气孔发育相关基因的鉴定 通过 表皮表型评分

摘要

本文介绍了两种无需使用表皮撕取法的表型分析方法，用于鉴定调控气孔发育的基因。第一种方法展示了如何利用甲苯胺蓝O染色的植物表皮来分析气孔表型。第二种方法描述了如何鉴定气孔配体并监测其生物学活性。

摘要

气孔是陆生植物表面参与气体交换和水蒸气释放的小孔，其功能对植物的生产力和生存至关重要。因此，了解气孔发育和分布模式的机制具有重要的农艺价值。本文描述了两种利用表型分析的方法 拟南芥 可用于鉴定调控气孔发育与排列模式的基因的子叶。首先介绍利用甲苯胺蓝O染色子叶分析气孔表型的方法。该方法快速可靠，无需使用表皮剥离技术——尽管表皮剥离广泛用于表型分析，但需要专门的培训。由于EPF肽含有多个半胱氨酸残基，其生物活性肽的鉴定与合成在气孔发育研究中一直具有挑战性。因此，其次介绍一种通过生物测定法鉴定气孔配体并监测其生物活性的实验流程。该方法的主要优势在于能够相对简便地获得可重复的数据，同时减少所需肽溶液的用量以及表征肽在调控气孔排列与发育中功能所需的时间。总体而言，这些精心设计的实验方案提高了研究潜在气孔调控因子的效率，包括那些因具有高度复杂结构而发挥活性的富含半胱氨酸的分泌肽。

引言

气孔在植物中的正确模式形成和分化对其在光合作用和蒸腾作用这两个基本生物学过程中的功能至关重要，这一过程由EPF肽类信号通路调控。在Arabidopsis中，三种分泌型富含半胱氨酸的多肽EPF1、EPF2和STOMAGEN/EPFL9调控气孔发育的不同方面，并被细胞表面受体组分所感知，这些组分包括ERECTA家族受体激酶（ER、ERL1和ERL2）、SERKs以及TMM^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10}。这种识别随后通过依赖MAPK的途径导致促进气孔分化的转录因子表达下调¹¹。这些核心气孔相关基因的发现主要依赖于对表皮发育缺陷突变体的表型筛选。本文介绍了一些相对简单且高效的表型分析方法，用于观察气孔及其他表皮细胞，这些方法对于鉴定和表征调控气孔模式形成与分化的潜在基因至关重要。

观察植物表皮的细微结构通常采用表皮撕取法，可结合或不结合染色处理，例如使用甲苯胺蓝O（TBO）或番红染料进行染色^12,13,14。然而，这些方法的主要挑战在于需要经过专门培训才能在不撕裂组织的情况下剥离叶片表皮，并且在观察和分析表皮模式数据时需谨慎操作，避免因采集自叶片不同区域的图像而引入误差。此外，使用水合氯醛等透明化试剂对组织样本进行化学透明处理也已被广泛应用于多种生物材料^8,15；此类方法虽能提供高质量图像，从而获得丰富的表型信息，但同时也需使用危险化学品（如甲醛、水合氯醛）。本文首先介绍一种相对简便且实用的表型分析方法，该方法所获得的图像足以满足定量分析需求，且在样品制备过程中无需使用危险化学品，也无需进行叶片表皮撕取。经TBO染色的子叶表皮还特别适用于气孔发育研究，因为子叶缺乏毛状体，且发育梯度较小，有利于对表皮表型进行简单而清晰的解读。

气孔EPF肽属于植物特异性的富含半胱氨酸肽类，其成熟肽相对较大，并在保守的半胱氨酸残基之间形成分子内二硫键。正确的构象折叠对其生物学功能至关重要，但通过化学合成或异源重组系统产生的富含半胱氨酸肽可能无活性，且通常是正确折叠与未折叠肽的混合物。^3,7,16因此，筛选在调控气孔发育中起作用的生物活性肽一直是一项极具挑战性的任务。本文还描述了一种生物测定方法，以更有效地鉴定和表征具有生物活性的气孔肽。该方法中， 拟南芥 幼苗在含有潜在多肽或不含潜在多肽的培养基中，于多孔板内培养6至7天。随后，利用共聚焦显微镜观察子叶表皮。通常情况下，为了清晰地观察潜在多肽在气孔发育中的生物学活性，可选用那些产生较多或较少气孔谱系细胞的基因型，例如 epf2 突变体，该突变体产生更多的表皮细胞，以及 STOMAGEN-ami 细胞密度降低的表皮细胞系^2,4,5，除野生型外还被使用 拟南芥 对照（Col-0）用于生物测定。

