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光诱导介电泳法表征人源间充质干细胞电学行为

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DOI：

10.3791/64909

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2023年6月16日

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1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 2Department of Biomedical Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 3Department of Chemistry, School of Physical Sciences, University of California, Irvine, 4Sue & Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine

本文内容

摘要

本文介绍了光诱导介电泳作为一种无标记方法，用于表征异质性细胞系，特别是人源间充质干细胞（hMSCs）。该论文描述了一种利用含光敏导电层的微流控装置来表征hMSCs电学行为的实验方案，并对其使用和优化过程进行了说明，且无需改变细胞的天然状态。

摘要

人类间充质干细胞（hMSCs）可作为源自患者的细胞来源，用于开展疾病机制研究或多种治疗应用。近年来，了解hMSC的特性（例如其在不同成熟阶段的电学行为）变得愈发重要。介电电泳（DEP）是一种可在非均匀电场中操控细胞的方法，借此可获取有关细胞电学特性的信息，如细胞膜电容和介电常数。传统的DEP模式采用金属电极（如三维电极）来表征细胞对DEP的响应。本文介绍了一种基于光导层构建的微流控装置，该装置能够通过光投影形成虚拟电极来操控细胞 原位 具有易于适形几何结构的虚拟电极。本文介绍了一种用于表征人骨髓间充质干细胞（hMSCs）的光诱导介电泳（LiDEP）现象的实验方案。我们显示，通过调节输入电压、光照的波长范围以及光源强度等参数，可优化由LiDEP诱导的细胞响应（以细胞运动速度衡量）。未来，我们预期该平台有望推动实现无需标记、可对hMSCs或其他干细胞系的异质群体进行实时表征的技术发展。 关键词：虚拟电极，光诱导介电泳（LiDEP），人骨髓间充质干细胞（hMSCs），细胞速度，无标记检测，实时表征，异质细胞群体

引言

人源间充质干细胞（hMSCs）因其免疫抑制特性而被公认1，这使得它们被用于多种疾病的治疗，例如II型糖尿病2移植物抗宿主病3以及肝脏疾病4人骨髓间充质干细胞（HMSCs）具有异质性，包含可分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞的细胞亚群。HMSCs 可来源于脂肪组织、脐带组织和骨髓，其分化潜能取决于组织来源及所采用的细胞培养过程。5例如，根据Sakaguchi等人的研究，来源于脂肪组织的人间充质干细胞（hMSCs）更倾向于分化为脂肪细胞，而来源于骨髓的人间充质干细胞则更倾向于分化为成骨细胞。6然而，人源间充质干细胞（hMSCs）的组织来源对其分化潜能的影响仍是一个需要进一步阐明的现象。此外，hMSCs之间分化潜能的差异导致了其固有的异质性，这为hMSCs在治疗中的应用带来了挑战。因此，对异质性干细胞群体进行表征和分选，对于开发 体外 以及这些细胞的临床应用。流式细胞术是分析细胞表型差异的金标准技术，该技术利用细胞表面抗原和荧光染料标记目标细胞，并根据光散射特性或细胞特异性荧光特征对其进行表征6,7,8该方法的缺点包括细胞表面抗原生物标志物的种类有限、仪器设备及操作成本较高，以及细胞表面染色可能对细胞膜造成损伤，从而影响其治疗应用。9,10,11因此，探索在不破坏细胞膜天然状态的前提下对细胞进行表征的新技术，有望提升干细胞治疗的临床效果。

介电电泳（DEP）是一种无需使用表面标记物的细胞表征方法，也是本研究的重点。DEP 是一种无标记或非染色的方法，可在微流控平台上实施，通过细胞的电学特性对异质性细胞群体进行表征。DEP 采用交流电（AC）电场替代荧光染色（即基于标记的方法）7。使用基于 DEP 的微流控装置进行细胞表征的其他优势还包括：所需样品体积小（微升级）、分析时间短、细胞样本前处理要求低、样品污染风险小、废料产生少以及成本低12,13。DEP 的另一优势在于能够对细胞进行实时监测14,15,16。在 DEP 过程中，悬浮状态的细胞暴露于由电极产生的非均匀交流电场中，并因此发生极化6。这种极化导致细胞运动，并可根据所施加交流电场的频率和电压实现对细胞的操控。通过调节频率（通常在 5 kHz 至 20 MHz 范围内），可使细胞被吸引至电极或被排斥远离电极，分别对应正向和负向 DEP 行为6。

