TACI：用于三维钙成像分析的 ImageJ 插件

摘要

钙成像的TrackMate分析（TACI）是一款开源的ImageJ插件，用于3D钙成像分析，可检测z轴方向的运动，并识别每个z层堆栈的最大值，以表示细胞在相应时间点的强度。该插件能够分离在横向（x/y方向）重叠但位于不同z平面的神经元。

摘要

神经科学研究已发展到使用复杂的成像和计算工具，从数据集中提取全面的信息。钙成像是一种广泛应用的技术，需要借助复杂的软件才能获得可靠的结果，但许多实验室在更新方案以符合现代标准时，难以采用计算方法。这一困难主要源于缺乏编程知识以及软件的付费壁垒。此外，在进行钙成像过程中，目标细胞会在各个方向上发生移动。目前已开发出多种方法用于校正横向（x/y方向）的运动。

本文介绍了一种利用新型 ImageJ 插件——钙成像轨迹分析工具（TrackMate Analysis of Calcium Imaging, TACI）来研究三维钙成像中 z 轴方向运动的工作流程。该软件可识别神经元在所有 z 层面中出现时的最大荧光值，并以此代表该神经元在相应时间点（t 位置）的强度。因此，该工具能够区分在横向（x/y 方向）上重叠但位于不同 z 层面的神经元。 作为 ImageJ 插件，TACI 是一种用户友好、开源的三维钙成像分析计算工具。我们通过果蝇幼虫的温度敏感神经元验证了该工作流程，这些神经元在温度变化过程中表现出各个方向的运动，并结合从果蝇脑部获取的三维钙成像数据集进行了验证。

引言

细胞内钙离子水平是神经元兴奋性的精确指标。钙成像通过检测细胞内钙离子浓度的变化来研究神经元活动¹。随着细胞内钙浓度检测技术的发展，包括基因编码钙指示剂（GECIs）如GCamp^2,3可通过遗传学方法在特定神经元群体中实现无创表达，钙成像在神经科学研究中的应用日益广泛。激光器和显微镜组件成本的降低也进一步推动了钙成像技术的使用⁴。尤为重要的是，钙成像能够在自由活动的动物中同时记录和研究单个神经元以及大规模神经元群体的活动⁵。

然而，钙成像数据分析具有挑战性，原因在于：（1）需要追踪单个细胞随时间变化的荧光信号；（2）由于神经元活动的影响，荧光信号会间歇性地消失或重新出现；（3）神经元可能在各个方向上移动，特别是进出焦平面或出现在多个焦平面上^4,6。手动分析耗时较长，且随着记录时长和神经元数量的增加，变得难以实施。目前已开发出多种软件程序以加快钙成像数据分析的进程。过去开发的软件通常局限于特定实验条件，导致其他实验室难以采用。近年来，为满足现代软件共享标准，已涌现出若干可在不同研究团队间一致分析钙成像数据的工具^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19}。然而，这些工具大多需要编程知识和/或依赖商业软件。缺乏编程能力以及软件使用门槛限制了研究人员对这些方法的采纳。此外，许多现有工具主要关注x/y方向的运动校正，而z轴方向的运动同样需要被明确识别并加以校正⁶。目前亟需一种能够分析三维钙成像数据的计算工具，特别针对存在z轴漂移并在多个z平面上出现的神经元。理想情况下，该工具应基于开源软件，并且无需编程知识，以便其他实验室能够便捷地采用。

本文中，我们开发了一款新的 ImageJ 插件 TACI，用于分析三维钙成像数据。首先，该软件根据 z 轴位置对三维钙成像数据进行重命名（如需要）和组织。在每个 z 位置上追踪目标细胞，并通过 TrackMate 或其他计算工具提取其荧光强度。随后应用 TACI 分析细胞在 z 轴方向上的运动情况。该插件可识别 z 层切片中的最大值，并以此代表细胞在相应时间点的强度。该工作流程适用于分析在各个方向上存在运动，和/或在横向（x/y 方向）重叠但出现在不同 z 位置的神经元的三维钙成像数据。为验证该工作流程的有效性，我们使用了果蝇幼虫温敏神经元以及脑内蘑菇体神经元的三维钙成像数据集。值得注意的是，TACI 是一款开源的 ImageJ 插件，无需任何编程知识即可使用。

