测量小鼠原代皮层培养神经元中的轴突货物运输

摘要

本方案描述了轴突运输分析的完整流程。特别是，本文展示了如何计算不包括暂停时间在内的运输速度，以及如何使用开源软件“KYMOMAKER”进行可视化分析的方法。

摘要

神经元细胞是高度极化的细胞，通常具有多个树突和一个轴突。轴突的长度需要由马达蛋白介导高效的双向运输。已有大量研究表明，轴突运输功能障碍与神经退行性疾病相关。此外，多种马达蛋白之间协调作用的机制也一直是备受关注的研究课题。由于轴突内的微管具有单一方向性，因此更容易确定参与运输过程的马达蛋白类型。因此，阐明轴突内货物运输的机制，对于揭示神经退行性疾病的分子机制以及马达蛋白的调控机制至关重要。本文介绍了轴突运输分析的完整流程，包括小鼠原代皮层神经元的培养、编码货物蛋白的质粒转染，以及排除暂停效应后的运输方向与速度分析。此外，还介绍了开源软件“KYMOMAKER”，该软件可生成按运输方向区分的显迹图（kymograph），从而更直观地展示轴突运输过程。

引言

驱动蛋白家族成员和细胞质动力蛋白是沿细胞内微管运动以运输其 cargo 的马达蛋白¹。大多数驱动蛋白向微管的正端移动，而动力蛋白则向微管的负端移动。神经元轴突中 cargo 运输的功能与机制已被广泛研究。由于轴突长度较长，需要稳定的长距离运输以维持神经元的健康。线粒体、自噬体以及含有淀粉样β蛋白前体（APP）的囊泡在运输过程中的缺陷已被报道为神经退行性疾病的成因^2,3。大量体外（in vitro）研究表明了马达蛋白协同运输的机制，多种使用纯化马达蛋白和微管的研究揭示了马达分子如何沿微管移动^4,5。通常，单个 cargo 上会结合多个马达蛋白⁶。然而，关于方向相反的马达蛋白如何决定 cargo 运输方向，目前存在几种模型。第一种是"结合/解离模型"，在此模型中，单向运输期间仅有一种方向性的马达蛋白与 cargo 结合。第二种为"协调模型"，即两种马达均附着于同一 cargo，但仅有一侧的马达被激活。第三种是"拔河模型"，其中驱动蛋白与动力蛋白之间的力量平衡决定了运输方向^7,8,9。此外，已有若干研究报告指出，激活状态的马达蛋白数量及其平衡会影响体外（in vitro）条件下 cargo 运输的速度^8,10。

一个尚未解决的问题是，驱动蛋白或动力蛋白在活细胞中的这些活性是如何被调控的。先前的研究报道显示，轴突中的微管存在乙酰化修饰，且神经营养因子可增强轴突运输^11,12此外，不同类型的货物和货物衔接蛋白以相应的方式发挥着驱动蛋白激活剂的作用^13,14许多与运输囊泡的膜相关联，其功能受到翻译后修饰等信号的调控。¹⁵因此，在活细胞中观察运输方向和速度，可为货物运输的分子调控机制提供有价值的见解 体外 实验。通过观察轴突运输可以区分由驱动蛋白（kinesin）和动力蛋白（dynein）介导的运输。由于轴突中含有正端单向排列的微管¹⁶，货物由驱动蛋白进行顺向运输（即从胞体到轴突末端），由动力蛋白进行逆向运输（即从轴突末端到胞体）。

本研究描述了一种用于观察和分析原代培养神经元中轴突运输的方法。以含有膜蛋白——淀粉样前体蛋白（APP）、钙调蛋白-1/alcadein α（Alcα）和钙调蛋白-3/alcadein β（Alcβ）——的囊泡为例，详细说明了其轴突运输的观察步骤。已知含有APP的囊泡的顺向运输速度明显快于含有Alcα的囊泡，尽管两者均由驱动蛋白-1驱动^17,18,19。在以往的研究中，已有多种方法用于测量运输速度，其中最具差异性的步骤是对运输过程中暂停现象的处理。在活细胞中，运输过程有时会受到微管路径上障碍物的阻碍；然而，分子马达可以绕过这些区域，可能伴随暂停，也可能不暂停²⁰。若计算较长观察时间内的平均速度，暂停现象可能导致速度估算偏低。本文介绍了一种基于分段（200 ms）运动分析的方法，以排除分子马达物理性暂停对速度计算的影响。最后，介绍了一款开源软件（仅支持Windows系统）"KYMOMAKER"²¹ 。晕图（kymograph）被广泛用于可视化囊泡运输，可在无需播放视频的情况下清晰展示每种运输货物的运动方向。该软件通过在图像旋转过程中多次应用一维Watershed算法，从延时成像视频中生成晕图，从而高效且便捷地呈现精细结构。此外，KYMOMAKER能够根据运动轨迹的方向自动检测并高亮显示，有助于生成易于理解的示意图。