介电泳（DEP）表征具有多种模式，根据其电极构型和/或操作策略可分为传统模式、场流分离模式以及光诱导模式17。3DEP分析仪属于传统的DEP模式，其采用物理金属电极，并监测细胞对交流电场的响应。该系统使用一种包含微孔阵列和多个三维环形电极的芯片，通过检测光强度的变化来表征细胞的介电泳行为18,19,20,21。当细胞在微孔壁的引导下向环形电极边缘移动时，微孔中心区域的光强度增加，表现为正介电泳现象；而当细胞聚集在微孔中心、远离环形电极时，微孔中心区域的光强度降低，表现为负介电泳现象。这两种现象在图1中有所展示。传统DEP方法能够表征异质性细胞群体的电学特性18,20,21。例如，Mulhall等人利用3DEP分析仪，基于细胞膜电容的差异，成功区分了正常口腔角质形成细胞（HOK）与恶性口腔角质形成细胞（H357）细胞系21。然而，传统DEP模式的一个局限性在于其电极几何结构是固定的。由于人源间充质干细胞（hMSCs）具有异质性，在进行DEP评估时若能灵活调整电极几何构型将具有显著优势。例如，能够在实时条件下修改电极或电极阵列以实现单细胞捕获，从而根据细胞的运动速度和介电泳行为对其进行表征。在hMSCs的DEP评估中应用实时电极调控技术，可在从组织样本中分离出hMSCs后立即开展单细胞分析，进而表征样本细胞群体的异质性。

为了克服传统介电泳（DEP）模式（即固定物理电极）的局限性，并探索利用DEP现象实时修改电极构型的新机会，研究人员已开始研究光诱导介电泳（LiDEP）。LiDEP是一种非传统的DEP模式，通过光导微流控装置结合光投影来操控细胞22,23 via ，局域化电极产生非均匀电场，其原理与传统DEP方法类似。该方法还允许电极几何形状的灵活设计以及在微流控装置内移动电极，从而克服了固定电极的局限性，为研究细胞异质性提供了更多可能性。LiDEP已被用于检测和分析同质及异质细胞群体中的不同类型细胞22,23,24。例如，Liao等人利用LiDEP将不表达上皮细胞黏附分子（EpCAMneg）的循环肿瘤细胞（CTCs）从红细胞中分离出来，以探究其在癌症转移中的意义22。基于LiDEP的单细胞分析已成功用于表征和操控具有胰腺致瘤性分层特征的癌细胞23，以及分析转移前后样本中的CTCs24。

本文介绍了如何利用LiDEP，通过多种电极几何形状（圆形、菱形、星形和平行线）以及系统设置（施加电压、光强度和微流控装置材料）来操控hMSCs，从而提供了一种使用虚拟电极表征人源性干细胞行为的方法。

方案

1. LiDEP 微流控装置的制备

注意：制造过程包括组合三个分层组件：（i）在氧化铟锡（ITO）玻璃基板上沉积非晶硅（A:Si）和钼形成的光敏层；（ii）从双面胶带切割而成的微通道层；（iii）顶部带有进样口和出样口钻孔的ITO玻璃基板，用于细胞悬液的流入与流出。