方案

1. 钙成像

1. 果蝇幼虫准备
   注意：果蝇及幼虫在 12 h:12 h 光照:黑暗循环条件下，于 25 °C 恒温培养。
   1. 使用 CO₂ 麻醉果蝇。将 20–45 只雄蝇和 20–45 只雌蝇分选至每个果蝇培养瓶中，并使其至少恢复 24 至 48 小时，以消除 CO₂ 暴露的影响。
      注意：果蝇暴露于 CO₂ 的时间应尽可能短。
   2. 为同步幼虫发育年龄，将果蝇轻敲转移至含有酵母颗粒的新培养瓶中，让其产卵 4–8 小时，随后通过翻转方式将成虫移出至新的培养瓶中。
   3. 使用 10 mL 的 20% w/v 蔗糖溶液收集 72 小时龄的幼虫。
2. 显微镜与温度控制装置设置
   1. 在共聚焦显微镜（参见材料表）上进行成像，使用配备 z 轴压电载物台及载物台插入件的系统，设置如下：激光器：氩离子；扫描模式：帧扫描；帧尺寸：512 × 512；扫描速度：最大；通道/位深：1/8 位；缩放倍数：1.5；z 轴层扫：切片数 = 15，保留 = 切片；聚焦装置与策略：Definite Focus；聚焦功能：开启 Definite Focus。
   2. 使用导热硅脂将帕尔帖（Peltier）制冷模块固定于散热片上，构建热电冷却装置。帕尔帖模块由 2 A 电源供电。
   3. 将热电偶微探头连接至数据采集设备，用于记录温度。
3. 钙离子成像
   1. 用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗幼虫 3 次。
   2. 用移液器将 75 μL 的 1× PBS 滴加至载玻片中央。
   3. 将一至两条幼虫置于 1× PBS 中，并将热电偶微探头放置在幼虫附近。
      注意：幼虫与微探头之间的距离应约为 5 mm。若微探头距离过近，可能导致幼虫移动；距离过远则可能导致温度读数不准确。
   4. 用盖玻片覆盖幼虫和热电偶微探头，并用指甲油密封盖玻片边缘。
   5. 将载玻片置于显微镜载物台上，使用 25 倍物镜调焦，随后将热电冷却装置放置于载玻片上。
      注意：帕尔帖模块应直接放置在载玻片上幼虫所在位置，以施加温度刺激。
   6. 在共聚焦软件中对目标荧光细胞进行聚焦。调节激光功率以避免信号过饱和。在 z 层扫设置中设定首层与末层位置。
      ​注意：记录前应使用尽可能低的激光功率，以防止荧光漂白。
   7. 同时启动 z 层扫成像和温度记录。
   8. 通过控制为帕尔帖模块供电的电源来调节其表面温度。开启电源以降低温度，关闭电源则使温度回升。
   9. 停止 z 层扫成像和温度记录。

