钙成像的TrackMate分析（TACI）是一款开源的ImageJ插件，用于3D钙成像分析，可检测z轴方向的运动，并识别每个z层堆栈的最大值，以表示细胞在相应时间点的强度。该插件能够分离在横向（x/y方向）重叠但位于不同z平面的神经元。
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本文内容
摘要
摘要
神经科学研究已发展到使用复杂的成像和计算工具，从数据集中提取全面的信息。钙成像是一种广泛应用的技术，需要借助复杂的软件才能获得可靠的结果，但许多实验室在更新方案以符合现代标准时，难以采用计算方法。这一困难主要源于缺乏编程知识以及软件的付费壁垒。此外，在进行钙成像过程中，目标细胞会在各个方向上发生移动。目前已开发出多种方法用于校正横向（x/y方向）的运动。
本文介绍了一种利用新型 ImageJ 插件——钙成像轨迹分析工具（TrackMate Analysis of Calcium Imaging, TACI）来研究三维钙成像中 z 轴方向运动的工作流程。该软件可识别神经元在所有 z 层面中出现时的最大荧光值，并以此代表该神经元在相应时间点（t 位置）的强度。因此，该工具能够区分在横向（x/y 方向）上重叠但位于不同 z 层面的神经元。 作为 ImageJ 插件，TACI 是一种用户友好、开源的三维钙成像分析计算工具。我们通过果蝇幼虫的温度敏感神经元验证了该工作流程，这些神经元在温度变化过程中表现出各个方向的运动，并结合从果蝇脑部获取的三维钙成像数据集进行了验证。
引言
细胞内钙离子水平是神经元兴奋性的精确指标。钙成像通过检测细胞内钙离子浓度的变化来研究神经元活动1。随着细胞内钙浓度检测技术的发展，包括基因编码钙指示剂（GECIs）如GCamp2,3可通过遗传学方法在特定神经元群体中实现无创表达，钙成像在神经科学研究中的应用日益广泛。激光器和显微镜组件成本的降低也进一步推动了钙成像技术的使用4。尤为重要的是，钙成像能够在自由活动的动物中同时记录和研究单个神经元以及大规模神经元群体的活动5。
然而，钙成像数据分析具有挑战性，原因在于：（1）需要追踪单个细胞随时间变化的荧光信号；（2）由于神经元活动的影响，荧光信号会间歇性地消失或重新出现；（3）神经元可能在各个方向上移动，特别是进出焦平面或出现在多个焦平面上4,6。手动分析耗时较长，且随着记录时长和神经元数量的增加，变得难以实施。目前已开发出多种软件程序以加快钙成像数据分析的进程。过去开发的软件通常局限于特定实验条件，导致其他实验室难以采用。近年来，为满足现代软件共享标准，已涌现出若干可在不同研究团队间一致分析钙成像数据的....
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方案
1. 钙成像
- 果蝇幼虫准备
注意：果蝇及幼虫在 12 h:12 h 明暗循环条件下，于 25 °C 环境中培养。- 用 CO2 麻醉果蝇。将 20–45 只雄蝇和 20–45 只雌蝇分装至每支果蝇培养管中，使其至少恢复 24–48 小时，以从 CO2 暴露中恢复。
注意：果蝇暴露于 CO2 的时间应尽可能短。 - 为同步幼虫年龄，将果蝇轻敲转移至含有酵母颗粒的新培养管中，让其产卵 4–8 小时，随后通过翻转移除果蝇。
- 使用 10 mL 20% w/v 蔗糖溶液收集 72 小时龄的幼虫。
- 用 CO2 麻醉果蝇。将 20–45 只雄蝇和 20–45 只雌蝇分装至每支果蝇培养管中，使其至少恢复 24–48 小时，以从 CO2 暴露中恢复。
- 显微镜与温度控制装置设置
- 在共聚焦显微镜（参见材料表）上进行成像，使用配备 z 轴压电载物台及载物台插件的系统，设置如下：激光器：氩离子；扫描模式：帧扫描；帧大小：512 × 512；扫描速度：最大；通道/位深度：1/8 位；缩放倍数：1.5；z 轴层叠：切片数 = 15，保留 = 切片；聚焦装置与策略：定焦；聚焦：开启定焦功能。
- 使用导热化合物将帕尔帖制冷模块连接至散热片，构建热电冷却器。帕尔帖模块由 2 A 电源供电。
- 将热电偶微探头连接至数据采集设备以记录温....
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结果
三维钙成像分析的工作流程
在本研究中，我们开发了一款新的 ImageJ 插件 TACI，并描述了一种用于追踪 z 轴漂移并分析三维钙成像数据的工作流程，该流程可精确定位在多个 z 轴位置中出现的单个细胞的响应信号（图 1）。该工具包含四个功能：重命名（RENAME）、整理（ORGANIZE）、提取（EXTRACT） 和 合并（MERGE）。首先，如果图像文件名与 ORGANIZE 功能不兼容，可使用 RENAME 功能将文件名转换为所需的格式结构。接着，ORGANIZE 功能将对三维钙成像的 TIFF 数据按 z 轴位置进行灰度化处理（如需要）并进行整理，来自相同 z 轴位置的图像将被保存在同一文件夹中。随后，可使用不同的图像分析工具检测并追踪各 z 轴位置中的感兴趣区域（ROIs），并提取其随时间变化.......
