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通过表皮表型评分鉴定参与气孔发育的基因 via

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DOI：

10.3791/64899

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2023年1月20日

 ,  , 
1Department of Biology, Concordia University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了两种无需使用表皮撕取法的表型分析方法，用于鉴定调控气孔发育的基因。第一种方法展示了如何利用甲苯胺蓝O染色的植物表皮来分析气孔表型。第二种方法描述了如何鉴定气孔配体并监测其生物学活性。

摘要

气孔是陆生植物表面参与气体交换和水蒸气释放的小孔，其功能对植物的生产力和生存至关重要。因此，了解气孔发育和排列模式的机制具有重要的农艺价值。本文介绍了两种利用Arabidopsis子叶的表型分析方法，可用于鉴定调控气孔发育和模式形成的基因。首先介绍的是使用甲苯胺蓝O染色子叶分析气孔表型的操作流程。该方法快速可靠，无需使用表皮剥离技术——后者虽广泛用于表型分析，但需要专门的培训。由于EPF肽含有多个半胱氨酸残基，其生物活性肽的鉴定与合成在气孔发育研究中一直存在挑战。因此，本文其次介绍了一种通过生物测定法鉴定气孔配体并监测其生物活性的实验流程。该方法的主要优势在于能够相对简便地获得可重复的数据，同时减少所需肽溶液的用量以及表征肽在调控气孔模式与发育中作用所需的时间。总体而言，这些设计良好的实验方案提高了研究潜在气孔调控因子的效率，包括那些因具有高度复杂结构而发挥活性的富含半胱氨酸的分泌肽。

引言

气孔在光合作用和蒸腾作用这两个基本生物学过程中的功能依赖于其正确的模式形成和分化，这一过程由EPF肽类信号通路调控。拟南芥中三种分泌型富含半胱氨酸的多肽EPF1、EPF2和STOMAGEN/EPFL9调控气孔发育的不同方面，并被细胞表面受体组分所感知，这些受体包括ERECTA家族受体激酶（ER、ERL1和ERL2）、SERK蛋白以及TMM1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。这种识别随后通过依赖MAPK的途径导致促进气孔分化的转录因子表达下调11。这些核心气孔相关基因的发现主要依赖于对表皮发育缺陷突变体的表型筛选。本文介绍了一些相对简单且高效的表型分析方法，用于观察气孔及其他表皮细胞，这些方法对于鉴定和表征调控气孔模式形成与分化的潜在基因至关重要。

通常通过表皮撕片法观察植物表皮的细微结构，有时结合染料（如甲苯胺蓝O（TBO）或番红）染色进行12,13,14。然而，这些方法的主要挑战在于需要经过专门训练，才能在不撕裂组织的情况下剥离叶片表皮，并在避免采集叶片不同区域图像干扰的前提下，仔细观察和分析表皮模式数据。此外，使用水合氯醛类透明试剂对组织样本进行化学透明处理，也已广泛应用于多种生物材料8,15；此类方法虽能提供高质量图像，从而获得大量表型信息，但同时也需使用危险化学品（如甲醛、水合氯醛）。本文首先介绍一种相对简便且实用的表型分析方法，该方法所获得的图像足以用于定量分析，且样品制备过程中无需使用危险化学品，也无需制备叶片表皮撕片。经TBO染色的子叶表皮还非常适合研究气孔发育，因为子叶缺乏毛状体，且发育梯度较小，有利于对表皮表型进行简单而清晰的解读。