方案

实验经北海道大学动物研究委员会批准，遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南。本研究使用了雌性C57BL/6J小鼠（妊娠15.5天）。

1. 小鼠原代皮层培养神经元的制备

1. 加入0.1 mg/mL的聚-L-赖氨酸（poly-L-Lysin）至0.1 M Tris（三（羟甲基）氨基甲烷）-HCl（pH 8.5）中，注入8孔（No.1.0）玻璃底培养板（见 材料表在37 °C培养箱中孵育腔室至少1 h。
2. 用无菌水冲洗腔室至少三次，并在组织培养罩内风干。
3. 通过颈椎脱位法或按照机构批准的规定，在妊娠15.5天时处死孕鼠。
4. 用镊子夹住含有胚胎的子宫角，用剪刀分离出整个子宫角，并将其浸入预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，置于冰上。
5. 在冷的PBS中，使用尖头镊子分离胚胎，并去除胚胎上所有的羊膜。
6. 用新鲜的冷PBS再次洗涤胚胎。
   注意：每次分离过程中，应尽可能冲洗干净血液，并确保不损伤血管或胚胎。
7. 将胚胎置于冷的培养皿中经灭菌的纱布上，在体视显微镜下观察。
8. 分离脑组织。使用弯头尖镊的尖端切开胚胎头部的皮肤和颅骨。去除皮肤和颅骨，暴露脑的顶部和侧面。
9. 使用镊子的弯曲部分挖出整个脑组织，并将其浸入含有冰冻的1×Hanks平衡盐溶液（HBSS；10 mM HEPES [pH 7.6]，5.3 mM KCl，0.44 mM KH₂PO₄，0.34 mM Na₂HPO₄，1.26 mM MgSO₄，1.8 mM CaCl₂，4.2 mM NaHCO₃，5.6 mM D-葡萄糖，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素）的培养皿中₂PO₄，140 mM NaCl，4.2 mM NaHCO₃₃，0.34 mM Na₂HPO₄，39 mM D-葡萄糖和0.5 µg/mL 庆大霉素；参见 材料表).
10. 重复步骤 1.7–1.9，直至获得所需数量的脑组织。
    注意：通常为 5 x 10⁶ 至 2 × 10⁷ 每脑可获得的细胞数
11. 分离皮质²² 用镊子在冷的1×HBSS中从脑组织中取出皮层，并剥离脑膜。
12. 将皮层转移至一个新的含有冷的1×HBSS的培养皿中。使用手术刀将皮层切成两半或三等份。
13. 使用剪去尖端的1,000 µL枪头将皮质组织转移至15 mL离心管中，并去除多余的1x HBSS。
14. 加入100单位木瓜蛋白酶和200 µg脱氧核糖核酸酶I（DNase I），用5 mL木瓜蛋白酶稀释液（含5 mg/mL D-葡萄糖、0.2 mg/mL牛血清白蛋白和0.2 mg/mL L-半胱氨酸的1×PBS溶液）稀释后添加；参见 材料表每个胚胎加入适量溶液，于37 °C水浴中孵育15分钟。孵育期间每5分钟颠倒试管一次。
    注意：建议将木瓜蛋白酶在稀释液中预孵育。在37 °C水浴中孵育5分钟，然后加入DNase I。
15. 弃去溶液。加入 2 mL 20% 热灭活马血清（参见 材料表) 加入1× HBSS中，孵育1分钟。
16. 弃去溶液。用 4 mL 1x HBSS 重复冲洗组织两次。
17. 弃去溶液。每枚胚胎加入 0.5 mL 铺板培养基（含 2% B-27 补充剂、4 mM Glutamax、5% 热灭活马血清和 1× 青霉素-链霉素的 Neurobasal 培养基；参见 材料表).
    注意：在步骤 1.14–1.17 中，无需进行离心，因为切割后的皮质组织块会自行沉降至管底。请勿使用移液器，也不要吸取组织块。
18. 用剪去尖端的1,000 µL枪头或10 mL移液器轻柔重悬5至10次。
19. 用1,000 µL枪头轻轻重悬10次。
20. 250 × g 离心 g 室温（20-25 °C）孵育 3 分钟。
21. 吸除上清液，用1,000 µL枪头将每个胚胎重悬于0.5 mL铺板培养基中，轻轻吹打10次。
22. 将40 µm细胞筛置于50 mL离心管上，通过重力流过滤细胞悬液，收集滤过的细胞悬液于管中。
23. 计数细胞，并以每孔 2 × 10 的密度接种到培养板中⁴ 至 5 × 10⁴ 细胞/厘米²²，加入适量的铺板培养基。密度示例如下所示 补充图1.
24. 在体外培养第2天（Div. 2），更换一半培养基，换为含2% B-27补充剂、4 mM Glutamax和1×青霉素-链霉素的神经基础培养基，并加入5 µM的5-氟-2-脱氧尿苷（见 材料表).
25. 传代4次后，每隔2至3天用培养基更换一半的培养液。

