需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

功能性内胚层肝类器官的生成

1.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65027

⸱

2025年5月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Department of Histology and Embryology, Health Science Institute, Dokuz Eylul University, 3Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Izmir Tinaztepe University, 4Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 5Department of Pediatric Gastroenterology and Metabolism, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 6Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Koc University, 7Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了快速且可重复地生成内胚层肝类器官（eHEPOs）的方法。通过本方案，可在2周内生成eHEPOs，并能够长期扩增（超过1年）而不丧失其分化能力与功能特性。

摘要

类器官技术使我们能够在体外生成多种类似人类器官的微型结构，例如肝脏、大脑和肠道的类器官。in vitro。类器官模型的显著进展最近为疾病建模、发育生物学和药物发现等领域的各种应用开辟了新的实验时代。成体干细胞或诱导 多能干细胞（iPSC）来源的肝类器官可用于生成肝细胞，以满足多种应用需求。本文介绍了一种从多能干细胞生成肝类器官的稳健且可重复的实验方案。该方案适用于健康个体及患者来源的细胞。为获得三维内胚层来源的肝类器官（eHEPOs），首先将iPSC直接分化为内胚层细胞，然后通过FACS富集EpCAM阳性（EpCAM+）细胞，并利用扩增培养基建立肝类器官。我们提供了一种快速高效的方法，可在2周内生成肝类器官。所生成的类器官模拟了肝细胞的关键特性和功能，例如白蛋白分泌、糖原储存以及细胞色素P450酶活性。除了表现出与肝脏特异性基因表达相似的特征外，eHEPOs还包含具有胆小管结构的极化上皮细胞。此外，eHEPOs可在长期（长达1年）内进行扩增和连续传代，同时不丧失其向成熟肝细胞分化的潜能。因此，eHEPOs为功能性肝细胞的获取提供了替代来源。

引言

类器官是在三维培养条件下生长的微型器官样结构，能够模拟器官的微环境，并包含器官发育过程中自我组织和自我更新所必需的内在因素。类器官可来源于多能干细胞（PSCs）或成体组织来源的细胞（干细胞或前体细胞）1。尽管其精确的器官样结构和特定器官的功能相似性使其成为疾病建模的重要工具，但在培养标准化方面仍需进一步改进。特别是，目前已发表多种肝脏类器官的构建方案，这些方案在复杂性和可重复性方面存在差异2。例如，Takebe 等人开发的肝芽类器官是由以下诱导性多能干细胞（iPSCs）形成的致密多细胞结构：肝内胚层前体细胞、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和间充质干细胞（MSCs）。然而，这些类器官不具备长期自我更新能力3,4。

从历史角度来看，Huch 等人首次报道了来源于成人组织的人肝上皮类器官的构建，其中细胞具有极性并特化，能够再现天然上皮组织的某些特征5。随后，Guan 等人利用诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肝类器官建立了Alagille综合征（ALGS）模型，ALGS是一种与肝脏内胆管减少相关的罕见遗传病6。这两种类器官均具备自我更新能力，并可获得成熟肝细胞的功能，例如胆汁和白蛋白分泌、糖原储存以及肝脏特异性的药物解毒功能。在最近的一项研究中，Ramli 等人提出了一种由多能干细胞（PSC）衍生的肝类器官模型，该模型包含极化的肝细胞样细胞（HLCs）之间形成的具有功能的胆小管网络，可将胆汁淤积性药物排入由胆管细胞样细胞（CLCs）构成的胆道样囊泡中7。

本研究介绍了一种独特的培养方法，用于生成由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的内胚层肝类器官，称为eHEPOs。文中逐步描述了iPSC的培养及其向内胚层的分化过程，并展示了从富集的EpCAM+前体细胞生成eHEPOs的方法。最后，阐述了eHEPOs功能特性与结构组织的表征，以及类器官的冷冻保存方法。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

实验步骤相关的许可已获得 Dokuz Eylul 大学医学院当地临床研究伦理委员会的批准（2013/25-4，2013年5月12日；2016/30-29，2016年11月24日）。

1. 细胞培养溶液的配制

  1. 在超净工作台中混合以下组分，配制内胚层分化培养基：1% B27、100 ng/mL Activin A、Wnt3a 或 30% wnt3a-CM，以及 R-spo1 或 10% R-spo1-CM（参见材料表）。
  2. 配制荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液，组成为：PBS、1 mM EDTA、25 mM HEPES、1% FBS。
  3. 配制扩增培养基（EM）：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入1% N2、1% B27、1.25 mM N-乙酰-L-半胱氨酸、50 ng/mL EGF、10% R-spo1条件培养基、100 ng/mL FGF 10、10 mM 烟酰胺、5 µM A8301和10 µM 福斯科林（FSK）。再加入10 nM Y-27632和0.3 nM WNT3a（参见材料表）。
    注意：完全培养基在2–8 °C下保存不得超过2周。
  4. 配制分化培养基（DM）：在Ad-DMEM/F-12培养基中加入1% N2、1% B27、10 nM 胃泌素、50 ng/mL EGF、100 ng/mL FGF 10、25 ng/mL HGF、500 nM A8301、10 µM DAPT、25 ng/mL BMP7和30 µM 地塞米松（参见材料表）。
    ​注意：完全培养基在2–8 °C下可保存2周。