  1. 光导氧化铟锡（ITO）玻璃镀膜
    1. 用氮气（N2）吹拂表面，清洁镀有ITO的玻璃基底（电阻为15-20 Ω），气流速度应足以吹走可见的灰尘颗粒。此步骤完成后，用丙酮冲洗基底。
    2. 将镀有ITO的玻璃片转移至异丙醇浴中，以去除残留的丙酮，再用去离子水（DI水）冲洗，然后再次用N2气体吹干，直至基底完全干燥。
    3. 将玻璃片放置于真空溅射系统中，ITO镀层朝上。
    4. 使用钼靶材，在ITO玻璃基底上溅射沉积一层厚度为10 nm的钼薄膜，沉积速率为0.7 Å/s，沉积时间为140 s。
    5. 在玻璃基底的一侧添加遮蔽掩模，使靠近玻璃边缘2 mm的区域未被覆盖，以便进行电连接。采用电感耦合等离子体增强化学气相沉积（ICP-PECVD）方法沉积1 µm厚的非晶硅（A:Si），具体方法如Medjdoub等25所述。
    6. 用N2气体清洁玻璃片，以去除灰尘和其他杂质。对于沉积在遮蔽掩模下方的A:Si，将玻璃边缘浸入25% w/v的氢氧化钾溶液中，直至2 mm标记处，以刻蚀去除A:Si。
  2. LiDEP芯片器件制备
    1. 为形成微通道，取双面胶带（52 mm × 25 mm），在短边方向距边缘5-6 mm处打孔（直径 = 4 mm），孔位位于长边之间的中心位置。使用手术刀在孔之间切割两条直线，间距为3 mm。在整个微通道切割过程中，确保双面胶带两面的保护膜均保持原位。
    2. 在顶部ITO玻璃片上钻两个直径为3 mm的孔。可将胶带对齐放置在ITO玻璃片上，使胶带的长边与玻璃片的长边对齐。用可擦记号笔标记打孔位置。确保钻孔位置与双面胶带上打好的孔对齐。这两个孔将作为微流控装置的进样口和出样口。
    3. 撕去双面胶带一侧的保护膜，将胶带上的孔与顶部ITO玻璃片上的孔对齐后压合。轻轻按压以排除气泡，尤其是在微通道附近。气泡可能导致培养基或其他溶液渗入胶带下方，从而损坏微流控装置或导致霉变。
    4. 撕去双面胶带另一侧的保护膜，将其压合到镀有钼和A:Si的ITO玻璃面。将光导材料侧玻璃片上与2 mm未镀区相对的边缘，对齐至双面胶带朝向顶部ITO玻璃片中心的一侧。此时顶部ITO玻璃片和镀有光导材料的ITO玻璃片将有部分悬出。
    5. 在平坦表面上按压，以确保良好粘附。玻璃基底与双面胶带层的示意图见图1A。剪去侧面多余的胶带。
    6. 在A层和C层边缘贴上铜胶带，以连接函数发生器。具体操作为：根据是A层还是C层，将铜胶带从双面胶带边缘包裹至ITO或光导材料侧面，并延伸约3 cm至玻璃基底的未镀层一侧。
    7. 为确保器件成功制备，使用万用表检测玻璃基底上各镀层与所贴铜胶带之间的电阻是否导通。
  3. 介电泳（DEP）缓冲液配制
    1. 称取4.25 g蔗糖，放入50 mL锥形管中。再称取0.15 g葡萄糖，加入同一50 mL锥形管中。
    2. 向锥形管中加入25 mL超纯水，盖紧盖子并混合。当约一半的蔗糖和葡萄糖溶解后，继续加入超纯水至50 mL刻度线，剧烈震荡直至所有蔗糖和葡萄糖完全溶解。DEP缓冲液终浓度为8.5%（w/v）蔗糖和0.3%（w/v）葡萄糖。
    3. 取20 mL上述配制的蔗糖-葡萄糖溶液，转移至另一50 mL锥形管中。称取0.1 g牛血清白蛋白（BSA），加入该锥形管中。涡旋振荡至BSA完全溶解。最终DEP缓冲液含0.5%（w/v）BSA。
  4. 细胞准备
    1. 根据前期研究中描述的细胞培养方案26,27，获取至少1 × 106个细胞（hMSCs或HEK 293），悬浮于1 mL生长培养基中。将细胞悬液转移至10 mL离心管中。
    2. 将HEK 293细胞以201 × g离心5分钟，hMSCs以290 × g离心10分钟。离心后吸除上清液，并将细胞重悬于1 mL含0.5% BSA的DEP缓冲液中。注意加入缓冲液时速度不宜过快，以免产生气泡。
    3. 重复离心步骤两次，最后将细胞重悬于含0.5% BSA的DEP缓冲液中，用于LiDEP表征。上述细胞制备方案可满足10次实验使用。例如，一次频率测试至少需要15 次重复，因此需制备2 mL细胞悬液，浓度为1 × 106个细胞/mL。