2. 使用磷酸钙法将质粒转染至原代培养神经元

注意：所述体积适用于8孔玻璃底培养板中的0.8 cm²孔（参见材料表）。

1. 通过混合200 ng至2 µg编码荧光标记蛋白的质粒（pCAGGS中的APP-EGFP、pcDNA3.1¹⁸中的Alcα-EGFP或pcDNA3.1中的Alcβ-EGFP；参见补充表1）、6.2 µL的2 M CaCl₂以及无菌水，制备50 µL的DNA/CaCl₂溶液。
2. 将50 µL的2倍HEPES缓冲盐溶液（HBS）分装至新的离心管中。
3. 将6.2 µL的DNA/CaCl₂溶液加入2倍HBS溶液中，用移液器轻轻吹打10次以混匀。
4. 重复步骤2.3，直至所有DNA/CaCl₂溶液均转移完毕。
5. 室温孵育15分钟。
6. 收集玻璃底培养皿中的培养基，并更换为不含抗生素的新鲜培养基。
   注意：将收集的培养基保留在细胞培养箱中，直至步骤2.10。
7. 每孔以滴加方式加入50 µL的DNA/CaCl₂/HBS混合液至神经元中，继续培养1小时。
8. 在孵育期间，将含有DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）/Ham's F-12培养基的培养皿置于37 °C、10% CO₂的培养箱中，制备酸化培养基。
9. 转染后孵育1小时，用DMEM/Ham's F-12（酸化培养基）清洗原代神经元3次。
10. 将培养基更换为一半收集的培养基与一半新鲜培养基的混合液，在37 °C、5% CO₂条件下继续培养，直至进行显微镜观察。

3. 轴突运输的观察

1. 将配备TIRF（全内反射）显微镜的培养腔室（见材料表）预孵育至37 °C。
2. 若配备CO₂控制器，可在5% CO₂条件下直接使用培养基作为观察介质；若无此设备，则需更换为pH稳定的培养基（如Leibovitz L-15培养基，见材料表），并添加4 mM Glutamax和2% B-27补充剂。
3. 寻找一个已转染的细胞，然后识别出轴突。逐渐增大激光入射角，直至激光完全发生反射；随后缓慢减小角度，直至轴突内所有囊泡均清晰可见（伪TIRF模式）。以200 ms曝光时间连续采集150帧图像（共30秒）。
   注意：本实验采用伪TIRF照明方式以捕获轴突内全部囊泡。其他配备高速成像系统的显微镜亦可用于此目的。
   ​注意：每次记录时均需在文件名中注明轴突的方向。避免对初始轴突段或轴突末端区域进行观察。

