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Summary

小鼠视网膜血管系统在理解血管模式形成的机制方面特别有趣。该协议在距视盘固定距离处自动测量荧光血管造影眼底图像的小鼠视网膜血管直径。

Abstract

研究视网膜病变中视网膜血管系统的发育非常重要，其中异常血管生长最终会导致视力丧失。小眼症相关转录因子 （Mitf） 基因突变表现为色素减退、小眼症、视网膜变性，在某些情况下还会出现失明。通过非侵入性手段对小鼠视网膜进行 体内 成像对于眼科研究至关重要。然而，鉴于其体积小，小鼠眼底成像很困难，可能需要专门的工具、维护和培训。在这项研究中，我们开发了一种独特的软件，可以使用MATLAB编写的自动化程序分析小鼠的视网膜血管直径。在腹膜内注射荧光素盐溶液后，使用商业眼底照相机系统获得眼底照片。对图像进行了更改以增强对比度，并且MATLAB程序允许在距视盘的预定距离处自动提取平均血管直径。通过分析视网膜血管直径，研究了野生型小鼠和 Mitf 基因不同突变小鼠的血管变化。这里开发的定制编写的MATLAB程序实用，易于使用，并允许研究人员方便可靠地分析小鼠视网膜脉管系统的平均直径和平均总直径，以及血管数量。

Introduction

可能人体中研究最多的血管床是视网膜血管系统。随着技术的不断提高，视网膜血管系统很容易在活着的患者身上拍摄，并被用于许多研究领域¹.此外，小鼠视网膜血管系统在发育过程中已被证明是研究血管生长基础生物学的非常有效的模型系统。视网膜血管系统的主要目的是通过渗透^{神经组织的层}状毛细血管网为视网膜内部提供代谢支持2。然而，视网膜的状况，以及由此产生的任何功能障碍或萎缩，都会对视网膜血管系统的分叉和动脉直径产生显着影响，这表明视网膜细胞和血管系统之间存在相互作用^3,4。众所周知，许多眼部疾病，包括早产儿视网膜病变 （ROP）、糖尿病视网膜病变 （DR）、年龄相关性黄斑变性 （AMD）、青光眼和角膜新生血管形成，可导致眼部血管生成异常⁵。在视网膜血管系统的情况下，视网膜变性的小鼠模型通常表现出与人类^{血管疾病中}观察到的变化相当^6,7。基本螺旋-环-螺旋-拉链转录因子的 Myc 超基因家族包括在视网膜色素上皮 （RPE） 中表达的小眼症相关转录因子 （Mitf） 基因^8,9,10。

许多器官，包括眼睛、耳朵、免疫系统、中枢神经系统、肾脏、骨骼和皮肤，已被证明受 Mitf ^9,11,12,13 的调节。 我们发现，在携带 Mitf 基因各种突变的小鼠中，RPE 的结构和功能会受到影响，导致一些视网膜变性并最终导致视力丧失¹⁰。最近，已经表明，Mitf突变型和野生型小鼠¹⁴之间的血管数量和血管直径存在显着差异。由于视网膜成像的发展，研究人员和医生现在可以精确量化体内的视网膜血管系统。自 1800 年代以来，研究人员和医生利用了视网膜血管系统可视化的好处，荧光素血管造影 （FA） 已显示视网膜血流和血液-视网膜屏障的降解¹⁵。

本文演示了如何使用 MATLAB 软件中的自定义编写代码分析小鼠 FA 图像中的视网膜血管直径。

Protocol

所有实验均获得冰岛食品和兽医局的批准（MAST 许可证编号 2108002）。所有动物研究均根据视觉和眼科研究协会 （ARVO） 关于在眼科和视力研究中使用动物的声明进行。本研究使用雄性和雌性 C57BL/6J 和 Mitf^mi-vga9/+ 小鼠。将C57BL / 6J小鼠（n = 7）用作对照。野生型是商业获得的（见 材料表），但所有突变小鼠（n = 7）都是在冰岛大学生物医学中心的动物设施中繁殖和饲养的。在本研究中，使用 3 个月大的动物;但是，该方案甚至适用于 1 个月及以上的动物。