2. LiDEP 表征

  1. 实验装置
    1. 组装以下设备以建立用于量化细胞对 LiDEP 反应的实验装置：一台笔记本电脑、一台投影仪、一个物镜、一台数字显微镜和一个信号发生器。使用笔记本电脑设计光投影图案（星形、菱形、三条线和椭圆形），并将其连接至投影仪。
    2. 使用投影仪作为光源，将光投射到LiDEP芯片的光导表面（C层）。设置光路，使光源（投影仪）发出的光通过10倍物镜照射到LiDEP芯片的微通道区域。10倍物镜置于投影仪镜头上方。 补充图1 展示了投影仪与LiDEP系统的集成。
    3. 将LiDEP芯片连接至函数发生器以施加交流电场。使用数字显微镜观察受LiDEP力作用的细胞，并进行成像和视频记录。 图1B 显示实验装置的示意图。遵循标准的细胞培养操作规程26,27 针对所有测试的细胞。
  2. 实验步骤
    1. 用70%乙醇冲洗微通道，随后用0.5% BSA溶液冲洗。再用0.5% BSA溶液重复冲洗微通道两次，以确保乙醇及先前的细胞被彻底洗去。已暴露于介电泳（DEP）场的细胞与新鲜细胞的反应不同，可能干扰数据采集。
    2. 用移液器移除0.5% BSA溶液，并将微流控装置安装到装置固定架中。
    3. 将鳄鱼夹连接到设备上铜箔的各个接点处。将函数发生器设置为所需的电压（峰峰值电压，Vpp）和频率（Hz）。此处测试的频率范围为 30 kHz 至 20 MHz。
    4. 将70 µL细胞悬液（细胞 + 含0.5% BSA的DEP缓冲液）加入装置的微通道中。由于微通道较薄（约0.05 mm），液体可能会从入口和出口孔溢出。为减少溢出量，建议使用较小的移液枪头，并将枪头在孔内略微倾斜朝向微通道方向。任何多余的溶液（0.5% BSA或含细胞的溶液）可用一次性纸巾擦拭，并丢弃至生物危害废物容器中。
    5. 将所需的虚拟电极几何形状（此处为圆形、菱形、星形和/或平行线）投射到 LiDEP 芯片上。
    6. 在数字显微镜软件中，将视频录制时长设置为 3 min。将实验室计时器设定为 2 min 30 s。当细胞在 LiDEP 芯片的微通道中静止后，按下 开始 在数字显微镜软件中开始视频录制过程。
    7. 等待10秒，然后按下 开启 函数发生器通道输出按钮以施加交流电场，并按下 开始 设置计时器。通过数字显微镜监测细胞的介电泳（DEP）行为，并防止装置周围发生晃动或移动。
    8. 计时器响起后，按下 开启 关闭函数发生器通道输出按钮，以关闭函数发生器通道输出，从而停止通过电极施加交流电场。在3分钟时停止视频录制，并将视频保存至数码显微镜，以供后续分析。
    9. 用移液器将细胞从LiDEP芯片出口端移出，通过缓慢向微通道中推入60 µL含0.5% BSA的DEP缓冲液，同时在出口端收集。持续操作直至微通道中几乎无或无细胞残留。
    10. 重复步骤 2.2.3 至 2.2.9，直至所有频率均完成测试。

