从小鼠荧光血管造影图像中测量视网膜血管直径

摘要

小鼠视网膜血管系统在理解血管模式形成的机制方面特别有趣。该协议在距视盘固定距离处自动测量荧光血管造影眼底图像的小鼠视网膜血管直径。

摘要

研究视网膜病变中视网膜血管系统的发育非常重要，其中异常血管生长最终会导致视力丧失。小眼症相关转录因子 （Mitf） 基因突变表现为色素减退、小眼症、视网膜变性，在某些情况下还会出现失明。通过非侵入性手段对小鼠视网膜进行 体内 成像对于眼科研究至关重要。然而，鉴于其体积小，小鼠眼底成像很困难，可能需要专门的工具、维护和培训。在这项研究中，我们开发了一种独特的软件，可以使用MATLAB编写的自动化程序分析小鼠的视网膜血管直径。在腹膜内注射荧光素盐溶液后，使用商业眼底照相机系统获得眼底照片。对图像进行了更改以增强对比度，并且MATLAB程序允许在距视盘的预定距离处自动提取平均血管直径。通过分析视网膜血管直径，研究了野生型小鼠和 Mitf 基因不同突变小鼠的血管变化。这里开发的定制编写的MATLAB程序实用，易于使用，并允许研究人员方便可靠地分析小鼠视网膜脉管系统的平均直径和平均总直径，以及血管数量。

引言

可能人体中研究最多的血管床是视网膜血管系统。随着技术的不断提高，视网膜血管系统很容易在活着的患者身上拍摄，并被用于许多研究领域¹.此外，小鼠视网膜血管系统在发育过程中已被证明是研究血管生长基础生物学的非常有效的模型系统。视网膜血管系统的主要目的是通过渗透^{神经组织的层}状毛细血管网为视网膜内部提供代谢支持2。然而，视网膜的状况，以及由此产生的任何功能障碍或萎缩，都会对视网膜血管系统的分叉和动脉直径产生显着影响，这表明视网膜细胞和血管系统之间存在相互作用^3,4。众所周知，许多眼部疾病，包括早产儿视网膜病变 （ROP）、糖尿病视网膜病变 （DR）、年龄相关性黄斑变性 （AMD）、青光眼和角膜新生血管形成，可导致眼部血管生成异常⁵。在视网膜血管系统的情况下，视网膜变性的小鼠模型通常表现出与人类^{血管疾病中}观察到的变化相当^6,7。基本螺旋-环-螺旋-拉链转录因子的 Myc 超基因家族包括在视网膜色素上皮 （RPE） 中表达的小眼症相关转录因子 （Mitf） 基因^8,9,10

方案

所有实验均获得冰岛食品和兽医局的批准（MAST 许可证编号 2108002）。所有动物研究均根据视觉和眼科研究协会 （ARVO） 关于在眼科和视力研究中使用动物的声明进行。本研究使用雄性和雌性 C57BL/6J 和 Mitf^mi-vga9/+ 小鼠。将C57BL / 6J小鼠（n = 7）用作对照。野生型是商业获得的（见 材料表），但所有突变小鼠（n = 7）都是在冰岛大学生物医学中心的动物设施中繁殖和饲养的。在本研究中，使用 3 个月大的动物;但是，该方案甚至适用于 1 个月及以上的动物。

1. 实验准备

1. 准备麻醉混合物。取一安瓿 2 mL 氯胺酮储备溶液 （25 mg/mL） 和 250 μL 甲苯噻嗪储备溶液 （2%） 制备氯胺酮/甲苯噻嗪混合物（25 mg/mL 氯胺酮和 20 mg/mL 甲苯噻嗪）的工作溶液（参见 材料表）。
2. 通过腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠，液体体积为小鼠体重的四倍;例如，一只体重20g的小鼠需要35μL甲苯噻嗪/氯胺酮工作溶液才能获得工作剂量的甲苯噻嗪（4mg/kg体重）和氯胺酮（40mg/kg体重）混合物。
3. 麻醉后立即用 10% 盐酸去氧肾上腺素和 1% 托吡卡胺滴眼液扩张瞳孔。
4. 等到动物完全麻醉并且其瞳孔广泛散....

结果

图 1 显示了用于分析视网膜血管系统的过程，该过程应用于所有测试小鼠的小鼠 FFA 图像。半径是光盘的两倍，用于测量从光盘中心开始沿顺时针方向旋转的像素强度。当它分别遇到高于和低于用户指定阈值的点时，它会用起点或终点标记像素。重复 30 次，每次都离视盘中心稍远一点。在荧光素注射后5分钟拍摄FFA图像（图1A 和 图1B）。然后，分析软件计算 30 个相关端点与每个起点之间的最短路线。这种处理的结果是一个图形，其中点和测量值由它们之间的白线表示;来自对照和 Mitf 突变小鼠的此类图像示例分别显示在 图1A 和 图1B中。但是， 图1B 中显示的黑色箭头是可能发生的轻微错误，但软件不会将这些错误读取为视网膜血管。此外，该程序根据血管上确定的 30 个端点以像素为单位.......

讨论

本文首次提出了一种从小鼠FA图像中分析视网膜血管直径和视网膜血管系统的方法。由于仅使用眼底成像来捕获视网膜血管系统的图像，因此该方法有几个缺点，其中之一是只能推断出本研究中检查的小鼠视网膜血管系统浅层的变化;更深层次的任何差异都尚不清楚。

已经提出了一种独特的光学相干断层扫描血管造影（OCTA）图像分析方法，该方法使用自动血管追踪和血管直径¹⁶。然而，这种方法需要梯度引导的最小径向距离 （MRD） 测量，这是用于定量表征动脉直径（包括单个毛细血管）的自动化框架的基础。此外，微小毛细血管的大小可能在某种程度上被夸大了，因为 OCT 系统的横向分辨率有限¹⁶。这种方法需要 FA，它可以捕获视网膜和脉络膜脉络膜脉管系统的更广泛区域¹⁷。动态血管分析仪 （DVA） 原型可用于分析小鼠¹⁸ 的视网膜血管。然而，该设备使用在预定频率施加的闪烁光脉冲，以实现动态血管检查作为时间的函数。如验尸分析所示，当比.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% 托吡卡胺（Mydriacyl）	Alcon Inc Laboratories		散瞳剂
2% Methocel	OmniVision Eye Care		羟丙基甲基纤维素凝胶
C57BL/6J	Jackson Laboratory	000664	野生型小鼠
Excel for Microsoft 365	Microsoft Inc		软件包
荧光素钠盐	Sigma-Aldrich	28803-100G	荧光血管造影
Matlab 8.0	The MathWorks， Inc.		软件包
Micron IV 啮齿动物眼底相机	Phoenix-Micron	40-2200	眼底摄影
肾上腺素 10% w/v	Bausch &Lomb		散瞳剂
磷酸盐缓冲盐水 - 100 片	Gibco	18912-014	稀释
Sigmaplot 13	Jandel Scientific 软件包
S-氯胺酮，25 mg/mL	辉瑞公司。	PAA104470	麻醉 IP