1. 实验准备

1. 准备麻醉混合物。取一安瓿 2 mL 氯胺酮储备溶液 （25 mg/mL） 和 250 μL 甲苯噻嗪储备溶液 （2%） 制备氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（25 mg/mL 氯胺酮和 20 mg/mL 甲苯噻嗪）的工作溶液（参见 材料表）。
2. 通过腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠，液体体积为小鼠体重的四倍;例如，一只体重20g的小鼠需要35μL甲苯噻嗪/氯胺酮工作溶液才能获得工作剂量的甲苯噻嗪（4mg/kg体重）和氯胺酮（40mg/kg体重）混合物。
3. 麻醉后立即用 10% 盐酸去氧肾上腺素和 1% 托吡卡胺滴眼液扩张瞳孔。
4. 等到动物完全麻醉并且其瞳孔广泛散大。
5. 制备荧光素盐溶液。将 9 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS; 1x） 加入 1 mL 荧光素溶液（100 mg/mL 储备浓度）中（参见 材料表）。最终浓度工作溶液为 10 mg/mL。

2. 使用啮齿动物视网膜成像系统对视网膜血管系统进行 体内 成像

1. 腹膜内（5μL/g体重）给予麻醉动物荧光素工作溶液。
2. 将一滴2%甲基纤维素凝胶滴在角膜表面，然后将动物放在成像系统的定位台上（参见 材料表）。
3. 放置视网膜成像眼底相机镜头，直接轻轻地触摸鼠标的角膜。要将视神经头置于视野的中间，请稍微调整对齐方式。
4. 切换到眼底相机上的绿色荧光通道。
5. 将焦点放在视网膜血管上以拍摄图像。
6. 要找到理想的时间点，请在荧光素注射后 1、3、5 和 10 分钟（但不超过 10 分钟）拍摄多张照片。
   注意:FA 处理必须在 10 分钟内完成，因为在此之后，荧光素可能会变得过于弥散，并且血管变得无法检测到。
7. 成像完成后，当小鼠仍处于麻醉状态时，通过颈椎脱位对其进行安乐死。

3. 视网膜血管直径的分析

1. 打开 MATLAB 程序（请参阅 材料列表）。
2. 下载并保存”fundusDiameter.m”代码（请参阅 补充编码文件 1、补充编码文件 2 和 补充编码文件 3）。
3. 打开保存代码的文件夹。将代码拖放到 MATLAB 中的 当前文件夹 上。
4. 在MATLAB的当前文件夹中拖放FFA图像（眼底荧光血管造影图像）或要分析的图像。
5. 按 MATLAB 工具栏中的 “运行 “工具。
6. 将出现一个弹出窗口。在 “输入文件名 “框中写下感兴趣图像的文件名，然后按 “确定“。
   注意:请勿更改或修改其余参数。
7. 选择 光盘的中心，然后选择 光盘的边缘。现在，该软件计算小鼠眼底图像中像素的强度，该圆圈的半径是光学盘的两倍，从光学盘中心顺时针方向（图1）。
8. 接下来，确保软件将眼底中每条血管的平均血管直径（以像素为单位）绘制为血管数量的函数（图 2）。
9. 之后，确保软件将每艘船的测量数据传输到 Excel 文档中，其中计算这些值的平均值、中位数和标准差（表 1 和 表 2）。
10. 通过选择表中的所有值，将结果表中的值移动到电子表格程序中。将值粘贴到电子表格中。
11. 绘制图形并使用粘贴到所选电子表格程序中的数据执行统计分析（请参阅 材料表）。