结果

电压和电极颜色测试采用上述步骤进行，仅在步骤2.2.3和步骤2.2.10中略有调整。在电压测试中，电极颜色和频率保持不变，分别施加5 Vpp、10 Vpp和20 Vpp的电压。在电极颜色测试中，施加的电压和频率固定为30 kHz和20 Vpp，并考察了蓝色、红色、白色和黄色（分别对应HEX颜色代码#4472C4、#FF0000、#FFFFFF和#FFFF00）投射的电极。通过台盼蓝染色后使用血细胞计数板对活细胞和死细胞数量进行计数，以评估细胞活力。

利用LiDEP装置，我们能够操控hMSCs并根据输入频率生成介电泳（DEP）响应曲线，这是表征细胞电学行为的一种方法。通过一系列实验，调节施加电压和投影电极颜色（即使用图形编辑软件创建的不同颜色的形状）等参数，以观察细胞在虚拟电极产生的非均匀交流电场下的稳定行为，从而确定最佳工作条件。将使用LiDEP（非传统介电泳）获得的细胞响应数据与3DEP分析仪（传统介电泳）的实验结果进行了比较。

首次优化实验聚焦于LiDEP芯片中hMSCs的正向介电泳响应（即细胞向虚拟电极移动）。未表现出正向介电泳响应的细胞要么表现出负向介电泳响应（远离虚拟电极移动），要么保持静止并旋转，或对电场无反应。通过ImageJ软件在2分30秒的时间段内追踪细胞运动速度（µm/s）来量化细胞响应。实验采用黄色椭圆投影作为虚拟电极，在固定频率30 kHz下测试了5 Vpp、10 Vpp和20 Vpp的施加电压。为保证一致性并减少异常值，仅分析在交流电场开启期间位于虚拟电极50 µm范围内的细胞。HEK 293细胞在20 Vpp下表现出最快的移动速度，平均速度为0.035 µm/s，其次为10 Vpp下的0.032 µm/s和5 Vpp下的0.020 µm/s，表明这些细胞具有相对均一的对照特性。hMSCs也呈现类似趋势，在20 Vpp下的平均速度为0.051 µm/s，10 Vpp下为0.036 µm/s，5 Vpp下为0.025 µm/s，如图2A所示（其中*表示p < 0.05）。在20 Vpp条件下，观察到hMSCs同时表现出正向和负向介电泳现象，而在10 Vpp和5 Vpp条件下未观察到此现象。经历介电泳力作用后hMSCs的活力检测结果显示，较高电压通常导致细胞活力降低：5 Vpp下细胞活力为66%，10 Vpp下为58%，20 Vpp下为57%，如图2B所示（其中**表示p < 0.01）。

由于LiDEP是一种基于光学的系统，光强和电极颜色是可轻松调节以控制LiDEP芯片性能的参数。本研究中，通过投影不同形状生成了不同颜色的电极（白色、黄色、红色和蓝色），以评估其对细胞介电泳（DEP）响应的影响。实验在20 Vpp和30 kHz条件下对HEK 293细胞和hMSCs进行了评估。选择了白色、黄色、红色和蓝色的电极，但LiDEP芯片中的光电导层呈红橙色，影响了光照效果。因此，投影出的白色电极呈现为黄色外缘、白色内部，红色电极呈现为橙色主体、红色轮廓，而蓝色电极则呈现为浅绿色（图3A-D）。这四种颜色对应的光功率输出分别为：白色77.7 µW ± 0.7 µW，黄色92.7 µW ± 1.3 µW，红色21.9 µW ± 0.2 µW，蓝色56.7 µW ± 0.9 µW。这强烈表明，黄色和白色电极产生的DEP场最强，而蓝色和红色较弱，如图3E所示（其中，***表示HEK 293细胞的p < 0.001，**表示hMSCs的p < 0.01）。在施加DEP力的过程中，还观察到细胞在黄色和白色虚拟电极边缘发生静止旋转现象。对于所有电极颜色变化，均同时出现了负向和正向DEP响应，这与电压测试中20 Vpp条件下的结果一致。此外，尽管细胞运动速度随电极颜色而异，但在50 µm边界内的几乎所有细胞均对LiDEP产生响应。测得hMSCs的细胞大小为19.2 µm ± 5.8 µm。

