本方案建立了一种利用显微镜研究可注射生物响应型水凝胶治疗效果的胶质母细胞瘤（GBM）切除后复发模型 体内.
方法文章
用于治疗性水凝胶研究的胶质母细胞瘤切除后复发模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
肿瘤复发是胶质母细胞瘤（GBM）预后不良的重要指标。目前许多研究致力于寻找有效的治疗策略，以预防GBM术后复发。生物响应型治疗性水凝胶因其能够实现药物的局部持续释放，常被用于GBM术后的局部治疗。然而，由于缺乏合适的GBM切除后复发模型，相关研究受到限制。本文建立并应用了一种GBM切除后复发模型，用于治疗性水凝胶的研究。该模型基于广泛应用于GBM研究的原位颅内GBM模型构建，通过对原位颅内GBM模型小鼠实施次全切除术，模拟临床治疗过程，并利用残留肿瘤来评估肿瘤再生长的大小。该模型构建简便，能更好地模拟GBM手术切除的实际情况，适用于多种GBM切除后局部复发治疗的研究。因此，该GBM切除后复发模型为开展针对术后复发的有效局部治疗研究提供了一种独特的GBM复发模型。
引言
胶质母细胞瘤（GBM）是所有中枢神经系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤1，2。手术是GBM患者的首选治疗方法，术后主要采用放化疗作为辅助治疗。然而，尽管接受了各种治疗，大多数GBM患者常在3至6个月内出现肿瘤复发3，4，5。因此，迫切需要开发更有效的治疗策略以防止GBM复发。
近期关于胶质母细胞瘤（GBM）的研究主要集中在原发性肿瘤，而非复发性肿瘤6。然而，临床上最常见且亟需解决的问题是如何抑制GBM术后复发。因此，针对GBM术后复发的研究需要得到更多关注。生物响应性治疗水凝胶是目前研究术后肿瘤复发最常用的载体7,8。然而，由于中枢神经系统具有特殊的结构，建立适用于GBM切除术后复发的模型十分困难9，而这类模型对于GBM复发研究至关重要。
本研究基于用于原发性胶质母细胞瘤（GBM）研究的原位颅内GBM模型，建立了一种改进的GBM切除术后复发模型。在该模型中，通过显微外科手术切除大部分肿瘤，残留肿瘤则通过以下方法检测： 体内 生物发光成像和苏木精-伊红（H&E）染色&E) 染色。该模型可模拟脑肿瘤患者的切除状态，适用于多种关于胶质母细胞瘤复发的研究。
方案
所有动物实验均经南京医科大学机构审查委员会和动物伦理委员会批准并监督（IACUC-1904004）。本研究采用6至8周龄的C57BL/6J雌性小鼠。实验动物购自商业来源（见材料表）。
1. 动物准备
- 称重小鼠，并通过腹腔注射 50 mg/kg 戊巴比妥钠进行麻醉（参见 材料表）。给予 术前镇痛使用美洛昔康（5 mg/kg；腹腔注射）。 将小鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环、环境温度24 °C、相对湿度50%的笼具中。
注意：本研究中，小鼠的初始体重约为22 g。 - 使用实验动物剃毛器去除小鼠头部的毛发，并将头部和四肢固定在立体定位仪上（参见 材料表).
注意：使用前对所有设备进行灭菌。 - 用氯己定或聚维酮碘溶液对小鼠头部进行消毒，至少交替擦拭三次，每次擦拭后用酒精冲洗 酒精，并用无菌手术巾覆盖小鼠。在两只眼睛上涂抹眼药膏以防止干燥。
- 用眼科剪在小鼠右侧前额顶部沿中线纵向剪开约1厘米的头皮切口。
注意：确认 通过足底反射消失判断手术麻醉平面 在做切口之前。 - 调节立体定位仪，确保人字缝与前囟点处于同一水平面。
2. 建立原位颅内胶质母细胞瘤模型
- 用蘸有龙胆紫的棉签标记前囟前方1 mm、前囟右侧1.8 mm以及前囟下方3 mm的位置2 （参见 材料表).
- 使用1 mm直径的微型颅骨钻进行钻孔（参见 材料表）以形成直径约1 mm、深度约1 mm的孔径。
- 用无菌棉签吸除渗出的脑脊液。
- 吸取 5 µL 肿瘤细胞悬液（GL261-Luci，5 × 105 用微量注射器将悬浮于5 µL PBS中的细胞注入。
注意：GL261-Luci 细胞系购自商业来源（参见 材料表). - 将微量注射器针尖垂直对准颅骨钻孔，插入至针尖进入颅骨平面3 mm，再回退0.5 mm7.