气孔EPF肽属于植物特异性的富含半胱氨酸肽类，这类肽通常具有相对较大的成熟肽段，并在保守的半胱氨酸残基之间形成分子内二硫键。正确的构象折叠对其生物学功能至关重要，但通过化学合成或异源表达系统产生的富含半胱氨酸肽往往无活性，且通常是正确折叠与未折叠肽的混合物3,7,16。因此，筛选在调控气孔发育中起作用的生物活性肽一直是一项极具挑战性的工作。本文还描述了一种生物测定方法，以更有效地鉴定和表征具有生物活性的气孔肽。该方法中，将Arabidopsis幼苗培养在多孔板中，培养基中分别添加或不添加待测肽，培养6–7天。随后使用共聚焦显微镜观察子叶表皮。通常，为了清晰地观察待测肽在气孔发育中的生物学活性，除了使用野生型Arabidopsis（Col-0）作为对照外，还使用产生更多或更少气孔谱系细胞的基因型，例如产生更多表皮细胞的epf2突变体，以及表皮细胞密度降低的STOMAGEN-ami株系2,4,5，用于生物测定。

总体而言，本文介绍的两种方案可用于快速高效地评估多种表皮表型，并可用于筛选在调控气孔模式形成和发育过程中起作用的小肽和激素。

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方案

1. 染色 拟南芥 用TBO染色的子叶

  1. 种子灭菌与生长条件
    1. 在微型离心管中，每种基因型取约30粒 Arabidopsis 种子，加入1 mL种子灭菌液（33%商用漂白剂，0.1% Triton X-100），室温（RT）轻柔振荡10–12分钟进行灭菌。
      注：为获得对照样本，需灭菌约30粒野生型 Arabidopsis 生态型Columbia（Col-0）种子和/或约60粒携带化学诱导型基因的转基因植株种子（例如 Est::EPF27），并将这些转基因 幼苗种植于不含诱导剂（如β-雌二醇）的1/2 Murashige和Skoog（MS）琼脂平板（2.16 g/L，含0.8%琼脂[w/v]）上（图1 和 图2）。
    2. 吸除灭菌液，在超净工作台中用1 mL无菌水洗涤种子四次，然后将种子重悬于约200 μL无菌0.1%琼脂中。
    3. 使用移液器将每种基因型约30粒种子播种于1/2 MS琼脂平板或含诱导剂的1/2 MS琼脂平板（例如含10 µM β-雌二醇）上，以实现转基因（例如 Est::EPF27）的化学诱导，并用微孔胶带密封平板。
      注：播种时需将种子均匀分布于平板上，避免种子过于密集，否则会影响幼苗均匀生长。
    4. 将平板置于4 °C、避光条件下进行3–5天的低温层积处理，以同步种子萌发。
    5. 层积处理后，将平板置于生长室中，在22 °C、光照强度120 µmol·m−2·s−1、光周期16小时光照/8小时黑暗的条件下培养10天。
  2. Arabidopsis 子叶的取样与TBO染色
    1. 萌发后第10天，从平板上选择生长均匀的单株幼苗，用镊子小心取下其中一片子叶，以减少实验变异性。
      注：选择10日龄幼苗的子叶进行取样，因其无毛状体且表皮细胞未成熟，有利于简化表皮表型的解读。
    2. 用镊子将每片子叶放入含有1 mL固定液（乙醇:乙酸 = 9:1）的微型离心管中，室温下至少固定过夜。
      注：样品可在该条件下保存长达数年。 图2E 所示图像即来自在固定液中保存超过3年的子叶样品。子叶切下后应立即放入固定液中，且每管最多放置五片子叶，以确保后续样品处理的均一性。
    3. 吸除固定液，加入1 mL 70%乙醇。轻轻颠倒离心管数次后，室温放置约30分钟。
    4. 使用1 mL 50%乙醇和20%乙醇，重复步骤1.2.3。
    5. 将1 mL 20%乙醇替换为1 mL蒸馏水，轻轻颠倒离心管数次后，室温放置约30分钟。
      注：样品可在蒸馏水中保存超过24小时，但不建议长时间存放，以免影响图像质量（不同表皮细胞类型的染色效果），进而影响定量分析。
    6. 彻底吸除蒸馏水，立即加入约200 μL TBO染色液（0.5% TBO溶于H2O，过滤），染色约2分钟。
      注：染色过程中应轻弹离心管，确保每片子叶样品均匀接触TBO溶液。为防止TBO过度染色（染色时间至关重要，且不同基因型间可能存在差异），每次处理的样品管数不应超过六管。
    7. 尽可能彻底吸除TBO染色液，立即加入1 mL新鲜蒸馏水，洗涤数次。
  3. 成像与数据分析
    1. 取一载玻片，滴加一滴15%甘油（约50 μL）。用精细镊子将子叶（背面朝上）置于载玻片的15%甘油液滴中，然后轻轻加盖盖玻片，确保排除气泡。
    2. 使用明场显微镜对子叶表皮的背面进行成像（图1 和 图2），通过计数气孔及其他表皮细胞类型的数量来分析表皮表型。
    3. 针对每种基因型，使用Jangra等17描述的以下公式计算表皮表型：
      ​气孔指数（%）=（气孔数量 / 表皮细胞总数）× 100
      气孔密度（mm−2）= 气孔数量 / 面积（mm2）
      注：每种基因型至少成像8片子叶（N = 8），并通过与野生型植株和/或未添加诱导剂条件下培养的化学诱导型转基因植株的表型进行比较，记录各基因型的表皮表型。