为了评估LiDEP与传统电极DEP相比的性能，我们比较了使用LiDEP的细胞与通过3DEP分析仪分析的细胞之间的介电泳（DEP）行为差异。在低电导率DEP缓冲液（含0.5% BSA，约100 µS/cm）中测量了人骨髓间充质干细胞（hMSCs）的DEP响应。为模拟3DEP分析仪的条件，投射了一个单椭圆形黄色虚拟电极，电压为10 Vpp。hMSCs的DEP行为在30 kHz至20 MHz频率范围内进行了表征。在低于25 kHz的频率下，观察到电解现象，导致微流控装置内金属层表面产生气泡。在LiDEP中，低频时hMSCs表现出正向DEP力，如图4A所示，以被吸引至虚拟电极的细胞百分比表示。细胞最初表现出较强的正向DEP力，随着频率升高，该作用力逐渐减弱。在30 kHz至97 kHz频率范围内，细胞所受的正向DEP力最强。在施加这些频率的交流电场后，部分细胞失去响应，而另一些细胞则表现出负向DEP行为。这一趋势与使用3DEP分析仪测得的结果不同：在37 kHz至255 kHz范围内，细胞的正向DEP增强；而在1,772 kHz至20 MHz范围内，正向DEP减弱，如图4B所示。

微流控装置示意图及介电泳实验设置；分层玻璃、铜胶带、形状图像。
图1：本文所述用于人骨髓间充质干细胞（hMSCs）的光诱导介电泳（LiDEP）实验装置。（A）具有光敏层的LiDEP芯片及其实验装置的示意图与实物图。（B）细胞在3DEP分析仪中正负介电泳响应的代表性图像（使用传统介电泳电极，上方），以及使用LiDEP技术时细胞正负介电泳响应的示意图（利用光投影作为虚拟电极，下方）。（C）可投影到装置上作为虚拟电极的不同形状示例。图由BioRender.com绘制。请点击此处查看此图的放大版本。

流速与电压关系图；存活率与电压关系图；统计分析，生物学研究结果。
图 2：在给定条件下，人骨髓间充质干细胞（hMSCs）介电泳（DEP）响应（流速）特性及其存活率。（A）hMSCs 对 5 Vpp、10 Vpp 和 20 Vpp 的正向介电泳响应所测得的流速。在 20 Vpp 时，hMSCs 的移动速度为 0.051 µm/s；在 10 Vpp 时为 0.036 µm/s；在 5 Vpp 时为 0.025 µm/s。（B）hMSCs 在经历由虚拟电极产生的正向介电泳力作用后的存活率。在 20 Vpp、10 Vpp 和 5 Vpp 条件下的存活率分别为 57%、58% 和 66%。误差线表示标准差（SD）。对合并的数据集进行统计分析，采用 t 检验（*p < 0.05，**p < 0.01）。请点击此处查看该图的放大版本。

电极颜色对细胞速度的影响；包含彩色显微图像和速度柱状图。
图3：比较均质（HEK 293）与异质（hMSCs）细胞系的介电泳（DEP）响应。 hMSCs细胞在20 Vpp和30 kHz条件下对（A）白色、（B）黄色、（C）红色和（D）蓝色电极的正向介电泳响应。（E）HEK 293细胞和hMSCs对不同颜色电极的速度响应。HEK 293细胞在黄色和红色电极下表现出最高速度，分别为0.035 µm/s和0.033 µm/s；在蓝色电极下速度最低，为0.027 µm/s。hMSCs在黄色和白色电极下速度最高，分别为0.068 µm/s和0.049 µm/s；在红色电极下速度最低，为0.039 µm/s。误差线表示标准差（SD）。对合并的数据集进行t检验统计分析（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。请点击此处查看该图的放大版本。