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讨论
本研究开发了一种新的 ImageJ 插件 TACI，并描述了用于分析三维钙成像的流程。目前许多可用的工具主要关注 x/y 方向的运动校正，然而 z 轴方向的运动同样需要明确诊断或校正6。在活体生物中进行图像采集时，即使生物体已被固定，z 轴方向的移动仍不可避免；而某些刺激（如温度变化）常常引起显著的 z 轴漂移。增加 z 层叠的高度可确保在整个成像过程中记录到目标细胞；然而，分析 z 轴方向的运动并非易事，尤其是当单个细胞在多个 z 位置出现时。如果忽略此类运动，研究人员将无法获得这些细胞精确的钙信号响应。TACI 通过提取每个 z 位置的荧光信号来校正 z 轴漂移。TACI 的关键步骤是提取每个时间点的最大值，并用其代表细胞的强度。因此，在整个成像过程中包含目标细胞的所有 z 位置至关重要。此外，我们建议确保一个细胞至少出现在五个或更多的 z 位置，以避免 z 距离和 z 位置影响最大值的准确性（补充图 2A,B）。此外，TACI 还能够分离在横向（x/y 方向）重叠但出现在不同 z 位置的细胞。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
弗拉林影像中心的蔡司 LSM 880 用于采集钙成像数据。我们感谢 Michelle L Olsen 博士和 Yuhang Pan 在使用 IMARIS 软件方面的协助。感谢 Lenwood S. Heath 博士对稿件提出的建设性意见，以及 Steven Giavasis 对 GitHub README 文件的反馈。本研究由 NIH R21MH122987（https://www.nimh.nih.gov/index.shtml）和 NIH R01GM140130（https://www.nigms.nih.gov/）资助，资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 钝头填充针 | BD | 303129 | |
| 二水合氯化钙 | Fisher Scientific | 10035-04-8 | 果蝇食物成分 |
| 二氧化碳 | Airgas | UN1013 | 200号高压钢瓶 |
| CO2 气泡发生器套件 | Genesee | 59-180 | |
| 共聚焦显微镜 LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | 配备5个激光器、2个标准PMT检测器、32通道GaAsP检测器、Airyscan检测器和Definite Focus.2的倒置Axio Observer Z1显微镜。 |
| DAQami软件 | Measurement Computing | ||
| 葡萄糖 | Genesee | 62-113 | 果蝇食物成分 |
| 果蝇琼脂 | Genesee | 66-111 | 果蝇食物成分 |
| 乙醇 | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | 果蝇食物成分 |
| 果蝇品系：Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity 实验室 | 馈赠品 | |
| 果蝇品系：Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni 实验室 | ||
| 果蝇品系：Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel 实验室 | 馈赠品 | |
| 果蝇品系：Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity 实验室 | 馈赠品 | |
| 果蝇品系：UAS-GCaMP6 | Bloomington 果蝇品系中心 | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| 通用锻造黄铜减压阀 | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| 绿色果蝇导管 | Genesee | 59-124 | |
| 导热化合物 | MG Chemicals | 860-60G | |
| 散热片 | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | 裁剪至12.9 x 5.5 cm |
| 照明器 | AmScope | LED-6W | |
| 失活干酵母 | Genesee | 62-108 | 果蝇食物成分 |
| 培养箱 | Pervical | DR-41VL | 光暗周期：12小时光照:12小时黑暗；温度：25 °C；湿度：40-50% RH。 |
| 对羟基苯甲酸甲酯 | Thermo Scientific | 126965000 | 果蝇食物成分 |
| 显微盖玻片 | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| 指甲油 | Kleancolor | ||
| 窄型果蝇培养管 | Genesee | 32-113RL | |
| 物镜 | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| 帕尔贴制冷模块 | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| 塞子 | Genesee | 49-102 | |
| 电源 | Circuit Specialists | CSI1802X | 10伏直流2.0安线性台式电源 |
| Princeton艺术家画笔Nepture | Princeton Artist Brush Co. | 系列4750，2号 | |
| 四水合酒石酸钠钾 | Thermo Scientific | 033241-36 | 果蝇食物成分 |
| 载物台插件 | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| 体视显微镜 | Olympus | SZ61 | 任何体视显微镜均可使用 |
| T型接头 | Genesee | 59-123 | |
| 热电偶数据采集设备 | Measurement Computing | USB-2001-TC | 单通道 |
| 热电偶微探针 | Physitemp | IT-24P | |
| 黄色玉米粉 | Genesee | 62-101 | 果蝇食物成分 |
| Z轴压电载物台 | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
参考文献
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y.....
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重印与许可
