生成基因修饰的Plasmodium berghei子孢子

摘要

疟疾通过子孢子阶段的接种传播 疟原虫 通过感染的蚊子传播。转基因 疟原虫 使我们能够更深入地理解疟疾的生物学特性，并直接推动了疟疾疫苗的研发工作。在此，我们描述了一种简化的转基因制备方法 疟原虫伯氏疟原虫 子孢子

摘要

疟疾是一种由寄生虫引起的致命疾病 疟原虫 并通过雌性蚊虫的叮咬传播 按蚊属 蚊子。疟原虫的子孢子阶段 疟原虫 由蚊子注入脊椎动物宿主皮肤的疟原虫会在肝脏中经历一个必需的发育阶段，之后才会引发临床疟疾。我们对这一阶段的生物学特性知之甚少。 疟原虫 肝脏中的发育；获取子孢子阶段以及能够对这些子孢子进行遗传修饰是研究其生物学特性的重要工具 疟原虫 感染及其在肝脏中引发的免疫反应。在此，我们提供了一种转基因小鼠制备的全面方案 疟原虫伯氏疟原虫 子孢子。我们对裂殖体阶段进行基因改造 P. berghei 并使用此形式进行感染 按蚊属 蚊虫吸血时。在转基因寄生虫于蚊体内发育后，我们从蚊子的唾液腺中分离出寄生虫的子孢子阶段，用于后续研究。 体内 和 体外 实验。我们通过产生一种新型菌株的子孢子来验证该方案的有效性 P. berghei 表达绿色荧光蛋白（GFP）亚基11（GFP₁₁，并展示其在肝期疟疾生物学研究中的应用。

引言

尽管在药物研发以及疟疾预防和治疗研究方面已取得进展，全球疟疾的疾病负担仍然很高。每年有超过50万人死于疟疾，其中死亡率最高的是生活在疟疾流行地区（如撒哈拉以南非洲）的儿童¹疟疾由疟原虫寄生虫引起 疟原虫，通过雌性蚊虫叮咬传播给人类 按蚊属 唾液腺中携带寄生虫的蚊子。该寄生虫的感染阶段 疟原虫子孢子在吸血过程中被注入脊椎动物宿主的皮肤，随后经血液循环迁移至肝脏细胞并建立感染，在此经历必需的发育阶段（即疟疾的红细胞前体期），之后再感染红细胞。红细胞的感染标志着疟疾血液期的开始，并导致该疾病相关的全部发病与死亡。^2,3.

红细胞前阶段发育的专性特性 疟原虫 使其成为预防性疫苗和药物研发的有吸引力靶点⁴研究红细胞前疟疾生物学以及开发靶向肝期的疫苗或药物，其前提是能够获得 疟原虫 子孢子。此外，我们能够产生基因修饰的 疟原虫 子孢子在这些研究工作的成功中起到了关键作用^5,6,7,8,9转基因 疟原虫 表达荧光或生物发光报告蛋白的细胞系使我们能够追踪其发育过程 体内 和 体外^10,11. 通过缺失多个基因而产生的遗传减毒寄生虫（GAPs）， 疟原虫，也是最有希望的疫苗候选者之一^12,13.