总体而言，本文介绍的两种方案可用于快速高效地评估多种表皮表型，并筛选在调控气孔模式形成和发育过程中起作用的小肽和激素。

方案

1. 染色 拟南芥 用TBO染色的子叶

1. 种子灭菌与生长条件
   1. 灭菌约30 拟南芥 将每种基因型的种子放入微量离心管中，加入1 mL种子消毒液（33%商用次氯酸钠溶液，0.1% Triton X-100），于室温（RT）轻轻振荡处理10–12分钟。
      注意：将约30粒野生型种子灭菌 拟南芥 生态型哥伦比亚（Col-0）和/或携带化学诱导型基因的转基因植株种子约60粒（例如 Est::EPF2⁷) 使用转基因 在不含诱导剂（如 β-estradiol）的 1/2 Murashige 和 Skoog (MS) 平板（2.16 g/L，含 0.8% 琼脂 [w/v]）上生长的幼苗作为对照图1 和 图2).
   2. 移除消毒液，在超净工作台中用1 mL无菌水洗涤种子4次，并将种子重悬于约200 μL的无菌0.1%琼脂中。
   3. 每种基因型在1/2 MS琼脂平板或含诱导剂（如10 µM β-雌二醇）的1/2 MS琼脂平板上播种约30粒种子，用于化学诱导转基因表达（例如 Est::EPF2⁷使用移液器加入，并用微孔胶带密封。
      注意：种子需均匀分布在培养皿上，避免相互靠近，以防幼苗生长不均。
   4. 将培养皿置于4 °C、无光照条件下3-5天，对种子进行层积处理以同步萌发。
   5. 层积处理后，将培养皿置于生长室中，在22 °C、120 µmol·m⁻²·s⁻¹光照强度下，16小时光照/8小时黑暗光周期条件下培养⁻²·s⁻¹ 光照周期为每天16小时光照、8小时黑暗，持续10天。
2. 采样与TBO染色 拟南芥 子叶
   1. 在萌发后第10天，从培养皿中生长状况与其他幼苗一致的个体幼苗上，仔细选择并切下一片子叶，以减少变异。
      注意：子叶取自10日龄的幼苗，因其不含表皮毛且表皮细胞未成熟，这有助于简化对表皮表型的解读。
   2. 用镊子将每片子叶放入含有1 mL固定液（乙醇与冰醋酸比例为9:1）的微量离心管中，样品至少在室温下固定过夜。
      注意：样品在此条件下可保存数年。图像 图2E 从保存在固定液中超过3年的子叶样品中提取。切割后应立即将子叶放入固定液中，并确保每个微量离心管中放置的子叶不超过5片，以利于后续均一的样品制备。
   3. 移除固定液，加入1 mL 70%乙醇。将管子颠倒数次后，于室温下静置约30分钟。
   4. 使用1 mL 50%乙醇，然后使用20%乙醇，重复步骤1.2.3。
   5. 将1 mL 20%乙醇替换为1 mL蒸馏水，然后将含有子叶样品的离心管颠倒数次，静置约30分钟。
      注意：样品可在蒸馏水中保存超过24小时，但不建议如此操作，以免影响定量分析所需的高质量图像（不同类型表皮细胞的良好染色图像）。
   6. 将管中的蒸馏水全部移除，然后立即加入约 200 μL 的 TBO 染色液（0.5% TBO 溶于 H₂O，过滤）约 2 分钟。
      注意：孵育期间应轻轻弹动试管，确保每份子叶样品均匀接触TBO溶液。为防止TBO染色过度（染色时间至关重要，且不同基因型间可能存在差异），每次处理的样品管数不应超过六管。
   7. 尽可能彻底地去除TBO染色液，然后立即加入1 mL新鲜蒸馏水洗涤样品数次。
3. 成像与数据分析
   1. 取一张显微镜载玻片，加入一滴15%甘油（约50 μL）。用精细镊子将子叶的远轴面朝上放置于载玻片的15%甘油中。然后轻轻盖上盖玻片，使样品中形成的气泡得以排除。
   2. 使用明场显微镜观察子叶表皮的远轴面图1 和 图2），然后通过统计气孔及其他表皮细胞类型的数量来观察表皮表型。
   3. 对于每种基因型，使用 Jangra 等人描述的以下公式计算表皮表型。¹⁷:
      ​气孔指数（%）=（气孔数量 / 表皮细胞总数）× 100
      气孔密度（mm⁻²) = 气孔数量/面积（mm²)
      注意：每种基因型至少观察八片子叶（N = 8），并通过与野生型植株和/或未添加诱导剂条件下培养的化学诱导型转基因植株的表型进行比较，记录每种基因型的表皮表型。

