生成基因修饰的Plasmodium berghei子孢子

摘要

疟疾通过子孢子阶段的接种传播 疟原虫 通过感染的蚊子传播。转基因 疟原虫 使我们能够更深入地理解疟疾的生物学特性，并直接推动了疟疾疫苗的研发工作。在此，我们描述了一种简化的转基因制备方法 疟原虫伯氏疟原虫 子孢子

摘要

疟疾是一种由寄生虫引起的致命疾病 疟原虫 并通过雌性蚊虫的叮咬传播 按蚊属 蚊子。疟原虫的子孢子阶段 疟原虫 由蚊子注入脊椎动物宿主皮肤的疟原虫会在肝脏中经历一个必需的发育阶段，之后才会引发临床疟疾。我们对这一阶段的生物学特性知之甚少。 疟原虫 肝脏中的发育；获取子孢子阶段以及能够对这些子孢子进行遗传修饰是研究其生物学特性的重要工具 疟原虫 感染及其在肝脏中引发的免疫反应。在此，我们提供了一种转基因小鼠制备的全面方案 疟原虫伯氏疟原虫 子孢子。我们对裂殖体阶段进行基因改造 P. berghei 并使用此形式进行感染 按蚊属 蚊虫吸血时。在转基因寄生虫于蚊体内发育后，我们从蚊子的唾液腺中分离出寄生虫的子孢子阶段，用于后续研究。 体内 和 体外 实验。我们通过产生一种新型菌株的子孢子来验证该方案的有效性 P. berghei 表达绿色荧光蛋白（GFP）亚基11（GFP₁₁，并展示其在肝期疟疾生物学研究中的应用。

引言

尽管在药物研发以及疟疾预防和治疗研究方面已取得进展，全球疟疾的疾病负担仍然很高。每年有超过50万人死于疟疾，其中死亡率最高的是生活在疟疾流行地区（如撒哈拉以南非洲）的儿童¹疟疾由疟原虫寄生虫引起 疟原虫，通过雌性蚊虫叮咬传播给人类 按蚊属 唾液腺中携带寄生虫的蚊子。该寄生虫的感染阶段 疟原虫子孢子在吸血过程中被注入脊椎动物宿主的皮肤，随后经血液循环迁移至肝脏细胞并建立感染，在此经历必需的发育阶段（即疟疾的红细胞前体期），之后再感染红细胞。红细胞的感染标志着疟疾血液期的开始，并导致该疾病相关的全部发病与死亡。^2,3.

红细胞前阶段发育的专性特性 疟原虫 使其成为预防性疫苗和药物研发的有吸引力靶点⁴研究红细胞前疟疾生物学以及开发靶向肝期的疫苗或药物，其前提是能够获得 疟原虫 子孢子。此外，我们能够产生基因修饰的 疟原虫 子孢子在这些研究工作的成功中起到了关键作用^5,6,

方案

本实验室所有涉及脊椎动物的研究均按照乔治亚大学动物使用指南和方案进行。

1. 伯氏疟原虫（P. berghei）感染小鼠的制备

1. 使用野生型P. berghei寄生虫在6至8周龄的雄性或雌性C57BL/6（B6）小鼠中启动血液阶段感染。具体操作为：将冻存的P. berghei感染血液（含2 × 10⁵个感染红细胞），用400 µL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬后，通过腹腔内（i.p.）注射方式接种至一只或两只供体小鼠。
2. 在感染后第5天（d.p.i.），通过眶后采血法采集供体小鼠的新鲜血液，并将其转移至两只未经感染的B6小鼠体内。具体操作为：采集200 µL血液，加入300 µL PBS重悬，随后向每只受体小鼠腹腔内注射200 µL。确保此时供体小鼠的寄生虫血症水平为2%–5%^19,20。
3. 从受体小鼠感染后第2天（d.p.i.）开始，按照先前描述的方法监测寄生虫血症^19,20。当寄生虫血症达到3%–5%（约在感染后第5天）时，实施安乐死并经心脏穿刺或眶后采血收集血液。安乐死方法可采....

