本方案描述了轴突运输分析的完整流程。特别是，本文展示了如何计算不包括暂停时间在内的运输速度，以及如何使用开源软件“KYMOMAKER”进行可视化分析的方法。
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本方案描述了轴突运输分析的完整流程。特别是，本文展示了如何计算不包括暂停时间在内的运输速度，以及如何使用开源软件“KYMOMAKER”进行可视化分析的方法。
神经元细胞是高度极化的细胞，通常具有多个树突和一个轴突。轴突的长度需要由马达蛋白介导高效的双向运输。已有大量研究表明，轴突运输功能障碍与神经退行性疾病相关。此外，多种马达蛋白之间协调作用的机制也一直是备受关注的研究课题。由于轴突内的微管具有单一方向性，因此更容易确定参与运输过程的马达蛋白类型。因此，阐明轴突内货物运输的机制，对于揭示神经退行性疾病的分子机制以及马达蛋白的调控机制至关重要。本文介绍了轴突运输分析的完整流程，包括小鼠原代皮层神经元的培养、编码货物蛋白的质粒转染，以及排除暂停效应后的运输方向与速度分析。此外，还介绍了开源软件“KYMOMAKER”，该软件可生成按运输方向区分的显迹图（kymograph），从而更直观地展示轴突运输过程。
驱动蛋白家族成员和细胞质动力蛋白是沿细胞内微管运动以运输其 cargo 的马达蛋白1。大多数驱动蛋白向微管的正端移动，而动力蛋白则向微管的负端移动。神经元轴突中 cargo 运输的功能与机制已被广泛研究。由于轴突长度较长，需要稳定的长距离运输以维持神经元的健康。线粒体、自噬体以及含有淀粉样β蛋白前体（APP）的囊泡在运输过程中的缺陷已被报道为神经退行性疾病的成因2,3。大量体外（in vitro）研究表明了马达蛋白协同运输的机制，多种使用纯化马达蛋白和微管的研究揭示了马达分子如何沿微管移动4,5。通常，单个 cargo 上会结合多个马达蛋白6。然而，关于方向相反的马达蛋白如何决定 cargo 运输方向，目前存在几种模型。第一种是"结合/解离模型"，在此模型中，单向运输期间仅有一种方向性的马达蛋白与 cargo 结合。第二种为"协调模型"，即两种马达均附着于同一 cargo，但仅有一侧的马达被激活。第三种是"拔河模型"，其中驱动蛋白与动力蛋白之间的力量平衡决定了运输方向7,....
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实验经北海道大学动物研究委员会批准，遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南。本研究使用了雌性C57BL/6J小鼠（妊娠15.5天）。
1. 小鼠原代皮层培养神经元的制备
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从E15.5小鼠皮层分离的原代培养神经元按所述方法接种于玻璃底培养皿中。例如，在原代皮层神经元中表达APP-EGFP、Alcα-EGFP或Alcβ-EGFP。已知APP和Alcα通过驱动蛋白-1在轴突中进行运输2,17APP 与驱动蛋白-1 相互作用 通过 衔接蛋白 JIP1（JNK 相互作用蛋白 1），而 Alcα 直接结合 通过 其双W酸性基序。Alcβ属于Alcadein蛋白家族，仅含有一个W酸性基序24每种蛋白质均转染至第5天的神经元，并在转染后14–16小时，使用全内反射荧光显微镜（TIRF）每200毫秒采集一次图像。在转染了APP-EGFP、Alcα-EGFP或Alcβ-EGFP的神经元轴突中均观察到多个移动的囊泡。补充视频 1-3，分别）。
使用 KYMOMAKER，分.......