2. 三维钙成像数据的分析

1. 将钙成像数据导出为TIFF文件，并保存在与TIFF文件基名相同的文件夹中。
   注意：文件名 不得包含任何逗号.
   1. 使用以下参数从 ZEN（黑版）导出钙成像数据： 文件类型，TIFF；压缩方式，LZW；通道，2；Z轴位置，全部；时间点，全部；相位，1；区域，完整.
2. 安装
   1. 从 GitHub 下载 TACI-Calcium_Imaging.jar（https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases）。
   2. 在 FIJI 中通过点击安装插件 插件 在 菜单栏 然后点击 安装 在下拉菜单中（插件 | 安装）。然后，重新启动 FIJI。
      注意：请 非 使用 插件 | 安装插件.
   3. 单击以运行插件 插件 然后选择 TACI-钙成像 (插件 | TACI-钙成像).
3. 使用 重命名 将TIFF文件名转换为所需结构的函数。
   注意：该工具默认采用 filename_h#t#z#c#.tif 的文件名结构（其中 h# 和 c# 为可选项；#：正整数）。如果图像文件名不符合默认结构，则 重命名 必须执行该功能。
   1. 点击以选择需要重命名 TIFF 图像的文件夹 浏览文件夹.
   2. 填写参数信息。列出五个参数，包括 文件名, 相, 最大 T 位点, 最大Z轴位置，以及 通道每个参数包含三个数值： 前文，参数值，以及 订购.
      注意：该信息是 区分大小写. 如果图像文件名包含 参数前的短语，填写短语作为 前文 相应参数。如果图像文件名包含一个 所有参数之后的短语，填写短语作为 后文本.
      1. 务必输入 文件名, 最大 T 位点，以及 最大Z轴位置 且该参数值对于 最大 T 位点 和 最大Z轴位置 包括 所有手指.
      2. 等待 文件名 使用文件夹名称自动填充。
      3. 如果TIFF文件名不包含相位和通道信息，请将相应的参数值留空，并选择 Na 在 订购.
   3. 点击 重命名 创建一个同名文件夹，并在名称末尾添加 _r。注意，该文件夹中的 TIFF 文件名已被重新组织，以兼容后续处理 组织 功能。
      注意：TIFF 图像的文件名中已添加 _r。
4. 使用 组织 用于将同一 z 位置的 TIFF 图像保存到一个文件夹中的函数。
   注意：文件夹名称必须包含 同名 作为 TIFF 文件内部的基本名称 且必须 没有逗号.
   1. 点击以选择需要整理TIFF图像的文件夹 浏览文件夹.
   2. 如果参数 CSV 文件（param.csv）存在，请等待参数值自动填充完毕。
      注意：param.csv 文件具有规定的格式。参数（包括 filename、phase、position_t、position_z、channel 和 is_gray）必须从 A 列开始从左至右依次填写在第 1 行。每个参数对应的值必须填写在第 2 行。
   3. 如果参数 CSV 文件（param.csv）不存在，则需手动填写参数值。确保参数值的 相 和 通道 包括 信件，而参数值 T 位置 和 Z 轴位置 应该是 最大数量 t-和z-位置。如果图像文件名不包含相位或通道信息，请输入 Na.
   4. 必要时创建灰度 TIFF 图像。保留该复选框 图像是灰度的吗？ 取消选中以将图像转换为灰度。
   5. 点击 组织 创建一个同名文件夹，并在其中创建名为 _gray_stacks 的文件夹，同时生成以相同名称命名并附加 _#（#：z 轴位置）的子文件夹。注意观察 TIFF 文件已按 z 轴位置被分类至相应的文件夹中，并生成了一个名为 param.csv 的文件，其中包含参数及其对应值。
5. 使用 FIJI 中的 TrackMate 从每个 z 位置提取目标细胞的荧光强度。
   注意：此步骤也可通过其他成像软件完成。
   1. 使用 FIJI 打开 z 位置文件夹中的 TIFF 图像。
   2. 单击以运行 TrackMate 插件 | 追踪 | TrackMate，并在必要时调整以下参数。
      1. 使用 DoG 或 LoG 检测器.
      2. 改变 斑点直径，阈值，以及 中值滤波器调整 斑点直径 与细胞的直径相似。如果细胞呈椭圆形，则调整 斑点直径 与短轴相似。
         注意：增加 阈值 有助于避免背景噪音被误认为信号，同时不影响信号强度（补充图1）。然而，增加 阈值 可能会遗漏真实信号（补充图1）。如果信号较强，请使用 中值滤波器 以减少椒盐噪声。