4. 图像处理

1. 使用 MetaMorph 软件打开获取的图像（参见 材料表).
2. 打开 工具栏 > 测量 > 校准距离启用 "适用于所有打开的图像" 并输入像素的实际距离。
3. 打开 工具栏 > 显示 > 旋转. 勾选复选框以启用 "所有平面"旋转使轴突呈水平方向，轴突末端朝向右侧。
4. 开放 工具栏 > 区域 > 创建区域设置裁剪区域的大小，然后单击 创建将图像上出现的框放置在轴突区域以进行分析。将生成的图像序列保存为堆栈文件。
   注意：选择不包含失焦轴突或碎片的区域。
5. 打开 工具栏 > 显示 > 图形选择 校准标尺 以标记比例尺。选择 数据/时间 为图像添加时间戳。启用 "所有平面"将物体移动到适当的位置，然后点击 印章.
6. 打开 工具栏 > 堆叠 > 制作视频输入适当的帧率并选择 AVI另存为新文件。

使用 KYMOMAKER 绘制明场图像并检测轨迹

1. 下载 KYMOMAKER（参见 材料表）并打开 "Kymoanalysis.exe" 在 KYMOMAKER 文件夹中。
2. 打开 "kymoAnalysis.exe" 以显示主窗口（图1A）。选择 文件 > 加载 并打开生成的 AVI 视频。A "预览" 窗口将出现（图1B).
3. 在 生成明场显微图像的线扫描图（Kymograph） 标签 > 修剪 切片，输入用于裁剪的像素数值。裁剪效果将立即在图像中显示。 "预览" 窗口以便于轻松调节（图1C）。确认整个标尺和时间戳均已移除。
4. 点击 生成 按钮以生成kymograph（图1C）。KYMOMAKER 可检测每个 y 轴方向上的最亮像素 "预览" 保存该线扫图像 通过 文件 > 保存 > 正常Kymograph.
5. 为了检测kymograph中低强度的轨迹，点击 旋转显微图. 调整数量以适应 "旋转显微图" 部分，并通过点击查看结果 旋转显微图像分析 (图1D).
   注意： "旋转（度）" 是旋转分水岭算法的角度间隔²¹例如，10° 表示每 10° 执行一次分水岭算法，共执行 36 次，然后将结果合并 "旋转分水岭" 窗口
6. 为了在kymograph中检测顺向和逆向的示踪信号，在 检测 标签 > 目标 切片，选择 原始 如果尚未生成旋转显微图谱，请通过选择确保 旋转，所生成的旋转分水岭用于检测痕迹。选择 分水岭 在 "检测方法" 点击 检测 自动检测痕迹的按钮。
   注意：检测到的痕迹以线条标出 "工作状态" 窗口。转动 "遮蔽" 在原始的显微图像轨迹图上绘制轨迹。
7. 通过输入数字来检测顺行和逆行示踪 检测 > 过滤 > 速度 部分图1E，F通过输入0.4至7.0 µm/s检测顺向示踪轨迹。通过输入−0.4至−7.0 µm/s检测逆向示踪轨迹。
   注意：最低速度的设定取决于囊泡静止状态的定义。参见步骤 6.7。
8. 保存文件。

6. 确定速度

1. 打开 MetaMorph 软件。
   注意：ImageJ 中的 "manual tracking" 插件也可以以相同方式计算速度。
2. 打开步骤 4.4 中创建的文件。确保校准参数已适配图像。
3. 打开 工具栏 > 应用程序 > 轨迹追踪（Track Points）。点击 添加轨迹（Add Track）。找到一个顺向或逆向运输的囊泡，然后通过连续点击追踪其运动轨迹，直至运输结束。点击 完成（Done）。
4. 重复步骤 6.3，直到所有囊泡均被追踪完毕。
5. 点击 打开日志（open log） 以打开一个 CSV 文件。然后点击 日志文件（log file） 以显示 CSV 文件中的数据。
6. 保存该 CSV 文件。
7. 为计算不受暂停影响的分段速度，需从 "velocity" 列中移除等于或低于 0.37 µm/s 的计算速度。
   注意：囊泡可能因反常扩散而发生极短距离的移动，这类运动并非由马达蛋白驱动²³。为避免将此类运动纳入马达蛋白驱动速度的计算中，本实验方案中已将最低速度（1 像素/200 毫秒）从计算中剔除。
8. 每五帧（共 1 秒）计算一次分段平均速度。若剩余帧数少于五帧，则舍弃该部分速度数据。
9. 合并同一条件下的所有平均速度数据。生成直方图以直观展示速度分布情况。