2. 气孔肽的生物测定方法

注意：生物测定实验的步骤如图3所示。

  1. 种子消毒与培养条件
    1. 按照上述方法对每种处理约25粒种子进行消毒，并在超净工作台中将大约一半的种子分别播种到两块1/2 MS琼脂平板上。
      注意：为便于检测多肽对表皮细胞排列和分化的影响，应使用表皮细胞数量高或低的基因型（例如 epf22），而不是野生型背景（如Col-0）（图4）。
    2. 将种子在4 °C黑暗条件下进行为期3天的春化处理。
    3. 每隔约10小时取出两块平板中的一块，将平板上的种子在22 °C下、光照强度为120 µmol·m−2·s−1、光周期为16小时光照/8小时黑暗的条件下培养1天。
  2. 多肽处理与成像
    1. 在超净工作台中，小心地将每块预处理平板上约10–12株培养1天的 Arabidopsis 幼苗转移至24孔板中，每个孔含有1.5 mL 1/2 MS液体培养基（每孔约20株幼苗）。
      注意：多肽处理的时间对处理后的表型结果至关重要，因此需将种子分别种在两块平板上，以获得两个不同发育阶段的幼苗用于处理。
    2. 向每个含有约20株在1/2 MS琼脂平板上萌发的1日龄 Arabidopsis 幼苗的孔中，加入仅含缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 8.0]）或两种不同浓度的多肽溶液（通常为1 µM和2.5 µM多肽溶于50 mM Tris-HCl [pH 8.0]）。
      注意：从冰箱中取出多肽溶液分装样品后，应在室温下放置数分钟再进行处理。多肽在−80 °C冰箱中可稳定保存数年，但应将多肽溶液分装保存以避免反复冻融。
    3. 用移液器轻轻混匀仅含缓冲液或多肽溶液的幼苗后，用微孔胶带密封24孔板。将检测板置于长日照条件（16小时光周期，光照强度120 µmol·m−2·s−1）下，在22 °C培养5–7天。
      注意：应防止幼苗生长过于密集，以确保每株幼苗均能均匀接触多肽溶液。在将培养板放入生长室前，可轻轻旋转培养板2–3小时以增强通气。
    4. 将每株幼苗从仅含缓冲液或多肽的孔中转移至盖玻片上，解剖幼苗的子叶。用镊子将子叶的远轴面朝上放置，并将其切成小片。
    5. 取另一张洁净的载玻片，滴加一滴碘化丙啶溶液（约25 μL，2 mg/mL溶于H2O）。
    6. 用镊子将一片子叶小片放入碘化丙啶溶液滴中，轻轻盖上盖玻片。在盖玻片边缘补充少量碘化丙啶溶液，以去除形成的气泡。
    7. 使用共聚焦显微镜观察子叶远轴面，并将图像与仅在含缓冲液的1/2 MS培养基中生长的幼苗图像进行比较。
      注意：图4中所示图像来自仅用缓冲液处理的野生型Col-0或 epf22,5 幼苗（图4A、B），或两批EPF2多肽溶液处理的幼苗（图4C–F），这些样品在−80 °C保存超过1年。