- 打开微量注射器，并以1 µL/min的速度注入。
- 注射后留针10分钟。
- 缓慢撤出微量注射器，并用无菌干棉球按压注射点。
- 用不可吸收外科缝线（10-0，参见 材料表），并再次对切口进行消毒。
- 监测动物健康状况，并将其置于温暖环境中。
- 小鼠苏醒后，将其放回饲养笼中。
- 对小鼠进行成像 体内 生物发光成像系统（参见 材料表) 用于在荷瘤后第10天检测移植瘤。
注意：使用负载荧光素酶的胶质母细胞瘤细胞 GL261 进行生物发光成像。- 使用1.5%异氟烷（氧气流速为0.6 L/min）对小鼠进行麻醉。通过脚掌反射消失确认麻醉深度后，经腹腔注射荧光素钾（10 mg/mL，参见 材料表，11 秒后，执行 体内 生物发光成像。当荧光值达到约 5 × 105，该操作是成功的。
注意： 麻醉动物 成像前通过鼻罩持续供给气化异氟烷以维持麻醉状态。
- 使用1.5%异氟烷（氧气流速为0.6 L/min）对小鼠进行麻醉。通过脚掌反射消失确认麻醉深度后，经腹腔注射荧光素钾（10 mg/mL，参见 材料表，11 秒后，执行 体内 生物发光成像。当荧光值达到约 5 × 105，该操作是成功的。
- 选择成功成瘤的小鼠以构建胶质母细胞瘤切除后复发模型。
3. 建立胶质母细胞瘤切除后复发模型
- 当原位颅内GBM模型小鼠的肿瘤大小达到约6.5 × 105选择用于术后复发模型的小鼠。
- 称重原位颅内GBM模型小鼠，并通过腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉小鼠。给予 美洛昔康（5 mg/kg；腹腔注射）用于围手术期镇痛。
- 重复步骤1.2−1.5的过程。
- 分离头皮组织与颅骨，检查用于构建原位颅内胶质母细胞瘤（GBM）模型的钻孔部位。若钻孔已愈合，需使用立体定位仪确定钻孔位置，并按照步骤2.1–2.3所述程序进行操作。
- 使用颅骨钻将孔径扩大至5 mm，并用无菌棉签吸除渗出的脑脊液。
- 将显微镜聚焦于小鼠头部，并调整设置以确保钻孔位于视野中央。
- 使用显微剪刀剪开脑膜，并在显微镜下用显微刮匙和显微刀切除部分肿瘤组织。
注意：关于脑膜，打开颅骨后，靠近脑组织的薄层膜状结构即为脑膜。 - 用无菌纱布止血，并用无菌生理盐水冲洗切口。
- 注射市售水凝胶（10 µL，参见 材料表) 用1 mL注射器将液体注入切除腔，使用不可吸收外科缝线（10-0）缝合头皮，并再次对切口进行消毒（图1).
- 监测动物的健康状况，并保持小鼠体温。
- 小鼠苏醒后，将其放回饲养笼中。
- 执行 体内 利用生物发光成像在移植后1天检测移植肿瘤，以定量残余肿瘤的大小（图2 和 图3).
- 每2天称重一次小鼠，直至实验终点。
注意：本研究的终末时间点为第30天，小鼠通过腹腔注射过量戊巴比妥钠实施安乐死。
结果
胶质母细胞瘤切除后复发模型的构建流程如下 图 1在显微镜下部分切除肿瘤后形成的切除腔如图所示。 采用注射器将水凝胶注入切除腔，以展示其治疗效果。实验设计的时间安排如图所示。 图 2A将 GBM 细胞植入小鼠脑内后，通过……检测肿瘤生长。 体内 第10天进行生物发光成像。第11天实施肿瘤切除，随后将水凝胶注射至切除腔。 体内 生物发光成像检测于第15天、第20天、第25天和第30天进行，以监测残留肿瘤的生长情况。如图所示， 图 2B,C，如所示，GBM复发术后模型中的肿瘤体积显著小于原位颅内GBM模型中的肿瘤体积。 体内 生物发光成像检测。术后第25天，肿瘤复发显著图 2D）。H&E染色证实，胶质母细胞瘤切除后复发模型构建成功，且残留肿瘤在切除后显著复发。图 3A,B).
