方法文章

从小鼠荧光血管造影图像中测量视网膜血管直径

DOI：

10.3791/64964

⸱

2023年5月19日

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1Department of Physiology, Biomedical Center, Faculty of Medicine, University of Iceland, 2Department of Ophthalmology, National University Hospital

本文内容

摘要

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小鼠视网膜血管系统在研究血管模式形成机制方面具有重要意义。本方案通过荧光血管造影眼底图像，自动测量距视盘固定距离处的小鼠视网膜血管直径。

摘要

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研究视网膜血管系统在视网膜病变中的发育过程至关重要，因为异常的血管生长最终可能导致视力丧失。微phthalmia相关转录因子（Mitf）基因的突变可导致色素减退、小眼球、视网膜变性，以及在某些情况下出现失明。体内无创成像技术对小鼠视网膜进行成像是眼科研究的关键。然而，由于小鼠眼球尺寸较小，眼底成像较为困难，可能需要专门的设备、维护和培训。在本研究中，我们开发了一种独特的软件，通过使用MATLAB编写的自动化程序，实现对小鼠视网膜血管直径的分析。眼底照片是在腹腔注射荧光素盐溶液后，利用商用眼底相机系统获取的。图像经过处理以增强对比度，MATLAB程序可在距视盘预设距离处自动提取平均血管直径。通过分析视网膜血管直径，我们比较了野生型小鼠与携带不同Mitf基因突变的小鼠之间的血管变化。本研究自主编写的MATLAB程序具有实用性、操作简便，可使研究人员方便且可靠地分析小鼠视网膜血管的平均直径、平均总直径以及血管数量。

引言

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人体中研究最广泛的血管床可能是视网膜血管系统。随着技术不断进步，视网膜血管可在活体患者中被轻松拍摄，并广泛应用于多个研究领域1。此外，发育过程中的小鼠视网膜血管已被证明是研究血管生长基本生物学机制的一个非常有效的模型系统。视网膜血管系统的主要功能是通过贯穿神经组织的层状毛细血管网，为视网膜内层提供代谢支持2。然而，视网膜的状态以及由此产生的任何功能障碍或萎缩，均可能显著影响视网膜血管的分支结构和动脉直径，表明视网膜细胞与血管系统之间存在相互作用3,4。已知多种眼部疾病，包括早产儿视网膜病变（ROP）、糖尿病性视网膜病变（DR）、年龄相关性黄斑变性（AMD）、青光眼和角膜新生血管化，均可导致异常的眼部血管生成5。在视网膜血管系统中，视网膜变性的小鼠模型通常表现出与人类血管疾病相似的变化6,7。Myc 超基因家族是一类基本的螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链转录因子，其中包括在视网膜色素上皮（RPE）中表达的微phthalmia相关转录因子（Mitf）基因8,9,10。

眼睛、耳朵、免疫系统、中枢神经系统、肾脏、骨骼和皮肤等多种器官已被证实受到调控 Mitf9,11,12,13. 我们发现，携带多种突变的小鼠其视网膜色素上皮（RPE）的结构和功能均受到影响 Mitf 基因，导致某些情况下出现视网膜退化，并最终造成视力丧失10最近研究表明，血管数量和血管直径在不同情况下存在显著差异 Mitf 突变型与野生型小鼠14研究人员和医生现在可以精确定量视网膜血管系统 体内 得益于视网膜成像技术的发展。自19世纪以来，研究人员和临床医生已充分利用观察视网膜血管结构的优势，荧光素血管造影（FA）可显示视网膜血流情况以及血-视网膜屏障的破坏情况15.