结果

确定裂殖体的频率及其发育状态对于确保有足够数量且处于最佳转染阶段的活性寄生虫至关重要。未成熟的裂殖体与完全成熟的裂殖体可通过其内部裂殖子数量来区分：未成熟裂殖体所含裂殖子较少，且未充满红细胞内的全部空间（图1B）。需要注意的是，在从培养血液制备血涂片时，感染的红细胞可能会破裂，导致在血涂片中观察到游离的细胞外裂殖子（图1）。此类裂殖子不应计入步骤2.5中裂殖体频率的评估。

对于不熟悉蚊子生理结构或微型解剖操作的研究人员而言，从蚊子中分离唾液腺可能具有挑战性。在分离蚊子唾液腺时，应注意唾液腺呈半透明状，可借此将其与不透明的蚊体碎片区分开来（图2）。在破坏唾液腺后计数子孢子时，使用400倍放大倍数最为高效，而采用相差显微镜则有助于在计数板中更清晰地识别子孢子。

我们已证明，肝细胞中超过90%的Plasmodium可能通过细胞内在免疫机制.......

讨论

我们已在实验室中使用上述方案构建了多个转基因品系 P. berghei 寄生虫。尽管已针对 P. berghei，我们还成功地利用该方案制备了转基因 P. yoelii 子孢子。将转染的裂殖体注射入小鼠后，通常在感染后3天内即可在所有组别（包括无质粒对照组）检测到寄生虫。只有在检测到寄生虫血症后才开始药物筛选，以确保电穿孔后寄生虫的存活能力。此外，在进行药物筛选前，可能需要用盐酸酸化饮水，使pH降至4，以确保乙胺嘧啶充分溶解。 我们预期无质粒对照组小鼠体内的寄生虫将被完全清除，而转染组小鼠则持续保持感染状态。对照组小鼠体内的寄生虫通常在开始乙胺嘧啶治疗后5至8天内被清除。值得注意的是，感染了 P. berghei 可能出现实验性脑型疟疾的体征并死亡（应根据人道终点标准进行处理） 机构动物使用指南），通常在感染后6-12天进行。通过在TCRaKO小鼠中对转染子实施药物筛选可避免此问题。²⁵，或通过将感染后第5天正在接受筛选的寄生虫转移至新的B6受体小鼠，并在后者中继续筛选。转基因技术在 疟原虫.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30 G x 1/2" 注射器针头	Exel international	26437
Alsever溶液	Sigma-Aldritch	A3551-500ML
Amaxa 基本寄生虫核转染试剂盒 2	Lonza	VMI-1021
Avertin（2,2,2-三溴乙醇）	TCI America	T1420
血液采集管	BD bioscience	365967	用于血清采集
C-Chip 一次性血细胞计数板	INCYTO	DHC-N01-5
CellVeiw 细胞培养皿	Greiner Bio-One	627860
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000107
Centrifuge 5910R	Eppendorf	5910R	用于梯度离心
Delta Vision II - 倒置显微镜系统	Olympus	IX-71
二甲基亚砜	Sigma	D5879-500ml
胎牛血清	GenClone	25-525
GFP11 质粒	Kurup Lab	pSKspGFP11	由 PL0017 质粒构建
吉姆萨染液	Sigma-Aldritch	48900-1L-F
Hepa GFP1-10 细胞	Kurup Lab	Hepa GFP1-10	由 Hepa 1-6 细胞（ATCC 目录号 CRL-1830）构建
小鼠血清			用于蚊子解剖培养基
NaCl	Millipore-Sigma	SX0420-5	用于 Percoll 溶液的 1.5 M 和 0.15 M 溶液
Nucleofector II	Amaxa Biosystems (Lonza)		使用程序 U-033 进行红细胞电穿孔
巴斯德吸管	VWR	14673-043
青霉素/链霉素	Sigma-Aldritch	P0781-100ML
Percoll（密度梯度储备液）	Cytivia	17-0891-02	详见实验方案
PL0017 质粒	BEI Resources	MRA-786
乙胺嘧啶（口服给药）	Sigma	46706	配制说明：将 17.5 mg 乙胺嘧啶加入 2.5 mL DMSO 中。必要时涡旋以完全溶解；用 HCl 将 225 mL 的 dH2O 调至 pH 4；将 DMSO 中的乙胺嘧啶加入水中并定容至 250 mL；加入 10 g 糖以促进小鼠规律饮用含药水。乙胺嘧啶对光敏感。处理小鼠时应使用棕色瓶或铝箔包裹的瓶子。
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
SoftWoRx 显微成像软件	Applied Precision	v6.1.3