Representative Results

Discussion

本文首次提出了一种从小鼠FA图像中分析视网膜血管直径和视网膜血管系统的方法。由于仅使用眼底成像来捕获视网膜血管系统的图像，因此该方法有几个缺点，其中之一是只能推断出本研究中检查的小鼠视网膜血管系统浅层的变化;更深层次的任何差异都尚不清楚。

已经提出了一种独特的光学相干断层扫描血管造影（OCTA）图像分析方法，该方法使用自动血管追踪和血管直径¹⁶。然而，这种方法需要梯度引导的最小径向距离 （MRD） 测量，这是用于定量表征动脉直径（包括单个毛细血管）的自动化框架的基础。此外，微小毛细血管的大小可能在某种程度上被夸大了，因为 OCT 系统的横向分辨率有限¹⁶。这种方法需要 FA，它可以捕获视网膜和脉络膜脉络膜脉管系统的更广泛区域¹⁷。动态血管分析仪 （DVA） 原型可用于分析小鼠¹⁸ 的视网膜血管。然而，该设备使用在预定频率施加的闪烁光脉冲，以实现动态血管检查作为时间的函数。如验尸分析所示，当比较闪烁暴露的视网膜和闪烁的初治视网膜时，记录方法期间的视觉刺激可能会对所研究的视网膜施加压力¹⁸。该方法允许在麻醉下分析对照组和 Mitf 突变体动物的视网膜血管系统和视网膜血管直径，而无需事先使用荧光素盐来增强对比度。然而，其他具有不同突变的小鼠模型，以及白化小鼠，尚未用目前的方法进行研究。需要进一步的研究来探索和分析其他小鼠品系的血管直径。

由于眼底相机配备了大鼠物镜，我们认为该方法可以应用于大鼠。由于不同的麻醉剂已被证明会影响大鼠眼中的功能性视网膜血流，因此它们也可能影响视网膜血管直径¹⁹;因此，必须强调的是，选择麻醉剂需要仔细考虑。本研究使用了氯胺酮/甲苯噻嗪的组合，这可能对视网膜血管大小的测量方式产生了一些影响。另一种麻醉方法可能是 通过 面罩吸入异氟烷，这种面罩经常用于小鼠的类似程序。

对视网膜血管图像的采集和分析进行计时至关重要，以便在腹膜内注射荧光素后 5 至 10 分钟进行直径测量。事实上，建议为每个实验室和研究设置单独定义本研究中在单个示例中执行的理想图像采集周期。在分析的每张图像上，程序强度阈值设置为 80%。这些船只在经过精心挑选后通过了MATLAB程序。作为MATLAB程序验证的一部分，对结果的可重复性进行了评估。也有可能一些 Mitf 突变小鼠的背景水平大于80%的临界值，但软件会识别出这一点，因此同样可能是一个小错误。分支是影响视网膜血管系统分析的变量，在使用程序进行测量时必须适当考虑。在未来，确定血管直径的过程必须完全自动化，但由于我们的 Mitf 突变小鼠模型之间存在荧光强度的变化，潜在的血管渗漏以及视网膜血管系统的其他变化，因此到目前为止，这已被证明是一项具有挑战性的任务。

Materials

1% Tropicamide (Mydriacyl)	Alcon Inc Laboratories		Mydriatic agent
2% Methocel	OmniVision Eye Care		Hydroxypropryl methylcellulose gel
C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664	Wild type mice
Excel for Microsoft 365	Microsoft Inc		Software package
Fluorescein sodium salt	Sigma-Aldrich	28803-100G	Fluorescent angiography
Matlab 8.0	The MathWorks, Inc.		Software package
Micron IV rodent fundus camera	Phoenix-Micron	40-2200	Fundus photography
Phenylephrine 10% w/v	Bausch & Lomb		Mydriatic agent
Phosphate Buffered Saline – 100 tablets	Gibco	18912-014	Dilution
Sigmaplot 13	Jandel Scientific Software		Software package
S-Ketamine, 25 mg/mL	Pfizer Inc.	PAA104470	Anesthesia IP