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结果

多种已知气孔密度较低或较高且存在簇集现象的气孔转基因植株和突变体（epf22,5、epf1 epf22,5、tmm12、一条STOMAGEN基因沉默的株系4，以及携带雌二醇诱导型Est::EPF1或Est::EPF2过表达载体的转基因株系7）被用于验证本文所介绍的两种表型分析方法的有效性，这些方法旨在鉴定和表征在气孔发育与模式形成中起作用的基因。为了在无需表皮剥离的情况下获得高质量的表皮图像，以定量分析不同类型表皮细胞，针对每种基因型预先优化TBO染色时间至关重要，因为不同基因型的表皮表型可能与野生型对照（Col-0）存在差异（

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讨论

本文介绍的两种用于鉴定和表征控制气孔模式形成及分化的基因的表型分析方法，是便捷且可靠的检测手段。这些实验方案无需使用表皮撕片和特殊设备（此类方法耗时较长，且样品制备需要专门培训），但仍可获得高质量图像，用于表皮表型的定量分析。

该技术在使用TBO染色进行表型分析时存在局限性 拟南芥 子叶的一个特点是，要获得具有不同表皮细胞类型视觉对比度的高质量图像，依赖于染色时间以及组织的特有特性，这些特性可能因物种和基因型而异（图1)18其他利用表皮剥离观察表皮细胞的表型分析方法面临相同的挑战，且通常需要更长的时间和专门的培训。为避免难以获得适合数据分析的充分染色表皮图像，可对气孔较少基因型的子叶延长染色时间，而对气孔较多基因型的样本缩短染色时间。此外，可通过先检测少量样本，针对具有相似表皮表型的基因型优化染色时间，进而调整每种基因型的最佳染色时长。

获得足量正确折叠的生物活性肽，尤其是富含半胱氨酸的肽（这类肽是调控...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）发现计划和康考迪亚大学资助。K.B. 获得印度国家海外奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
18 mm x 18 mm 盖玻片VWR16004-326
带盖的24孔无菌板VWRCA62406-183
3M 微孔手术胶带Fisher Scientific19-027-761用于密封 MS 培养基平板的微孔外科手术纸胶带
76 x 26 mm 显微镜载玻片TLGGEW90-2575-03
乙酸， ≥99.8% Fisher ScientificA38-212
琼脂BioShopAGR001.1
漂白家用漂白剂（例如，Clorox）
共聚焦显微镜 尼康 尼康C2（由NIS-Elements操控） 
乙醇格林菲尔德P210EAAN
FIJI开源(Fiji 就是) ImageJ v2.1/1.5.3j从 https://imagej.net/software/fiji/ 下载
镊子Sigma-AldrichF6521 
甘博格维生素混合物Cassson 实验室GBL01-100ML4°C 保存 °C
甘油Fisher ScientificG33-4
生长室Conviron model E1516小时光照周期，设定为21°C，光照强度为120 µ摩尔·m-2·s-1.
光照HD Supply25272荧光  生长室中的灯光，Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K 
微量离心管Fisher Scientific14-222-155用于对拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子进行消毒的试管
显微镜 Nikon配备 DsRi2 数字相机的 Nikon Eclipse TiE 显微镜
Murashige 和 Skoog 基本盐 Cassson 实验室MSP01-1LT4°C 保存 °C
培养皿 100 mm × 20 mm Fisher Scientific08-757-11Z用于培养拟南芥的倒入MS培养基的培养皿
碘化丙啶 VWR39139-064
手术刀Fisher Scientific08-916-5A
蔗糖BioShopSUC700.5
甲苯胺蓝 OSigma-AldrichT3260-5G
Tris 碱Sigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-100ML
β雌二醇Sigma-AldrichE2758

参考文献

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