介电泳频率响应曲线；实验数据；正介电泳百分比随频率的变化。
图 4：使用 LiDEP 和 3DEP 比较 hMSCs 的介电泳响应。在 10 Vpp 条件下测得的 hMSCs 介电泳响应，分别使用 (A) LiDEP 和 (B) 3DEP 分析仪。在 LiDEP 中，hMSCs 的正介电泳响应从 30 kHz 到 20 MHz 逐渐衰减。而在 3DEP 分析仪中，细胞的正介电泳响应从 37 kHz 增加至 255 kHz，随后从 1,772 kHz 到 20 MHz 逐渐下降。误差线表示标准差（SD）。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：本实验方案所用LiDEP装置的代表性图像。 LiDEP系统的放大图，显示了投影仪的集成。光源（投影仪）发出的光通过10倍物镜照射到LiDEP芯片的微通道上。10倍物镜位于投影仪镜头上方。图中每个组件均标有编号，并在侧边列出。请点击此处下载该文件。

补充视频1：hMSCs对白色、黄色、红色和蓝色虚拟电极响应的代表性视频。 细胞表现出正介电泳现象（向虚拟电极移动）、负介电泳现象（远离虚拟电极）、静止并旋转，或对电场无响应。hMSCs在37 kHz和20 Vpp条件下进行测试，视频加速20倍。 请点击此处下载该文件。

讨论

研究hMSCs的异质性对其在治疗领域的应用进展具有重要意义。本研究为将LiDEP用作hMSCs分析工具提供了初步基础。我们通过量化细胞运动速度，考察了LiDEP中细胞正向介电泳（DEP）响应的电压依赖性。理论上，较高的电压应产生更强的正向DEP力，实验测得的速度变化趋势也证实了这一点。10 Vpp和20 Vpp的电压足以有效操控hMSCs。较低的电压（如5 Vpp）导致细胞响应较慢；虽然对hMSCs而言并非最优，但可能对其他细胞类型具有优势。实验中观察到hMSCs的存活率随电压升高而下降约9%。这一结果与以往文献报道略有不同6,12,28,29，此前研究中采用传统DEP或LiDEP检测生物细胞时并未发现细胞存活率下降。然而，各研究的实验目的存在差异。Glasser和Fuhr在细胞培养基中监测了贴壁生长的L929小鼠成纤维细胞在金属电极上的增殖情况28；而Lu等人则研究了神经干细胞在不同时间暴露于交流电场后的存活率12。Adams等人利用金属电极表征了hMSCs的介电特性12，Li等人则使用LiDEP操控白血病细胞29。与这些研究相比，本研究使用了BSA，这可能是导致观察到存活率下降的原因。此外，整体存活率的降低也可能与本实验所采用的暴露时间（2分30秒）有关。该时间设定旨在确保在非均匀交流电场作用期间有足够时间观察细胞的操控过程。

细胞表征方法已进行测试 通过 根据本方案所述构建的LiDEP系统的电极颜色，以确定该系统的性能与局限性。在本方案中，电极颜色可通过图形编辑文件中投射图形的颜色进行控制。我们使用了四种颜色：白色、黄色、红色和蓝色。根据每种颜色的功率输出读数，投射为黄色（#FFFF00）和白色（#FFFFFF）的电极测得的光强更高，因此在后续实验中优先选用这两种颜色。此外，由于光导材料的光强依赖性已得到证实30,31结果表明，LiDEP 器件的性能依赖于光电导非晶硅（A:Si），并通过投射电极颜色的选择进行调节。使用 LiDEP 还观察到 hMSCs 同时出现正向和负向介电泳（DEP）响应，这一现象与传统 DEP 方法中观察到的现象类似。在每种电极颜色下，hMSCs 均经历了负向 DEP 力、正向 DEP 力以及细胞旋转，表明在单一频率下细胞样本具有异质性补充视频 1这与Adams等人发现的结果一致。6 hMSC在单一频率下同时表现出负向和正向介电泳行为。这些条件（电极颜色、电极形状和光导材料）可为检测hMSC样本中异质性程度提供额外参数。