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本文描述了一种用于分析轴突运输的方法，包括分段速度的计算和生成显微轨迹图（kymograph）。转染步骤中的一个关键环节是维持培养神经元的健康状态。本研究遵循Jiang和Chen29所描述的转染方法，并进行了少量修改。轻柔混合DNA/CaCl2溶液与2x HBS可减小沉淀物的颗粒大小，从而提高转染效率。为防止沉淀物对细胞造成损伤，使用酸化培养基对细胞进行冲洗。快速冲洗（两到三次）且无需孵育，即可充分去除细胞上的沉淀物。本实验中使用的是原代培养神经元；值得指出的是，通过手术结合共聚焦显微镜可在活体（in vivo）条件下观察小鼠坐骨神经中的运输过程26，而近年来多光子显微镜的发展使得在小鼠脑内观察轴突运输成为可能27。
Kymograph 被广泛用于可视化轴突运输的速度和方向。目前有多种工具可用于生成 kymograph，包括 Fiji 插件 KymographBuilder。其中一些工具，如 Kymo.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
本研究得到了日本科学研究费补助金（KAKENHI，项目编号：22K15270，青年研究）以及浅山生命科学基金会对YS的资助。我们衷心感谢北海道大学先进生命科学研究院分子细胞动力学实验室的木条正隆博士和北村明博士，他们提供了关键性的指导和专业知识，极大地推动了本研究的开展。全内反射荧光显微镜（TIRF）观测实验使用了安装在北海道大学先进生命科学研究院分子细胞动力学实验室的仪器，该仪器已注册于北海道大学创造性研究机构全球设施中心管理的开放设施系统（编号：AP-100138）。我们感谢日本福冈市九州大学信息科学与电气工程学院先进信息技术系人机交互实验室的内田诚一博士，他在Kymomaker软件的应用方面提供了组装支持。北海道大学药学研究院痴呆高级预防与研究中心得到了日本Medical Leaf有限公司的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-氟-2-脱氧尿苷 | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| Apo TIRF 100x/1.49 OIL | 尼康 | ||
| B-27添加剂（50倍浓度），无血清 | 赛默飞世尔科技 | 17504044 | |
| 牛血清白蛋白 | 和光 | 013-25773 | |
| CalPhos 哺乳动物转染试剂盒 | Takara | 631312 | |
| 细胞筛 40 µm 尼龙 | Falcon | 352340 | |
| CoolSNAP HQ | 光度测量 | ||
| 脱氧核糖核酸酶 I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-葡萄糖 | 和光 | 041-00595 | |
| DMEM/Ham’F-12 | 和光 | 042-30555 | |
| Dumont No. 7 镊子 | 杜蒙特 | 7号 | |
| 手术刀片 | 羽毛 | 11号 | |
| 羽毛手术刀柄 | 羽毛 | 3号 | |
| 庆大霉素 | 和光 | 079-02973 | |
| 硫酸庆大霉素 | 和光 | 075-04913 | |
| GlutaMAX 补充剂 | 赛默飞世尔科技 | 35050061 | |
| HEPES | DOJINDO | 342-01375 | |
| 马血清，热灭活 | 赛默飞世尔科技 | 26050088 | |
| KCl | 和光 | 163-03545 | |
| KH2PO4 | 和光 | 169-04245 | |
| KYMOMAKER | http://www.pharm.hokudai.ac.jp/shinkei/Kymomaker.html | ||
| L-15 培养基（Leibovitz） | Sigma-Aldrich | L5520 | |
| MetaMorph 版本 6.2r1 | Metamorph | ||
| Na2HPO4 | 和光 | 197-02865 | |
| NaCl | 和光 | 197-01667 | |
| NaHCO₃3 | 和光 | 191-01305 | |
| Neurobasal 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 21103049 | |
| 尼康 ECLIPSE TE 2000-E | 尼康 | ||
| Nunc Lab-Tek 8孔腔室盖玻片 | 赛默飞世尔科技 | 155411 | |
| 木瓜蛋白酶 | 沃辛顿 | LS003126 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | 赛默飞世尔科技 | 15140122 | |
| 聚-L-赖氨酸氢溴化物 | Sigma-Aldrich | P2636-500MG | |
| Trizma 碱 | 默克 | T1194-10PAK | 用水溶解配制成 0.1 M Tris-HCl（pH 8.5） |
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