图 1肿瘤切除与水凝胶注射的术中视图。 部分肿瘤组织在显微镜下使用微型刮匙和微型手术刀切除，并将水凝胶注射至切除腔内。比例尺：50 µm. 本图改编自 Sun 等人。10. 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2实验设计与时间安排 体内 小鼠在颅内及切除后胶质母细胞瘤模型中的生物发光成像。 (A) 实验设计时间表显示，手术切除在第11天进行，且 体内 活体生物发光成像于第10天、第15天、第20天、第25天及第30天进行。B) 颅内 GBM 模型小鼠在第 10 天显示出较大的肿瘤体积，(C) 肿瘤体积在第11天切除后显著缩小，且(D) 肿瘤体积在切除后第25天于切除后胶质母细胞瘤模型中有所增大。对照组包含未经处理的切除后胶质母细胞瘤复发模型小鼠。本研究共使用42只小鼠。比例尺：100 µ该图已根据 Sun 等人修改。10. 请点击此处查看此图的放大版本。
图3H&切除后胶质母细胞瘤模型脑组织的伊红染色图像。 (A) 一种 H&E 染色图像显示切除腔、残留肿瘤及正常脑组织。脑组织于切除术后 1 天采集。B) 一个H&伊红染色图像显示复发性肿瘤与正常脑组织。脑组织于切除术后第12天采集。比例尺：100 µ该图已根据 Sun 等人发表的研究进行了修改。10. 请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
手术仍是大多数胶质母细胞瘤（GBM）患者的首选治疗方式11。由于GBM具有侵袭性生长的特性，即使采用显微神经外科技术切除，仍会有少量肿瘤细胞残留，最终导致肿瘤复发12。如何抑制术后GBM的复发已成为GBM相关研究的重点。然而，由于脑组织结构复杂，构建合适的术后GBM模型已成为该领域亟待解决的首要问题。
本研究建立了一种胶质母细胞瘤（GBM）切除术后复发模型。在构建该模型的过程中，原位颅内GBM模型的建立至关重要。成功建立该模型后，需在适当时机进行切除手术。推荐时机为肿瘤大小的荧光值约为6.5 × 105时。为降低小鼠死亡率，采用腹腔注射40 mg/kg的1%戊巴比妥钠进行麻醉后实施切除。然而，由于麻醉剂量较小，小鼠常出现术中移动，导致切除操作困难。在此基础上，将麻醉剂量增加至50 mg/kg。增加麻醉剂量后，小鼠术中反应消失，切除手术得以顺利进行。本方案中也可使用异氟烷气体麻醉。
本研究中使用了GL261-Luci细胞建立模型，因此未来需要采用更多的胶质母细胞瘤（GBM）细胞系来验证该方案。为了增强方案的可信度，还需使用多种GBM小鼠模型，例如基因工程改造的GBM小鼠模型。此外，磁共振成像（MRI）可能是检测术后肿瘤复发的最佳手段。
综上所述，本研究建立了一种胶质母细胞瘤（GBM）切除术后复发模型。在该模型中，通过评估肿瘤切除后残留肿瘤的生长情况来监测肿瘤的复发。尽管该模型尚不能完全模拟肿瘤复发的真实情况，但其切除方式与临床治疗GBM患者时所采用的最大安全切除手术标准相似。本研究提供了一种构建GBM切除术后复发模型的简便且可行的方法，代表了GBM切除术后复发研究领域的一项进展。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了中国国家自然科学基金项目资助（82071767 和 82171781）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 龙胆紫 | Sigma | C6158 | |
| GL261-Luci | 上海中侨新周生物科技有限公司 | ZQ0932 | |
| 活体生物发光成像系统 | Tanon | Tanon ABL X6 | |
| 实验动物剃毛器 | 碧云天生物技术 | FS600 | |
| 小鼠 | 北京维通利华实验动物技术有限公司 | ||
| 微型刮匙 | 贝莱弗医疗有限公司 | ||
| 微型手术刀 | 贝莱弗医疗有限公司 | ||
| 显微镜 | 上海向凡仪器有限公司 | JSZ5A/B | |
| 微量注射器 | Hamilton | 87943 | |
| 微型颅骨钻 | RWD | 78001 | |
| 不可吸收性外科缝线 | 上海玉研仪器有限公司 | ||
| 戊巴比妥钠 | ChemSrc | 57-33-0 | |
| PVA-TSPBA水凝胶 | 阿拉丁 | 9002-89-5 | |
| 立体定位仪 | RWD | 68043 |
参考文献
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