      3. 设置滤波器以去除部分或全部无关信号。 筛选 X 和 Y 是空间滤波器。使用 滤光片 X 和 Y 去除远离真实信号的无关信号。
         注意：当对一幅图像设置滤镜时，必须检查所有其他图像，以确保真实信号未被去除。
      4. 设置 连接最大距离，闭合间隙的最大距离，以及 闭合间隙的最大帧间隔. 设置 连接最大距离 和 间隙闭合最大距离 是 3至5倍的斑点直径，尤其是在样本随时间发生显著移动时，有助于减少轨迹数量。设置 填补间隙的最大帧间隔 到 图像堆栈中的图像数量.
      5. 将感兴趣区域（ROI）的荧光强度导出为 CSV 文件。如果使用的是旧版 TrackMate，请选择 导出所有斑点统计数据 在 选择一个操作 窗口。如果 TrackMate 版本为 7.6.1 或更高版本，请选择 斑点 在 显示选项 将交互式文件导出或另存为 CSV 文件。
         注意：这两个文件均与图像窗口交互；高亮某个感兴趣区域（ROI）时，图像窗口中会显示相应的 ROI。这些文件包含对应时间点（POSITION_T）下目标细胞的平均强度值（MEAN_INTENSITY 或 MEAN_INTENSITY_CH1）。相同的 TRACK_ID 应代表不同时间点下的同一 ROI。然而，此对应关系并非始终准确，必要时需手动校正。若 TrackMate 未能识别某些时间点的 ROI，则这些时间点将不会被显示。
6. 提取背景荧光强度，并创建 Background_list.csv 文件。
   注意：在本研究中，每个 z 位置的背景强度是通过计算 3 至 5 个不含荧光信号、大小相同且来自不同时间点的邻近区域的平均值来估算的。
   1. Background_list.csv 文件具有规定的格式：每一列包含一个神经元的信息，从 Neuron 0 开始。在第 1 行填写神经元编号，例如 Neuron 0。然后，为每个分析的 z 平面位置提供背景强度值——如果对 Neuron 0 分析了五个 z 平面位置，则在 Neuron 0 下方填写五个背景强度值。
      注意：TACI 需要 Background_list.csv 文件 提取 功能。如果背景信号可忽略，则必须提供包含每个神经元零背景强度的 Background_list.csv 文件。
7. 使用 提取 用于识别每个 t 位置的最大荧光强度并计算 ΔF/F₀ 如公式(1).
       (1)
   1. 创建一个文件夹，并以神经元编号命名，从 Neuron 0 开始。将包含相应神经元荧光信息的 CSV 文件保存在该文件夹中。每个 CSV 文件包含一个 z 位置的信息，因此 CSV 文件的数量等于所分析的 z 位置数量。将 CSV 文件命名为 Mean_Intensity#.csv（# 代表 z 位置），每个 CSV 文件至少包含两列：POSITION_T 和 MEAN_INTENSITY 或 MEAN_INTENSITY_CH1。
      注意：为每个感兴趣的细胞创建一个文件夹。
   2. 将步骤 2.7.1 中生成的 Background_list.csv 文件和文件夹保存到同一个文件夹中。通过单击选择此文件夹 浏览文件.
      注意：Background_list.csv 文件中的背景值数量必须与每个神经元的 Mean_Intensity#.csv 文件数量相匹配。
   3. 背景文件将自动填充。请填写t位点的最大数量 T位点数量.
   4. 点击 提取 创建一个结果文件夹，包含每个神经元的 CSV 文件和图表。CSV 文件包括最大荧光强度和 ΔF/F 的信息₀ 在每个 t 位置。图表为 ΔF/F 的线形图₀ 超过 t-位点。
      注意：本研究中，ΔF/F₀ 使用公式（1）。每个 z 位置的第一个值用作 F₀。如果此 F₀ 不适用²⁰插件提供文件，包括 python_files 文件夹中每个神经元的原始数据。
8. 使用 融合 用于计算每个神经元的 ΔF/F 平均值的函数₀，计算标准误（SEM），并绘制平均 ΔF/F 图₀ 超过 t-位点。
   1. 选择由 提取 通过点击来实现功能 浏览文件.
   2. 填写 T位点数量 t位点数量最多。
   3. 点击 合并 创建一个 merged_data 文件夹，其中包含一个 merged_data.csv 文件和一个 Average_dF_F0.png 图像。CSV 文件包含平均值和标准误（SEM）ΔF/F 的信息₀ 在每个 t 位置。该图是平均 ΔF/F 的线形图₀ 超过 t-位点。