最后，将LiDEP评估结果与3DEP分析仪的结果进行比较，以作为hMSC介电泳行为的基准。观察到hMSC在正向介电泳响应频率范围上存在差异，但所收集数据的趋势一致。 通过 LiDEP 与 3DEP 分析仪的整体表现相似（即正向介电泳响应随频率升高而降低）。当交流电场施加至 LiDEP 芯片并同时在其上投射光照时，光照区域内的电导率下降，从而形成非均匀电场。因此，光源的特性（即光强与波长）会影响细胞在 LiDEP 芯片中的预期响应，这一点从电压及电极颜色变化实验的结果中可见。其他可调节的参数包括光电导层的材料以及介电泳缓冲液的电导率。因此，评估细胞介电泳行为所采用的条件必须基于 LiDEP 系统的具体配置进行考量。相比之下，在使用金属电极施加介电泳力的 3DEP 分析仪或其他传统方法中，电极特性是固定的，无法即时调整以适应待测细胞的需求。这种正向介电泳行为的可调性可能对未来研究 hMSC 样本中不同类型细胞的表征、单细胞分析或细胞分选具有重要意义。此外，随着细胞远离虚拟电极，交流电场强度逐渐减弱。然而，在使用金属电极的 3DEP 分析仪或其他传统介电泳模式中，可施加更大范围的电场，从而实现对更多细胞的同时操控。因此，在 LiDEP 实验中，较少数量的细胞会受到微通道内交流电场的影响。进一步的差异可能源于设备随时间推移（即 2 小时或 3 小时）性能的变化，该现象仍在研究中。持续流动的水、乙醇和介电泳缓冲液可能破坏微通道层表面（即光电导材料），这一点需予以考虑。对于单个 LiDEP 芯片的长期使用，设备在时间进程中的细胞表征性能也需纳入考量。实验参数的实时调整仅需数秒至数分钟即可完成。通过图形编辑软件中的设置，可即时调节电极颜色与几何构型。

总之，本文展示了介电泳液滴平台（LiDEP）在操控和表征具有异质细胞群体的细胞系（如人骨髓间充质干细胞，hMSCs）方面的应用能力。通过该实验装置及所述操作流程，我们成功在20 V条件下实现了对hMSCs的有效表征。pp 以及投射的虚拟黄色电极。未来的研究应着重于调整hMSCs暴露于交流电场的时间 通过 LiDEP，通过增强虚拟电极的光强度，并评估不同来源的人类间充质干细胞（或其他干细胞群体），以建立异质性干细胞群体电学特征的LiDEP图谱。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得美国国家科学基金会CAREER奖（2048221）资助 通过 CBET。我们希望感谢加州大学欧文分校集成纳米系统研究设施（INRF）的 Mo Kebaili。此外，我们还要感谢 Devin Keck 博士在 LiDEP 系统开发过程中提供的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTAGibco25300054
10倍物镜AmScope---
非晶硅（A:Si）Millipore SigmaS5130
抗生素-抗真菌剂（100倍浓度）Gibco15240-062
牛血清白蛋白（BSA）FisherBP9706-100
铜箔胶带ZehheBF4964
葡萄糖（右旋糖）FisherD16-1
数码显微镜KeyenceVHX-7000
双面胶带InsulectroFLX000484
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）Gibco14190-144
胎牛血清（FBS）Corning35-011-CV
函数发生器TektronixAFG 31102
图形编辑软件Microsoft Office Powerpoint---
氧化铟锡（ITO）镀膜玻璃片MSE SuppliedGL0333
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺ATCCPCS-999-034
笔记本电脑DellInspiron 14, 2-in-1
间充质干细胞基础培养基ATCCPCS-500-030
脐带及脂肪来源间充质干细胞生长试剂盒ATCCPCS-500-040
最低必需培养基α（MEM α，1倍浓度）GibcoA10490-01
钼，99.95%Kurt J. LeskerEJTMOXX352A4溅射靶材
酚红SigmaP5530
功率计Thor LabsS130VC/PM400
投影仪Vecupoi---
罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640 培养基Gibco11875-093该培养基含有 L-谷氨酰胺和酚红。
蔗糖FisherBP220-1
台盼蓝染液Gibco15250-0610.40%
胰蛋白酶中和液GibcoR002100
真空溅射系统DentonDV-502M

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