啮齿类和非人灵长类疟疾模型帮助我们理解了人类疟疾中宿主与寄生虫相互作用的机制，这得益于不同疟原虫在生物学特性与生活史上的相似性 疟原虫 物种¹⁴的使用 疟原虫 感染啮齿类动物但不感染人类的物种（例如， P. berghei可在生物安全等级1的受控环境中维持疟原虫完整的生活周期，并产生具有感染性的子孢子，用于肝期疟疾的研究。目前已存在多种独立的实验方案，用于转基因红内期疟原虫的制备 疟原虫 寄生虫¹⁵，蚊虫感染¹⁶和子孢子的分离¹⁷在此，我们概述了一种综合性的实验方案，结合上述方法以生成并分离转基因个体 P. berghei 子孢子，利用新型转基因菌株 PbGFP₁₁ 例如. PbGFP₁₁ 转运超折叠绿色荧光蛋白（GFP）的第11个β-链，GFP₁₁, 进入宿主肝细胞内形成的寄生泡（PV）。 PbGFP₁₁ 与表达构成GFP 1-10片段（GFP_1-10) 在细胞质中（Hepa GFP_1-10 细胞） PbGFP₁₁ 通过自互补作用及功能性GFP的重新形成，在宿主肝细胞中报告PV裂解并产生绿色荧光信号¹⁸值得注意的是，GFP₁₁ 以七段串联序列的形式编码 PbGFP₁₁ 以增强最终的荧光信号。染色后 PbGFP₁₁ 用细胞质染料CellTrace Violet（CTV）标记子孢子后，可对寄生虫进行追踪。此类经CTV染色的细胞内寄生虫发生裂解时，CTV会释放到宿主细胞胞质中，从而标记宿主细胞。此外，该方法还可用于观察和区分寄生虫的裂解过程 疟原虫 PV和/或宿主肝细胞中的寄生虫，该系统可被可靠地用于通过遗传学或治疗性干预这些通路的分子组分，来研究负责上述任一过程的免疫通路。

方案

本实验室所有涉及脊椎动物的研究均按照乔治亚大学动物使用指南和方案进行。

1. 伯氏疟原虫（P. berghei）感染小鼠的制备

1. 使用野生型P. berghei寄生虫在6至8周龄的雄性或雌性C57BL/6（B6）小鼠中启动血液阶段感染。具体操作为：将冻存的P. berghei感染血液（含2 × 10⁵个感染红细胞），用400 µL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬后，通过腹腔内（i.p.）注射方式接种至一只或两只供体小鼠。
2. 在感染后第5天（d.p.i.），通过眶后采血法采集供体小鼠的新鲜血液，并将其转移至两只未经感染的B6小鼠体内。具体操作为：采集200 µL血液，加入300 µL PBS重悬，随后向每只受体小鼠腹腔内注射200 µL。确保此时供体小鼠的寄生虫血症水平为2%–5%^19,20。
3. 从受体小鼠感染后第2天（d.p.i.）开始，按照先前描述的方法监测寄生虫血症^19,20。当寄生虫血症达到3%–5%（约在感染后第5天）时，实施安乐死并经心脏穿刺或眶后采血收集血液。安乐死方法可采用二氧化碳吸入后行颈椎脱位，或依照机构相关规定执行。
   ​注意：一旦寄生虫血症超过5%，由于多重感染红细胞的比例增加，转染效率可能降低。

2. 体外培养裂殖子的制备

1. 在无菌环境下，从步骤1.3中的感染小鼠采集血液（两只小鼠共约2 mL），加入5 mL阿氏液（见材料表）。步骤2.1至3.12均需在无菌条件下进行。
   注意：无菌条件包括佩戴手套、用70%乙醇擦拭手套和操作表面、使用无菌耗材和试剂，并在生物安全柜内操作。
2. 将血液在室温下以450 × g 离心8分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL完全RPMI培养基中（RPMI 1640，含20%胎牛血清[FBS]和1%青霉素-链霉素，v/v）。
3. 在室温下以450 × g 离心8分钟。将沉淀重悬于25 mL完全RPMI培养基中，转移至带滤膜盖的T75培养瓶中。
4. 置于36.5 °C、5% CO₂ 的培养箱中，轻轻振荡以保持细胞悬浮，培养16小时。
5. 在培养16小时时，检查裂殖体发育情况。取500 µL样品，以450 × g 离心8分钟，将沉淀重悬于10 µL完全RPMI培养基中，制备薄血涂片。用吉姆萨染液¹⁹（见材料表）染色血涂片，并确定裂殖体的频率（图1）。
6. 为获得最佳转染效率，应有60%–70%的寄生虫处于裂殖体阶段。若低于此阈值，则继续按步骤2.4进行培养，并每小时检查一次，确保达到上述阈值后再进行后续操作。

