本方案描述了如何利用三氯化铁（FeCl3）介导的损伤诱导动脉血栓形成，以及如何在血栓形成的各个阶段收集和制备动脉损伤样本，用于电子显微镜分析。
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方法文章
三氯化铁诱导的动脉血栓形成及用于三维电子显微镜分析的样本采集
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
心血管疾病是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因。异常血栓形成是糖尿病和肥胖等全身性疾病以及动脉粥样硬化、癌症和自身免疫性疾病等慢性炎症性疾病的常见特征。当血管受损时，凝血系统、血小板和内皮通常协同作用，在损伤部位形成血凝块以防止出血。该过程的异常可导致过度出血或失控性血栓形成/抗血栓活性不足，进而引起血管闭塞及其继发后果。FeCl₃3-诱导的颈动脉损伤模型是研究血栓形成起始与进展过程的重要工具 体内该模型涉及内皮损伤/剥脱以及损伤部位随后发生的血栓形成，可提供一种高度敏感且定量的检测方法，用于监测不同程度血管损伤所引发的血管损害及血栓形成。经过优化后，该标准技术可用于研究血栓形成背后的分子机制，以及生长中血栓内血小板的超微结构变化。该检测方法还可用于评估抗血栓和抗血小板药物的疗效。本文介绍了如何启动并监测 FeCl₃ 诱导的小鼠颈动脉血栓形成模型。, 颈动脉, 血小板, 血栓形成, 血管损伤, FeCl₃, 动物模型, 血栓, 活体显微镜, 血小板聚集3诱导的动脉血栓形成，以及如何采集样本用于电子显微镜分析。
引言
血栓形成是指在血管内形成血凝块，导致血液的自然流动部分或完全受阻。这会引发严重的甚至致命的心血管事件，例如缺血性心脏病和中风。心血管疾病是全球发病率和死亡率的首要原因，导致约四分之一的死亡1,2,3。尽管血栓形成表现为血管系统的功能障碍，但它可能是由潜在的微生物或病毒感染、免疫系统紊乱、恶性肿瘤或代谢性疾病所引起的。血液流动依赖于血管系统中多种组分之间的复杂相互作用，包括内皮细胞、红细胞/白细胞、血小板以及凝血因子4。当血管受损时，血小板会与内皮下基质中的黏附蛋白相互作用，并释放其颗粒内容物，从而募集更多血小板5。同时，凝血级联反应被激活，导致纤维蛋白的形成和沉积。最终形成的血凝块由被纤维蛋白网捕获的血小板和红细胞组成6。尽管已有抗血小板药物和抗凝药物可用于调控血栓形成，但这些疗法仍存在异常出血的主要风险，因此需要精细调整药物剂量和组合方案。因此，发现新的抗血栓药物仍是一项紧迫的需求7。
血栓形成的研究采用多种方法诱导血管损伤：机械性损伤（血管结扎）、热损伤（激光损伤）和化学性损伤（FeCl₃）
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方案
本文讨论的所有实验均经肯塔基大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）审查并批准。
注意：手术器械列于图1及材料表中。实验使用8至10周龄的C57BL/6J小鼠，性别为雄性/雌性，或相关的基因操作（敲除或敲入）品系。
1. FeCl3诱导的颈动脉损伤
- 小鼠麻醉诱导
- 称量小鼠体重。
- 通过腹腔注射（i.p.）0.2 g/kg 三溴乙醇溶液使小鼠麻醉。注射前确保麻醉液处于室温（RT）。此剂量足以使小鼠镇静约 1 小时。
- 注射后5分钟，通过捏压小鼠脚趾检查趾反射，以确认小鼠是否已进入镇静状态。若小鼠未镇静，会将脚趾缩回。若出现此情况，需等待5分钟后再次检查。
- 如果小鼠仍未完全镇静，可追加初始剂量的1/4，并等待5分钟。
- 在整个操作过程中，应定期通过夹捏脚趾来监测小鼠的麻醉深度。此外，还可监测呼吸频率和体温，以维持最佳的麻醉状态。
- 固定小鼠
- 将小鼠仰卧置于加热垫（37 °C）上 并使用胶带固定四肢。
- 使用外科缝合线（0.1 mm）轻轻牵拉小鼠上颌前....
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结果
数据通常以闭塞时间或形成完全闭塞性血栓所需的时间来表示。这些数据可绘制为Kaplan-Meier生存曲线（图4A）19，也可绘制为点图，图中柱状条表示在血流停止或实验终止时的末梢血流水平（图4B），或以折线图形式展示（图4C）。该技术也可用于研究血栓的稳定性。在大多数情况下，经FeCl3损伤后，血栓逐步形成，随着血栓增大，血流逐渐减少，直至血管完全闭塞时血流降至零。在某些情况下，血流在持续数分钟的逐渐下降后突然回升，此现象被解释为生长中血栓的部分脱落，可视为一次栓塞事件（图4D）。此外，也可利用该方法研究闭塞性血栓的形态学特征（图7A）。
表1：FeCl实验中的潜在技术挑战3诱导的.......