本文演示了如何使用 MATLAB 软件中自编写的代码，从小鼠荧光素血管造影（FA）图像中分析视网膜血管直径。

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方案

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所有实验均获得冰岛食品与兽医管理局（MAST 许可证编号：2108002）的批准。所有动物实验均按照视力研究与眼科学会（ARVO）关于动物在眼科学与视觉研究中使用的声明进行。本研究使用了雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠以及 Mitfmi-vga9/+ 小鼠。C57BL/6J 小鼠（n = 7）作为对照组。野生型小鼠为商业获取（见材料表），但所有突变型小鼠（n = 7）均在中国冰岛大学生物医学中心的动物实验设施中繁育和饲养。本研究使用了3个月大的动物；然而，该方案同样适用于1个月及更年长的动物。

1. 实验准备

  1. 配制麻醉混合液。取一支2 mL的氯胺酮储备液（25 mg/mL）和250 µL的赛拉嗪储备液（2%），配制氯胺酮/赛拉嗪工作液（含氯胺酮25 mg/mL和赛拉嗪20 mg/mL）（参见材料表）。
  2. 通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合液对小鼠进行麻醉，注射体积为小鼠体重的4倍；例如，一只体重20 g的小鼠需注射80 µL氯胺酮/赛拉嗪工作液，以达到赛拉嗪（4 mg/kg体重）和氯胺酮（40 mg/kg体重）的给药剂量。
  3. 麻醉后立即滴入10%盐酸去氧肾上腺素和1%托吡卡胺眼药水以散大瞳孔。
  4. 等待动物完全麻醉且瞳孔充分散大。
  5. 配制荧光素钠溶液。将9 mL磷酸盐缓冲液（PBS；1×）加入1 mL荧光素溶液（100 mg/mL储备浓度）中（参见材料表）。最终工作液浓度为10 mg/mL。

2. 体内 使用啮齿类动物视网膜成像系统对视网膜血管进行成像

  1. 向麻醉后的动物腹腔注射荧光素工作液（5 µL/g 体重）。
  2. 在角膜表面滴加一滴 2% 甲基纤维素凝胶，然后将动物放置于成像系统的定位台上（参见材料表）。
  3. 将视网膜成像眼底相机镜头轻柔地直接接触小鼠角膜，并通过微调使视神经乳头位于视野中央。
  4. 切换至眼底相机的绿色荧光通道。
  5. 对焦于视网膜血管以采集图像。
  6. 为确定最佳时间点，在注射荧光素后 1、3、5 和 10 分钟（但不超过 10 分钟）内拍摄多张照片。
    注意：荧光素血管造影（FA）操作必须在 10 分钟内完成，否则荧光素可能过度弥散，导致血管无法识别。
  7. 成像完成后，在小鼠仍处于麻醉状态下，采用颈椎脱位法实施安乐死。

3. 视网膜血管直径的分析

  1. 打开 MATLAB 程序（参见 材料表）。
  2. 下载并保存 "fundusDiameter.m" 代码（参见 补充代码文件 1、补充代码文件 2 和 补充代码文件 3）。
  3. 打开保存代码的文件夹。将代码拖动并释放到 MATLAB 中的 当前文件夹 区域。
  4. 将需要分析的 FFA 图像 （眼底荧光血管造影图像）或多个图像拖动并释放到 MATLAB 中的 当前文件夹 区域。
  5. 点击 MATLAB 工具栏中的 运行 工具。
  6. 将弹出一个窗口。在 输入文件名 框中输入目标图像的文件名，然后点击 确定。
    注意：请勿更改或修改其他参数。
  7. 首先选择 视盘中心，然后选择 视盘边缘。软件现在将从视盘中心开始，沿顺时针方向，在半径为视盘直径两倍的圆形区域内，计算小鼠眼底图像中像素的强度（图 1）。
  8. 接下来，确认软件已绘制出眼底中每条血管的平均血管直径（以像素为单位）随血管编号变化的曲线图（图 2）。
  9. 随后，确认软件已将每条血管的测量数据导出至 Excel 文档，并在其中计算这些数值的均值、中位数和标准差（表 1 和 表 2）。
  10. 通过选中表格中的所有数值，将结果表中的数值复制到电子表格程序中。将数值粘贴至电子表格。
  11. 使用所选的电子表格程序对粘贴的数据进行绘图并执行统计分析（参见 材料表）。

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结果

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图1 展示了用于分析视网膜血管结构的流程，该流程应用于所有受试小鼠的荧光素眼底血管造影（FFA）图像。以视盘中心为起点，采用两倍于视盘半径的距离，在圆形区域内沿顺时针方向测量像素强度。当程序遇到高于或低于用户设定阈值的点时，分别标记为起始点或终止点。此过程重复30次，每次均略微远离视盘中心。FFA图像在注射荧光素后5分钟拍摄（图1A 和 图1B）。分析软件随后计算每一对30个相关终止点与起始点之间的最短路径。处理结果生成一幅图像，其中各点之间以白线表示其测量路径；对照组小鼠和 Mitf 突变型小鼠的示例图像分别如 图1A 和 图1B 所示。然而，图1B 中所示的黑色箭头为可能出现的微小误差，但软件不会将这些误差识别为视网膜血管。此外，程序基于每条视网膜血管上确定的3...

