mL种子灭菌液（33%商用漂白剂，0.1% Triton X-100），室温（RT）轻柔振荡10–12分钟进行灭菌。
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结果
多种已知气孔密度较低或较高且存在簇集现象的气孔转基因植株和突变体（epf22,5、epf1 epf22,5、tmm12、一条STOMAGEN基因沉默的株系4，以及携带雌二醇诱导型Est::EPF1或Est::EPF2过表达载体的转基因株系7）被用于验证本文所介绍的两种表型分析方法的有效性，这些方法旨在鉴定和表征在气孔发育与模式形成中起作用的基因。为了在无需表皮剥离的情况下获得高质量的表皮图像，以定量分析不同类型表皮细胞，针对每种基因型预先优化TBO染色时间至关重要，因为不同基因型的表皮表型可能与野生型对照（Col-0）存在差异（
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讨论
本文介绍的两种用于鉴定和表征控制气孔模式形成及分化的基因的表型分析方法，是便捷且可靠的检测手段。这些实验方案无需使用表皮撕片和特殊设备（此类方法耗时较长，且样品制备需要专门培训），但仍可获得高质量图像，用于表皮表型的定量分析。
该技术在使用TBO染色进行表型分析时存在局限性 拟南芥 子叶的一个特点是，要获得具有不同表皮细胞类型视觉对比度的高质量图像，依赖于染色时间以及组织的特有特性，这些特性可能因物种和基因型而异（图1)18其他利用表皮剥离观察表皮细胞的表型分析方法面临相同的挑战，且通常需要更长的时间和专门的培训。为避免难以获得适合数据分析的充分染色表皮图像，可对气孔较少基因型的子叶延长染色时间，而对气孔较多基因型的样本缩短染色时间。此外，可通过先检测少量样本，针对具有相似表皮表型的基因型优化染色时间，进而调整每种基因型的最佳染色时长。
获得足量正确折叠的生物活性肽，尤其是富含半胱氨酸的肽（这类肽是调控.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）发现计划和康考迪亚大学资助。K.B. 获得印度国家海外奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 18 mm x 18 mm 盖玻片 | VWR | 16004-326 | |
| 带盖的24孔无菌板 | VWR | CA62406-183 | |
| 3M 微孔手术胶带 | Fisher Scientific | 19-027-761 | 用于密封 MS 培养基平板的微孔外科手术纸胶带 |
| 76 x 26 mm 显微镜载玻片 | TLG | GEW90-2575-03 | |
| 乙酸， ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| 琼脂 | BioShop | AGR001.1 | |
| 漂白 | 家用漂白剂（例如，Clorox） | ||
| 共聚焦显微镜 | 尼康 | 尼康C2（由NIS-Elements操控） | |
| 乙醇 | 格林菲尔德 | P210EAAN | |
| FIJI | 开源 | (Fiji 就是) ImageJ v2.1/1.5.3j | 从 https://imagej.net/software/fiji/ 下载 |
| 镊子 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| 甘博格维生素混合物 | Cassson 实验室 | GBL01-100ML | 4°C 保存 °C |
| 甘油 | Fisher Scientific | G33-4 | |
| 生长室 | Conviron model E15 | 16小时光照周期，设定为21°C，光照强度为120 µ摩尔·m-2·s-1. | |
| 光照 | HD Supply | 25272 | 荧光 生长室中的灯光，Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| 微量离心管 | Fisher Scientific | 14-222-155 | 用于对拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子进行消毒的试管 |
| 显微镜 | Nikon | 配备 DsRi2 数字相机的 Nikon Eclipse TiE 显微镜 | |
| Murashige 和 Skoog 基本盐 | Cassson 实验室 | MSP01-1LT | 4°C 保存 °C |
| 培养皿 100 mm × 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | 用于培养拟南芥的倒入MS培养基的培养皿 |
| 碘化丙啶 | VWR | 39139-064 | |
| 手术刀 | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| 蔗糖 | BioShop | SUC700.5 | |
| 甲苯胺蓝 O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris 碱 | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β雌二醇 | Sigma-Aldrich | E2758 |
参考文献
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al.
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重印与许可