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讨论
局部应用FeCl3作用于血管以诱导血栓形成是一种广泛使用的技术，已在此前研究中对明确多种血小板受体、配体信号通路及其抑制剂的作用发挥了关键作用20,21,22,23。FeCl3诱导血栓形成的机制是多方面的；过去认为内皮剥脱是导致血栓形成的原因，但近年来多项研究表明红细胞和血浆蛋白在此过程中亦发挥重要作用24,25,26,27。
本方案中最关键的步骤包括：放置多普勒探头以获得最佳血流信号、滤纸的放置，以及及时终止损伤以取出样本并立即进.......
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披露
作者声明本研究无利益冲突。
ORCID 资料：S.J.：0000-0001-6925-2116；S.W.W.：00000-0001-5577-0473。
致谢
作者感谢Whiteheart实验室成员对本文稿的仔细审阅。本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）、国家心肺血液研究所（NHLBI）（资助号HL56652、HL138179和HL150818）、美国退伍军人事务部杰出研究奖（授予S.W.W.）、R01 HL155519（授予B.S.）以及国家生物医学影像与生物工程研究所（NIBIB）院内研究项目基金对R.D.L.的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 氯化钠溶液 | Fisher Scientific | BP358-212 | 用于配制0.9%氯化钠溶液的NaCl |
| 1 mL 注射器 | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 证明乙醇 | KOPTEC | V1101 | 用于配制70%乙醇溶液，以在手术前对小鼠进行消毒处理 |
| 2,2,2 三溴乙醇 | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 码黑色编织丝线缝合线（5-0） | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G × 3/8 针头 | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-甲基-2-丁醇 | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL 移液管，刻度至3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| 酒精擦拭垫（70% 异丙醇） | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| 细胞培养皿 35 mm × 10 mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| 紧凑型天平 | Ward's Science | 470314-390 | |
| 解剖剪刀，12.5 cm 长 | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 活化剂 | Electron microscopy Services | 13600 | |
| 十二烯基琥珀酸酐 / DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| 宠物粪便袋 / 动物尸体处理袋 | Crown Products | PP-RB-200 | |
| 多普勒血流探头 | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 树脂 | Electron microscopy Services | 14900 | |
| 无水乙醇，200 证明 | Electron microscopy Services | 15055 | |
| 眼科敷料镊，4" 全弧形，标准型，0.8 mm 宽头 | Integra Miltex | 18-784 | |
| 滤纸 | VWR | 28310-106 | |
| 精细剪刀 — 尖头-钝头 | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 指环式耳标打孔器 | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| 纱布海绵 2” × 2” – 12 层 | Dukal Corporation | 2128 | |
| 戊二醛（10% 溶液） | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex 碳钢手术刀片 #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| 三氯化铁 | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| 刀柄 Miltex® 超细不锈钢 3 号 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-天冬氨酸 | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-天冬氨酸 | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| 硝酸铅 | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 显微镜 | LEICA | 不再提供 | 公司已不再供货 |
| LEICA S8AP0 显微镜支架 | LEICA | 10447255 | 公司已不再供货 |
| 轻型组织擦拭纸 | VWR | 82003-822 | |
| 显微解剖镊；1×2 齿，全弧形；0.8 mm 尖端宽度；4" 长度 | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| 四氧化锇 4% 水溶液 | Electron microscopy Services | 19150 | |
| 多聚甲醛（16% 溶液） | Electron microscopy Services | 15710 | |
| 铁氰化钾 | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| 环氧丙烷，ACS 试剂 | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic 移液器 PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| 研究型流量计 | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | 型号：T402 |
| Scotch Magic 透明胶带，3/4" × 1000"，透明 | Scotch | 305289 | |
| 小型动物加热垫 | K&H Manufacturing Inc. | 型号：HM10 | |
| 0.2 M 二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| 无菌棉签 | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster 照明器 | Fisher Scientific | 12-562-21 | 公司已不再供货 |
| 外科 Dumont #7 镊子 | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| 硫羰基肼（TCH） | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| 通用低吸附移液器吸头补充装（0.1–10 µL） | VWR | 76323-394 | |
| 醋酸铀酰 | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet 凝胶乳霜脱毛膏 | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| 白色抗静电六角称量皿，中号，64 × 15 × 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| 适用于 Windows 的 WinDAQ/100 软件 | DATAQ Instruments, Inc. | 版本 3.38 | 可免费下载。https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
参考文献
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al.
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