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苍蝇复眼是阐明基本生物学机制的重要生物模型系统。使用该系统研究的一些机制包括:具有近乎全景视野的复眼视觉1;光敏G蛋白偶联受体2,3,4的生物物理学、蛋白质组装和生物发生;磷脂酶Cβ介导的信号转导系统5,6;天然组织中的 TRP 通道激活和调节 5,6;多蛋白信号复合物的组装和功能 7,8;肌醇-磷脂循环的分子结构、生化和功能 9,10;以及信号介导的信号蛋白亚细胞易位11,12。苍蝇复眼独特的解剖结构和光学特性已被广泛研究,揭示了基本的发育机制和视觉能力。
该方法集包括领先科学家的工作,他们开发并改进了研究苍蝇复眼中上述一些机制的方法。Muñoz等人描述了一种定量分析苍蝇眼光学排列的方法,该方法提供了复眼及其空间组织的准确描绘13。这种方法对于详细研究视觉信息的神经元处理至关重要。重要的是,已经有许多尝试来生产仿生假眼,这些尝试都依赖于对现有复眼的定量研究。Wagner等人利用深假瞳孔(复眼的一种独特光学现象)和高放大显微镜和角膜的光学中和来定位果 蝇 感光细胞内的eGFP标记蛋白14。该方法可以检测由于光感受器变性和重要信号蛋白的细胞定位和运输而导致的横纹肌结构缺陷。Gutorov等人利用来自整个眼睛或单个感光细胞的电生理测量来测量 体内 光色素状态的水平及其通过信号蛋白特定突变的调节15。该方法利用了光子吸收引起的视觉色素态(R)内的电荷位移,从而形成在黑暗中稳定的第二种色素态(M)。另一种方法使用熄灯后延长去偏振(PDA),利用视觉色素的暗双稳态特性以及苍蝇R态和M态吸收光谱的差异。由于PDA依赖于大量光色素的转化,因此即使是光色素生物发生中最轻微的缺陷也可能导致易于检测到的异常PDA。事实上,显示异常 PDA 的 果蝇 突变体导致了新信号蛋白的发现。这方面的一个突出例子是发现了由支架蛋白失活但无后电位 D (INAD)、眼特异性蛋白激酶 C (eyePKC)、磷脂酶 Cβ (PLCβ) 和瞬时受体电位 (TRP) 通道组成的新型蛋白质复合物。Liu 等人首次提出了一种纯化 果蝇 TRP 通道16 的技术。这种改良的亲和纯化方法使用基于INAD信号复合物组装机制的竞争策略。该策略能够纯化内源性 TRP 通道。根据该方法,首先用组氨酸标记与Ni珠结合的PLCβ片段,并用于拉下从 果蝇 头匀浆中获得的内源性INAD蛋白复合物。接下来,将用过度纯化的谷胱甘肽 S-转移酶 (GST) 标记的 TRP 片段添加到 Ni 磁珠中,以与与 INAD 结合的内源性 TRP 通道竞争。最后,使用尺寸排阻色谱法将上清液中标记的TRP通道片段与内源性TRP通道分离。Panda 等人报告了一种使用质谱法鉴定和量化 果蝇 感光细胞中几类脂质的灵敏技术17。PLCβ的激活对于光转导至关重要,因为这会导致磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PI(4,5)P2)在表面膜中水解。该反应最终导致 TRP 通道的激活。此外,PLCβ 活性导致许多脂质物质的产生。有人提出,其中几种脂质物种可能参与 TRP 激活,并在光感受器的功能组织中发挥关键作用,以优化感觉转导。在 Panda 等人 17 的研究中,通过分离含有控制特定脂质水平的缺陷酶的 果蝇 突变体来评估这些发现。
苍蝇复眼是阐明生物学基本机制的有用实验系统。果蝇 开发的强大遗传学方法可用于分析和发现参与果蝇光转导的信号蛋白。该方法集详细概述了研究苍蝇视觉基本机制的主要技术,包括复眼的解剖和光学分析以及感光细胞的分子成分和生化反应。视频文章还包括关于这些方法固有困难的重要建议。这种方法的收集也应该对该研究领域之外的科学家有益,因为这些技术可以适用于其他生物制剂。