从小鼠荧光血管造影图像中测量视网膜血管直径

摘要

小鼠视网膜血管系统在研究血管模式形成机制方面具有重要意义。本方案通过荧光血管造影眼底图像，自动测量距视盘固定距离处的小鼠视网膜血管直径。

摘要

研究视网膜血管系统在视网膜病变中的发育过程至关重要，因为异常的血管生长最终可能导致视力丧失。微phthalmia相关转录因子（Mitf）基因的突变可导致色素减退、小眼球、视网膜变性，以及在某些情况下出现失明。体内无创成像技术对小鼠视网膜进行成像是眼科研究的关键。然而，由于小鼠眼球尺寸较小，眼底成像较为困难，可能需要专门的设备、维护和培训。在本研究中，我们开发了一种独特的软件，通过使用MATLAB编写的自动化程序，实现对小鼠视网膜血管直径的分析。眼底照片是在腹腔注射荧光素盐溶液后，利用商用眼底相机系统获取的。图像经过处理以增强对比度，MATLAB程序可在距视盘预设距离处自动提取平均血管直径。通过分析视网膜血管直径，我们比较了野生型小鼠与携带不同Mitf基因突变的小鼠之间的血管变化。本研究自主编写的MATLAB程序具有实用性、操作简便，可使研究人员方便且可靠地分析小鼠视网膜血管的平均直径、平均总直径以及血管数量。

引言

人体中研究最广泛的血管床可能是视网膜血管系统。随着技术不断进步，视网膜血管可在活体患者中被轻松拍摄，并广泛应用于多个研究领域¹。此外，发育过程中的小鼠视网膜血管已被证明是研究血管生长基本生物学机制的一个非常有效的模型系统。视网膜血管系统的主要功能是通过贯穿神经组织的层状毛细血管网，为视网膜内层提供代谢支持²。然而，视网膜的状态以及由此产生的任何功能障碍或萎缩，均可能显著影响视网膜血管的分支结构和动脉直径，表明视网膜细胞与血管系统之间存在相互作用^3,4。已知多种眼部疾病，包括早产儿视网膜病变（ROP）、糖尿病性视网膜病变（DR）、年龄相关性黄斑变性（AMD）、青光眼和角膜新生血管化，均可导致异常的眼部血管生成⁵。在视网膜血管系统中，视网膜变性的小鼠模型通常表现出与人类血管疾病相似的变化^6,7。Myc 超基因家族是一类基本的螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链转录因子，其中包括在视网膜色素上皮（RPE）中表达的微phthalmia相关转录因子（Mitf）基因^8,9

方案

所有实验均获得冰岛食品与兽医管理局（MAST 许可证编号：2108002）的批准。所有动物实验均按照视力研究与眼科学会（ARVO）关于动物在眼科学与视觉研究中使用的声明进行。本研究使用了雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠以及 Mitf^mi-vga9/+ 小鼠。C57BL/6J 小鼠（n = 7）作为对照组。野生型小鼠为商业获取（见材料表），但所有突变型小鼠（n = 7）均在中国冰岛大学生物医学中心的动物实验设施中繁育和饲养。本研究使用了3个月大的动物；然而，该方案同样适用于1个月及更年长的动物。

1. 实验准备

1. 配制麻醉混合液。取一支2 mL的氯胺酮储备液（25 mg/mL）和250 µL的赛拉嗪储备液（2%），配制氯胺酮/赛拉嗪工作液（含氯胺酮25 mg/mL和赛拉嗪20 mg/mL）（参见材料表）。
2. 通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合液对小鼠进行麻醉，注射体积为小鼠体重的4倍；例如，一只体重20 g的小鼠需注射80 µL氯胺酮/赛拉嗪工作液，以达到赛拉嗪（4 mg/kg体重）和氯胺酮（40 mg/kg体重）的给药剂量。
3. 麻醉后立即滴入10%盐酸去氧肾上腺素和1%托吡卡胺眼药水以散大瞳孔。
4. 等待动物完全麻醉且瞳孔充分散大。
5. 配制荧光素钠....

结果

图1 展示了用于分析视网膜血管结构的流程，该流程应用于所有受试小鼠的荧光素眼底血管造影（FFA）图像。以视盘中心为起点，采用两倍于视盘半径的距离，在圆形区域内沿顺时针方向测量像素强度。当程序遇到高于或低于用户设定阈值的点时，分别标记为起始点或终止点。此过程重复30次，每次均略微远离视盘中心。FFA图像在注射荧光素后5分钟拍摄（图1A 和 图1B）。分析软件随后计算每一对30个相关终止点与起始点之间的最短路径。处理结果为一幅图像，其中各点之间以白线表示路径及其测量结果；对照组小鼠和 Mitf 突变型小鼠的示例图像分别如 图1A 和 图1B 所示。然而，图1B 中所示的黑色箭头为可能出现的微小误差，但软件不会将这些误差识别为视网膜血管。此外，程序基于每条视网膜血管上确定.......

讨论

本文首次提出了一种从鼠类FA图像中分析视网膜血管直径和视网膜血管结构的方法。由于仅采用眼底成像技术来获取视网膜血管结构的图像，该方法存在若干局限性，其中之一是只能推断本研究中所观察小鼠视网膜血管浅层结构的变化；而深层结构的任何差异目前尚不明确。

一种利用自动血管追踪和血管直径测量的独特光学相干断层扫描血管成像（OCTA）图像分析方法已被提出¹⁶。然而，该方法需要基于梯度引导的最小径向距离（MRD）测量，这是用于定量表征包括单个毛细血管在内的动脉直径的自动化框架的基础。此外，由于OCT系统具有有限的横向分辨率，微小毛细血管的尺寸可能在一定程度上被高估¹⁶。该方法需要荧光素血管造影（FA），以捕获更广泛的视网膜和脉络膜血管结构¹⁷。动态血管分析仪（DVA）原型可用于分析小鼠的视网膜血管¹⁸。然而，该设备使用在预设频率下施加的闪烁光脉冲，以实现随时间变化的动态血管检测。尸体解剖分析显示，在比较暴露于.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% 托吡卡胺（Mydriacyl）	Alcon Inc Laboratories		散瞳剂
2% 甲基纤维素（Methocel）	OmniVision Eye Care		羟丙基甲基纤维素凝胶
C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664	野生型小鼠
Excel for Microsoft 365	Microsoft Inc		软件包
荧光素钠盐	Sigma-Aldrich	28803-100G	荧光血管造影
Matlab 8.0	The MathWorks, Inc.		软件包
Micron IV 啮齿类动物眼底相机	Phoenix-Micron	40-2200	眼底摄影
去氧肾上腺素 10% w/v	Bausch & Lomb		散瞳剂
磷酸盐缓冲液 - 100 片装	Gibco	18912-014	稀释
Sigmaplot 13	Jandel Scientific Software		软件包
S-氯胺酮，25 mg/mL	Pfizer Inc.	PAA104470	腹腔注射麻醉剂