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讨论

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本文首次提出了一种从鼠类FA图像中分析视网膜血管直径和视网膜血管结构的方法。由于仅采用眼底成像技术来获取视网膜血管结构的图像，该方法存在若干局限性，其中之一是只能推断本研究中所观察小鼠视网膜血管浅层结构的变化；而深层结构的任何差异目前尚不明确。

一种利用自动血管追踪和血管直径测量的独特光学相干断层扫描血管成像（OCTA）图像分析方法已被提出16。然而，该方法需要基于梯度引导的最小径向距离（MRD）测量，这是用于定量表征包括单个毛细血管在内的动脉直径的自动化框架的基础。此外，由于OCT系统具有有限的横向分辨率，微小毛细血管的尺寸可能在一定程度上被高估16。该方法需要荧光素血管造影（FA），以捕获更广泛的视网膜和脉络膜血管结构17。动态血管分析仪（DVA）原型可用于分析小鼠的视网膜血管18。然而，该设备使用在预设频率下施加的闪烁光脉冲，以实现随时间变化的动态血管检测。尸体解剖分析显示，在比较暴露于...

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披露

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作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

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本工作由冰岛研究基金（Icelandic Research Fund）博士后奖学金项目（项目编号：217796-052）（A.G.L.）以及Helga Jónsdóttir和Sigurlidi Kristjánsson纪念基金（A.G.L. 和 T.E.）资助。作者感谢Eiríkur Steingrímsson教授提供了小鼠。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1% 托吡卡胺（Mydriacyl）Alcon Inc Laboratories散瞳剂
2% 甲基纤维素（Methocel）OmniVision Eye Care羟丙基甲基纤维素凝胶
C57BL/6JJackson Laboratory000664野生型小鼠
Excel for Microsoft 365Microsoft Inc软件包
荧光素钠盐Sigma-Aldrich28803-100G荧光血管造影
Matlab 8.0The MathWorks, Inc.软件包
Micron IV 啮齿类动物眼底相机Phoenix-Micron40-2200眼底摄影
去氧肾上腺素 10% w/vBausch & Lomb散瞳剂
磷酸盐缓冲液 - 100 片装Gibco18912-014稀释
Sigmaplot 13Jandel Scientific Software软件包
S-氯胺酮，25 mg/mLPfizer Inc.PAA104470腹腔注射麻醉剂

参考文献

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  1. Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. Imaging retina to study dementia and stroke. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 89-107 (2017).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  3. Ma, Y., et al. Quantitative analysis of retinal vessel attenuation in eyes with retinitis pigmentosa. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 4306-4314 (2012).
  4. Eysteinsson, T., Hardarson, S. H., Bragason, D., Stefansson, E. Retinal vessel oxygen saturation and vessel diameter in retinitis pigmentosa. Acta Ophthalmologica. 92 (5), 449-453 (2014).
  5. Al-Latayfeh, M., Silva, P. S., Sun, J. K., Aiello, L. P. Antiangiogenic therapy for ischemic retinopathies. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (6), 006411(2012).
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  7. Liu, H., et al. Photoreceptor cells influence retinal vascular degeneration in mouse models of retinal degeneration and diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4272-4281 (2016).
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  16. Wei, W., et al. Automated vessel diameter quantification and vessel tracing for OCT angiography. Journal of Biophotonics. 13 (12), e202000248(2020).
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  18. Albanna, W., et al. Non-invasive evaluation of neurovascular coupling in the murine retina by dynamic retinal vessel analysis. PLoS One. 13 (10), e0204689(2018).
  19. Moult, E. M., et al. Evaluating anesthetic protocols for functional blood flow imaging in the rat eye. Journal of Biomedical Optics. 22 (1), 16005(2017).

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