3. 转染Plasmodium裂殖体

1. 通过在50 mL离心管中将13 mL密度梯度储存液（参见材料表）与1.44 mL 1.5 M NaCl和5.6 mL 0.15 M NaCl混合，配制梯度离心缓冲液。
2. 将25 mL血液培养物转移至一个新的50 mL离心管中。使用细口玻璃移液管，小心地将20 mL梯度离心缓冲液沿管壁缓慢加入离心管底部，形成梯度层。注意不要扰动液体层及界面，确保缓冲液与培养基之间有清晰的分界。
3. 在室温下以450 × g 离心20分钟，不启用刹车。使用巴斯德移液管小心吸取位于培养基与梯度离心缓冲液界面处的裂殖体层¹⁵，并将其转移至一个新的50 mL离心管中。
4. 用完全RPMI培养基重悬分离得到的裂殖体，并将总体积调至40 mL。在室温下以450 × g 离心8分钟，弃去上清液。
5. 用10 mL完全RPMI培养基重悬裂殖体。然后，为每次转染分别取1 mL该悬液加入1.5 mL微量离心管中，并以16,000 × g 离心5秒，使感染的红细胞沉淀。以上述方法从两只小鼠获得的感染红细胞可用于最多10次独立的转染实验。
6. 在室温下，为每次转染分别在独立的1.5 mL微量离心管中将100 µL电穿孔缓冲液（电穿孔试剂盒中的核转染溶液；参见材料表）与5 µg环状或线性化目标质粒DNA（体积不超过10 µL）混合。每次实验必须设置一个"无质粒"对照样本，用于转染和抗生素筛选的对照。
7. 离心后弃去步骤3.5中的上清液，小心地将感染的红细胞重悬于已配制好的核转染溶液+质粒DNA（来自步骤3.6）中。
8. 将悬液（核转染溶液 + 质粒 + 裂殖体；最大体积110 µL）转移至电穿孔比色皿中。使用合适的核转染程序（U-033，参见材料表）进行转染。
   注意：确保步骤3.8至3.10在室温下操作。
9. 向比色皿中加入100 µL完全RPMI培养基，将全部溶液（总体积现为200 µL）转移至1.5 mL微量离心管中，并在室温下保存。
10. 将200 µL转染后的寄生虫溶液经尾静脉（i.v.）注射入小鼠体内，操作过程中应尽量缩短从转染完成到注射结束的时间。
    ​注意：为最大限度提高实验效率，转染后的裂殖体应在电穿孔后5分钟内注射入小鼠体内。

4. 转染寄生虫的筛选

1. 从接种后第2天开始，每天检测接种了转染裂殖体的小鼠的寄生虫血症水平，以确认感染情况。
2. 一旦确认感染，即开始通过饮水口服给药的方式进行药物筛选，提供含药物的饮用水 随意摄取.
   注意：本实验使用乙胺嘧啶作为质粒的可筛选药物标记。在此情况下，将17.5 mg乙胺嘧啶加入250 mL洁净水中（终浓度为70 mg/L）。此外，向该水中加入10 g蔗糖，以促进小鼠充分摄入含乙胺嘧啶的饮水。
3. 从乙胺嘧啶处理开始后的第6天起，每隔两天使用5 µl血液制备血涂片，监测寄生虫血症。若15天后仍未检测到寄生虫，则表明转染失败；此时应从步骤1.1重新开始，进行新一轮尝试。
4. 当寄生血症达到至少1%时，将寄生虫转移至 naive B6 小鼠，以建立血液期寄生虫种子库。在新感染的小鼠中继续筛选，直至寄生血症达到2%–5%，此时制备种子库并进行冷冻保存²¹.