结果

从E15.5小鼠皮层分离的原代培养神经元按所述方法接种于玻璃底培养皿中。例如，在原代皮层神经元中表达APP-EGFP、Alcα-EGFP或Alcβ-EGFP。已知APP和Alcα通过驱动蛋白-1在轴突中进行运输^2,17APP 与驱动蛋白-1 相互作用 通过 衔接蛋白 JIP1（JNK 相互作用蛋白 1），而 Alcα 直接结合 通过 其双W酸性基序。Alcβ属于Alcadein蛋白家族，仅含有一个W酸性基序²⁴每种蛋白质均转染至第5天的神经元，并在转染后14–16小时，使用全内反射荧光显微镜（TIRF）每200毫秒采集一次图像。在转染了APP-EGFP、Alcα-EGFP或Alcβ-EGFP的神经元轴突中均观察到多个移动的囊泡。补充视频 1-3，分别）。

使用 KYMOMAKER，分...

讨论

本文描述了一种用于分析轴突运输的方法，包括分段速度的计算和生成显微轨迹图（kymograph）。转染步骤中的一个关键环节是维持培养神经元的健康状态。本研究遵循Jiang和Chen²⁹所描述的转染方法，并进行了少量修改。轻柔混合DNA/CaCl₂溶液与2x HBS可减小沉淀物的颗粒大小，从而提高转染效率。为防止沉淀物对细胞造成损伤，使用酸化培养基对细胞进行冲洗。快速冲洗（两到三次）且无需孵育，即可充分去除细胞上的沉淀物。本实验中使用的是原代培养神经元；值得指出的是，通过手术结合共聚焦显微镜可在活体（in vivo）条件下观察小鼠坐骨神经中的运输过程²⁶，而近年来多光子显微镜的发展使得在小鼠脑内观察轴突运输成为可能²⁷。

Kymograph 被广泛用于可视化轴突运输的速度和方向。目前有多种工具可用于生成 kymograph，包括 Fiji 插件 KymographBuilder。其中一些工具，如 Kymo...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-氟-2-脱氧尿苷	Sigma-Aldrich	F0503
Apo TIRF 100x/1.49 OIL	尼康
B-27添加剂（50倍浓度），无血清	赛默飞世尔科技	17504044
牛血清白蛋白	和光	013-25773
CalPhos 哺乳动物转染试剂盒	Takara	631312
细胞筛  40 µm 尼龙	Falcon	352340
CoolSNAP HQ	光度测量
脱氧核糖核酸酶 I	Sigma-Aldrich	DN-25
D-葡萄糖	和光	041-00595
DMEM/Ham’F-12	和光	042-30555
Dumont No. 7 镊子	杜蒙特	7号
手术刀片	羽毛	11号
羽毛手术刀柄	羽毛	3号
庆大霉素	和光	079-02973
硫酸庆大霉素	和光	075-04913
GlutaMAX 补充剂	赛默飞世尔科技	35050061
HEPES	DOJINDO	342-01375
马血清，热灭活	赛默飞世尔科技	26050088
KCl	和光	163-03545
KH2PO4	和光	169-04245
KYMOMAKER			http://www.pharm.hokudai.ac.jp/shinkei/Kymomaker.html
L-15 培养基（Leibovitz）	Sigma-Aldrich	L5520
MetaMorph 版本 6.2r1	Metamorph
Na2HPO4	和光	197-02865
NaCl	和光	197-01667
NaHCO₃3	和光	191-01305
Neurobasal 培养基	赛默飞世尔科技	21103049
尼康 ECLIPSE TE 2000-E	尼康
Nunc Lab-Tek  8孔腔室盖玻片	赛默飞世尔科技	155411
木瓜蛋白酶	沃辛顿	LS003126
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	赛默飞世尔科技	15140122
聚-L-赖氨酸氢溴化物	Sigma-Aldrich	P2636-500MG
Trizma 碱	默克	T1194-10PAK	用水溶解配制成 0.1 M Tris-HCl（pH 8.5）