2. 气孔肽的生物测定方法

注意：生物测定实验的步骤如图3所示。

1. 种子消毒与生长条件
   1. 对每种处理组约25粒种子按上述方法进行表面灭菌，然后在超净工作台中将每组约一半的种子分别接种到两块1/2 MS琼脂培养基平板上。
      注意：使用表皮细胞数量高和/或低的基因型（例如， epf2²）而不是使用野生型背景（例如，Col-0），以便于检测肽对表皮细胞模式形成和分化中的生物学活性图 4).
   2. 在4 °C黑暗条件下对种子进行3天的分层处理。
   3. 每隔约10小时取出两块培养板，将种子置于22 °C、120 µmol·m⁻²·s⁻¹光照条件下培养⁻²·s⁻¹ 光照周期为16小时光照、8小时黑暗，持续1天。
2. 多肽处理与成像
   1. 在超净工作台中，小心移植10-12只一日龄的 拟南芥 将两个制备好的平板中的幼苗分别转移至含有1.5 mL 1/2 MS液体培养基的24孔板中（每孔约20株幼苗）。
      注意：肽处理幼苗的时间对其表型结果至关重要，因此需将种子分别接种于两块培养板上，以获得两种不同发育阶段的幼苗用于处理。
   2. 向每个含有约20只一日龄果蝇的孔中加入缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 8.0]）或两种不同浓度的肽溶液（通常为1 µM和2.5 µM肽溶于50 mM Tris-HCl [pH 8.0]） 拟南芥 在1/2 MS琼脂平板上萌发的幼苗
      注意：从冷冻箱中取出肽溶液分装样品，在处理前于室温放置数分钟。在−80 °C 冷冻保存的肽溶液可稳定存放数年，但应将肽溶液分装成小份储存，以避免反复冻融循环。
   3. 轻轻混匀幼苗与缓冲液或肽溶液后，用微孔胶带密封培养板。将检测板置于长日照条件下（16小时光周期，120 µmol·m⁻²·s⁻¹光照强度）培养。⁻²·s⁻¹ 在22 °C下光照培养5-7天。
      注意：避免幼苗生长过于密集，以确保每株幼苗均能均匀接触肽溶液。在将培养皿放入生长室培养前，轻轻旋转培养皿2-3小时，以增强通气。
   4. 将每株幼苗从含有缓冲液或肽溶液的孔中转移至盖玻片上，解剖幼苗的子叶。用镊子将子叶的远轴面朝上放置，并将其切成小块。
   5. 取另一张干净的显微镜载玻片，滴加一滴碘化丙啶溶液（约 25 μL，2 mg/mL，溶于 H₂O)
   6. 用镊子将一片子叶小块放入一滴碘化丙啶溶液中，轻轻盖上盖玻片。在盖玻片边缘添加额外的碘化丙啶溶液，以去除形成的气泡。
   7. 使用共聚焦显微镜观察子叶远轴面，并将图像与在仅含缓冲液的1/2 MS培养基中生长的幼苗图像进行比较。
      注意：本文中展示的图像均来自 图4 来自野生型Col-0或 epf2^2,5 仅用缓冲液处理的幼苗（图4A，B）或两批EPF2肽溶液（图4C- F) 并在 -80 °C 下保存超过 1 年。