5. 蚊子感染转基因品系

1. 通过尾静脉注射，用含有选定寄生虫的200 µL血液感染B6小鼠（每只小鼠接种2 × 10⁵个感染红细胞）。在蚊子饲喂和感染当天测定这些小鼠的寄生虫血症水平。2%–5%的寄生虫血症水平最适合蚊子感染。确认后，立即按照步骤5.2–5.4将感染转移至雌性Anopheles stephensi蚊子。
   注意：用于感染蚊子的培养箱应维持在20.5 °C、80%湿度，并保持12小时光照/12小时黑暗的循环（光照时间为上午07:00至晚上07:00）。
2. 在蚊子感染前一天，通过在同时饲养雄性和雌性蚊子的笼子上方放置热源（例如装有加热至37 °C水的薄塑料袋或手套）来分离雌性蚊子。使用昆虫吸虫器移除被热源吸引的雌性蚊子，并将其转移到另一个较小的独立笼子中用于感染。
   注意：雄性蚊子可通过其略小的体型和羽状触角与雌性蚊子区分。
3. 给感染的小鼠注射全身麻醉剂（例如2%三溴乙醇/阿佛丁）。通过用力捏压每只小鼠的足垫来确认是否完全麻醉。若小鼠无反应，则表明已充分镇静，可进行蚊子感染操作。
4. 将麻醉后的小鼠腹侧朝下放置在装有雌性蚊子（来自步骤5.2）的笼子上方。手动分开小鼠的前后肢，以提供最大的蚊子取食表面积。每笼小鼠放置15分钟，每隔5分钟检查一次，确保小鼠未苏醒。取食完成后，采用颈椎脱臼法或根据机构动物使用规程对小鼠实施安乐死，并安全处理尸体。

6. 子孢子的收集

1. 在感染后约10天检查蚊子中肠中的卵囊，以确认感染成功及发育情况 疟原虫 在蚊虫体内，用镊子去除腹部末端节段，从腹部分离出蚊虫中肠。在偏振光下观察中肠，检查是否存在卵囊。²².
2. 野生型子孢子预计在蚊子吸食感染小鼠血液后18至21天出现在其唾液腺中。在第18天，解剖5至10只蚊子以评估子孢子数量。
   注意：蚊子用乙醇清洗并处死。随后，将死亡的蚊子用PBS洗涤两次，以在解剖前去除碎片。
3. 为了分离并计数子孢子，使用镊子或细解剖针轻轻按压蚊子的胸部，同时小心移除蚊子头部。唾液腺将随被移除的头部一起取出。图2).
4. 去除唾液腺上的其他蚊虫碎片，将其放入含有 400 µL 蚊子解剖液（DMEM 培养基 [Dulbecco's modified Eagle medium]，添加 1% 小鼠血清、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）的微量离心管中；参见 材料表).
5. 将分离的唾液腺通过30 G针头注射器反复推注15–20次以破碎组织。取10 µL破碎后的唾液腺悬液加入蚊子解剖液，置于血细胞计数板中进行计数。根据实验需要，用适当浓度的蚊子解剖液或PBS重悬，用于注射小鼠、接种细胞培养或长期冷冻保存。^23,24.

结果

确定裂殖体的频率及其发育状态对于确保有足够数量且处于最佳转染阶段的活性寄生虫至关重要。未成熟的裂殖体与完全成熟的裂殖体可通过其内部裂殖子数量的多少进行区分：未成熟裂殖体所含裂殖子较少，且未充满红细胞内的全部空间（图1B）。需要注意的是，在从培养血液制备血涂片时，感染的红细胞可能破裂，导致在血涂片中观察到游离于细胞外的裂殖子（图1）。此类游离裂殖子在步骤2.5中不计入裂殖体频率的评估。

对于不熟悉蚊子生理结构或微型解剖操作的研究人员而言，从蚊子中分离唾液腺可能具有挑战性。在分离蚊子唾液腺的过程中，应注意唾液腺具有半透明特性，可借此将其与不透明的蚊体残渣区分开来（图2）。在破坏唾液腺后计数子孢子时，以400倍放大倍数进行观察效率最高，而使用相差显微镜可更清晰地识别计数室内的子孢子。

我们已证明，肝细胞中超过90%的Plasmodium可...