结果

三维钙成像分析的工作流程
在本研究中，我们开发了一款新的 ImageJ 插件 TACI，并描述了一种用于追踪 z 轴漂移和分析三维钙成像数据的工作流程，该流程可精确定位在多个 z 轴位置中出现的单个细胞的响应（图1）。该工具包含四个功能：重命名（RENAME）、整理（ORGANIZE）、提取（EXTRACT） 和 合并（MERGE）。首先，如果图像名称与 ORGANIZE 功能不兼容，则可使用 RENAME 功能将图像名称转换为所需的结构。接着，ORGANIZE 功能会将三维钙成像的 TIFF 数据按 z 轴位置进行灰度化（如需要）并分类整理，来自相同 z 轴位置的图像将被保存在同一文件夹中。随后，可使用不同的图像分析工具检测并追踪各 z 轴位置中的感兴趣区域（ROIs），并提取其随时间变化的荧光强度。...

讨论

本研究开发了一种新的 ImageJ 插件 TACI，并描述了用于分析三维钙成像的流程。目前许多可用的工具主要关注 x/y 方向的运动校正，然而 z 轴方向的运动同样需要明确诊断或校正⁶。在活体生物中进行图像采集时，即使生物体已被固定，z 轴方向的移动仍不可避免；而某些刺激（如温度变化）常常引起显著的 z 轴漂移。增加 z 层叠的高度可确保在整个成像过程中记录到目标细胞；然而，分析 z 轴方向的运动并非易事，尤其是当单个细胞在多个 z 位置出现时。如果忽略此类运动，研究人员将无法获得这些细胞精确的钙信号响应。TACI 通过提取每个 z 位置的荧光信号来校正 z 轴漂移。TACI 的关键步骤是提取每个时间点的最大值，并用其代表细胞的强度。因此，在整个成像过程中包含目标细胞的所有 z 位置至关重要。此外，我们建议确保一个细胞至少出现在五个或更多的 z 位置，以避免 z 距离和 z 位置影响最大值的准确性（补充图 2A,B）。此外，TACI 还能够分离在横向（x/y 方向）重叠但出现在不同 z 位置的细胞。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钝头填充针	BD	303129
二水合氯化钙	Fisher Scientific	10035-04-8	果蝇食物成分
二氧化碳	Airgas	UN1013	200号高压钢瓶
CO2 气泡发生器套件	Genesee	59-180
共聚焦显微镜 LSM880	Zeiss	4109002107876000	配备5个激光器、2个标准PMT检测器、32通道GaAsP检测器、Airyscan检测器和Definite Focus.2的倒置Axio Observer Z1显微镜。
DAQami软件	Measurement Computing
葡萄糖	Genesee	62-113	果蝇食物成分
果蝇琼脂	Genesee	66-111	果蝇食物成分
乙醇	Decon Labs, Inc.	64-17-5	果蝇食物成分
果蝇品系：Ir21a-Gal4	Dr. Paul Garrity 实验室		馈赠品
果蝇品系：Ir21a-Gal80	Dr. Lina Ni 实验室
果蝇品系：Ir68a-Gal4	Dr. Aravinthan DT Samuel 实验室		馈赠品
果蝇品系：Ir93a-Gal4	Dr. Paul Garrity 实验室		馈赠品
果蝇品系：UAS-GCaMP6	Bloomington 果蝇品系中心	42750
Flypad	Genesee	59-114
通用锻造黄铜减压阀	Gentec	G152
Gibco PBS pH 7.4 (1x)	Thermo Fisher Scientific	10010-031
绿色果蝇导管	Genesee	59-124
导热化合物	MG Chemicals	860-60G
散热片	Digi-Key Electronics	ATS2193-ND	裁剪至12.9 x 5.5 cm
照明器	AmScope	LED-6W
失活干酵母	Genesee	62-108	果蝇食物成分
培养箱	Pervical	DR-41VL	光暗周期：12小时光照:12小时黑暗；温度：25 °C；湿度：40-50% RH。
对羟基苯甲酸甲酯	Thermo Scientific	126965000	果蝇食物成分
显微盖玻片	VWR	48382-126	22 x 40 mm
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-544-2	25 x 75 x 1.0 mm
指甲油	Kleancolor
窄型果蝇培养管	Genesee	32-113RL
物镜	Zeiss	420852-9871-000	LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27
帕尔贴制冷模块	TE Technology	TE-127-1.0-0.8	30 x 30 mm
塞子	Genesee	49-102
电源	Circuit Specialists	CSI1802X	10伏直流2.0安线性台式电源
Princeton艺术家画笔Nepture	Princeton Artist Brush Co.		系列4750，2号
四水合酒石酸钠钾	Thermo Scientific	033241-36	果蝇食物成分
载物台插件	Wienecke and Sinske	432339-9030-000
体视显微镜	Olympus	SZ61	任何体视显微镜均可使用
T型接头	Genesee	59-123
热电偶数据采集设备	Measurement Computing	USB-2001-TC	单通道
热电偶微探针	Physitemp	IT-24P
黄色玉米粉	Genesee	62-101	果蝇食物成分
Z轴压电载物台	Wienecke and Sinske	432339-9000-000