结果

多种已知气孔密度较低或较高且存在簇集现象的气孔转基因植株和突变体（epf2^2,5、epf1 epf2^2,5、tmm¹²、一个STOMAGEN基因沉默株系⁴，以及携带雌二醇诱导型Est::EPF1或Est::EPF2过表达载体的转基因株系⁷）被用于验证本文所介绍的两种表型分析方法的有效性，这些方法旨在鉴定和表征在气孔发育与模式形成中起作用的基因。为了在无需表皮剥离的情况下获得高质量的表皮图像，以定量分析不同类型表皮细胞，关键步骤是针对每种基因型预先优化TBO染色时间，因为不同基因型的表皮表型可能与野生型对照（Col-0）存在差异（

讨论

本文介绍的两种用于鉴定和表征控制气孔排列与分化基因的表型分析方法，是便捷且可靠的检测手段。这些实验方案无需使用表皮撕片和特殊设备（此类方法耗时较长，且需要专门的样品制备培训），但仍可获得高质量图像，用于表皮表型的定量分析。

该技术在使用TBO染色进行表型分析时存在局限性 拟南芥 子叶的一个特点是，要获得具有不同表皮细胞类型视觉对比度的高质量图像，依赖于染色时间以及组织自身的独特特性，这些特性可能因物种和基因型而异（图1)¹⁸其他利用表皮撕取法观察表皮细胞的表型分析方法面临相同的挑战，且通常需要更长的时间和专门的培训。为避免难以获得适合数据分析的充分染色表皮图像，可对气孔较少基因型的子叶延长染色时间，而对气孔较多基因型的样本缩短染色时间。此外，可通过先检测少量样本，针对具有相似表皮表型的基因型优化染色时间，进而调整每种基因型的最佳染色时长。

获得足量正确折叠的生物活性肽，尤其是富含半胱氨酸的肽（这类肽是调...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18 mm x 18 mm 盖玻片	VWR	16004-326
带盖 24 孔无菌板	VWR	CA62406-183
3M 微孔手术胶带	Fisher Scientific	19-027-761	用于密封 MS 板的微孔手术纸胶带
76 x 26 mm 显微镜载玻片	TLG	GEW90-2575-03
乙酸、 ≥99.8%	Fisher Scientific	A38-212
琼脂	BioShop	AGR001.1
Bleech	家用漂白剂（例如，Clorox）
共聚焦显微镜	尼康		NIS-Elements 运营的尼康 C2
乙醇	绿地	P210EAAN
斐济	开盘	（斐济只是） ImageJ v2.1/1.5.3j	下载自 https://imagej.net/software/fiji/
镊子	Sigma-Aldrich	F6521
Gamborg 的维生素混合物	Cassson Labs	GBL01-100ML	储存在 4 °C
甘油	Fisher Scientific	G33-4
生长室	Conviron， 型号 E15		16h 光周期，设置为 21°C 光强为 120 µmol·m-2·s-1。
Lights	HD Supply	25272	荧光灯  生长室中的灯，Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K
微量离心管	Fisher Scientific	14-222-155	放置拟南芥种子进行消毒的试管
显微镜	尼康		Nikon Eclipse TiE 配备 DsRi2 数码相机
Murashige 和 Skoog 基础盐	Cassson Labs	MSP01-1LT	商店位于 4 °C
培养皿 100 mm x 20 mm	Fisher Scientific	08-757-11Z	培养皿中倒入 MS 培养基以培养拟南芥
化丙啶	VWR	39139-064
手术刀	Fisher Scientific	08-916-5A
蔗糖	BioShop	SUC700.5
甲苯胺蓝 O	Sigma-Aldrich	T3260-5G
Tris 碱	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML
β-雌二醇	Sigma-Aldrich	E2758