讨论

我们已在实验室中使用上述方案构建了多个转基因品系 P. berghei 寄生虫。尽管已针对 P. berghei，我们还成功地利用该方案制备了转基因 P. yoelii 子孢子。将转染的裂殖体注射入小鼠后，通常在感染后3天内即可在所有组别（包括无质粒对照组）检测到寄生虫。只有在检测到寄生虫血症后才开始药物筛选，以确保电穿孔后寄生虫的存活能力。此外，在进行药物筛选前，可能需要用盐酸酸化饮水，使pH降至4，以确保乙胺嘧啶充分溶解。 我们预期无质粒对照组小鼠体内的寄生虫将被完全清除，而转染组小鼠则持续保持感染状态。对照组小鼠体内的寄生虫通常在开始乙胺嘧啶治疗后5至8天内被清除。值得注意的是，感染了 P. berghei 可能出现实验性脑型疟疾的体征并死亡（应根据人道终点标准进行处理） 机构动物使用指南），通常在感染后6-12天进行。通过在TCRaKO小鼠中对转染子实施药物筛选可避免此问题。²⁵，或通过将感染后第5天正在接受筛选的寄生虫转移至新的B6受体小鼠，并在后者中继续筛选。转基因技术在 疟原虫...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30 G x 1/2" 注射器针头	Exel international	26437
Alsever溶液	Sigma-Aldritch	A3551-500ML
Amaxa 基本寄生虫核转染试剂盒 2	Lonza	VMI-1021
Avertin（2,2,2-三溴乙醇）	TCI America	T1420
血液采集管	BD bioscience	365967	用于血清采集
C-Chip 一次性血细胞计数板	INCYTO	DHC-N01-5
CellVeiw 细胞培养皿	Greiner Bio-One	627860
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000107
Centrifuge 5910R	Eppendorf	5910R	用于梯度离心
Delta Vision II - 倒置显微镜系统	Olympus	IX-71
二甲基亚砜	Sigma	D5879-500ml
胎牛血清	GenClone	25-525
GFP11 质粒	Kurup Lab	pSKspGFP11	由 PL0017 质粒构建
吉姆萨染液	Sigma-Aldritch	48900-1L-F
Hepa GFP1-10 细胞	Kurup Lab	Hepa GFP1-10	由 Hepa 1-6 细胞（ATCC 目录号 CRL-1830）构建
小鼠血清			用于蚊子解剖培养基
NaCl	Millipore-Sigma	SX0420-5	用于 Percoll 溶液的 1.5 M 和 0.15 M 溶液
Nucleofector II	Amaxa Biosystems (Lonza)		使用程序 U-033 进行红细胞电穿孔
巴斯德吸管	VWR	14673-043
青霉素/链霉素	Sigma-Aldritch	P0781-100ML
Percoll（密度梯度储备液）	Cytivia	17-0891-02	详见实验方案
PL0017 质粒	BEI Resources	MRA-786
乙胺嘧啶（口服给药）	Sigma	46706	配制说明：将 17.5 mg 乙胺嘧啶加入 2.5 mL DMSO 中。必要时涡旋以完全溶解；用 HCl 将 225 mL 的 dH2O 调至 pH 4；将 DMSO 中的乙胺嘧啶加入水中并定容至 250 mL；加入 10 g 糖以促进小鼠规律饮用含药水。乙胺嘧啶对光敏感。处理小鼠时应使用棕色瓶或铝箔包裹的瓶子。
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
SoftWoRx 显微成像软件	Applied Precision	v6.1.3