2. 在无饲养层培养板上解冻iPSCs

  1. 用基底膜基质（BMM）包被细胞培养板。
    1. 将一管BMM在冰上过夜或至少提前2小时解冻。向一个15 mL锥形管中加入6 mL冷的DMEM/F-12培养基，立即加入80 µL解冻后的BMM，并充分混匀。
    2. 使用经组织培养处理的孔板，将BMM溶液加入孔板中，使其覆盖整个孔板表面。将孔板置于37 °C培养箱中孵育至少1小时后使用。孵育结束后弃去BMM溶液，并立即加入iPSC专用培养基。
  2. 使用低温防护手套从液氮中取出一管iPSC。立即将该管放置于浮式试管架上，并将试管架浸入37 °C水浴中，直至冰晶完全融化。
    1. 从水浴中取出试管，用70%乙醇彻底擦拭其外表面，然后将其放入超净工作台中。此步骤应迅速完成。
    2. 在超净工作台内无菌条件下，将解冻的细胞转移至含有5 mL iPSC专用培养基的无菌15 mL锥形管中。
      1. 在室温下以200 × g离心3分钟。缓慢弃去上清液，用5 mL移液管轻轻吹打数次，将细胞重悬于2 mL iPSC专用培养基中，然后将细胞接种至已包被的孔中。
    3. 快速轻晃培养板，使细胞均匀分布于孔内表面。将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。
    4. 每天更换培养基。

3. 内胚层分化

  1. 在传代iPSCs之前1小时，用BMM包被新的培养板，具体操作如第2节所述。
  2. 在光学显微镜下观察iPSCs的完整性和存活率。未分化的iPSCs表现为细胞核大、细胞质小，形成的细胞集落紧密且边缘清晰。
    注意：有两种酶解溶液可用于细胞传代。若使用dispase（1 U/mL），则必须去除已分化细胞区域；若使用特定酶，则无需通过刮除或抽吸方式手动去除分化区域。将特定酶置于室温保存。
  3. 将iPSC培养基恢复至室温。吸除原有培养基，用DMEM/F-12或D-PBS清洗iPSC培养板。向6孔板的每个孔中加入1 mL特定酶，室温孵育1分钟，随后吸除酶液，并将培养板置于37 °C孵育5–7分钟。
    注意：酶处理的最佳时间应根据所使用的iPSC细胞系进行优化。
  4. 孵育结束后，加入1 mL预热的iPSC培养基，轻轻敲击培养板侧壁，使未分化的细胞集落聚集体从培养表面脱落。理想的聚集体大小为50–200 µM。
    1. 使用5 mL血清移液管轻轻吹打混匀细胞悬液，然后按所需密度将细胞接种至BMM包被的孔中。将细胞在37 °C培养3–5天，直至融合度达到70%。
  5. 开始分化前，将iPSC培养基更换为内胚层培养基（步骤1.1）。每天更换培养基。在分化过程中密切观察细胞形态变化。细胞间相互作用在分化后开始出现，细胞逐渐呈现棘状形态。

4. eHEPO 的建立

  1. 通过流式细胞术对 EpCAM+ 内胚层细胞进行富集。
    1. 在细胞分选实验前，将一管器官样特异性 BMM（见材料表）置于冰上解冻。在细胞分选实验前一晚，将组织培养板在 37 °C 预热过夜。
    2. 用 1× PBS 清洗内胚层细胞。加入 300 µL 胰蛋白酶，在培养箱中孵育 5 分钟。加入 3 mL 冷 DMEM-F12，使用 1,000 µL 滤芯吸头吹打以获得单细胞悬液。
    3. 将细胞悬液收集至 15 mL 圆底离心管中。在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，并用 10 mL FACS 缓冲液（步骤 1.2）洗涤沉淀。
    4. 为获得单细胞悬液，先用 100 µm 孔径滤网过滤细胞，再用 40 µm 孔径滤网过滤。
      注意：使用滤网前，先用 1 mL FACS 缓冲液冲洗滤网表面。
    5. 将细胞悬液在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。用台盼蓝8计数细胞数量。
    6. 染色比例为 1:11。例如，将 15 × 106 个细胞重悬于 105 µL FACS 缓冲液中，加入 45 µL FcR 和 15 µL EpCAM（见材料表）。在 40 °C 孵育 10 分钟，并避光保护。孵育结束后，加入 500 µL FACS 缓冲液洗涤细胞悬液。在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
    7. 将沉淀重悬于 500 µL FACS 缓冲液中。向细胞悬液中加入 DAPI（终浓度 0.5 µM/1 mL），用于定量死细胞。将细胞置于冰上，直至开始细胞分选步骤。
  2. 将 EpCAM 阳性分选后的细胞包埋于 BMM 中。细胞分选后，以 300 × g 离心 5 分钟以去除 FACS 缓冲液。弃去上清液，将 3,000–5,000 个细胞重悬于 20 µL BMM 中。
    1. 在每孔 48 孔板中央加入一滴 BMM 来接种细胞。在 37 °C 孵育 2 分钟，直至 BMM 凝固。小心翻转培养板，再置于培养箱中继续孵育 10 分钟。随后在液滴上覆盖扩增培养基（每孔 250 µL，适用于 48 孔板）。
    2. 每 3 天更换一次类器官培养基。在第 10–11 天，类器官大小将超过 100 µm。
  3. 进行 eHEPO 的机械解离与分化。
    1. 将每个类器官液滴按 1:4 比例进行分割。分割时，弃去类器官培养基，加入 500 µL 冷 Ad-DMEM/F12。使用 1,000 µL 滤芯吸头剧烈吹打 BMM 液滴。
    2. 最多收集 10 个 BMM 液滴至 15 mL 圆底离心管中，并加入 5 mL 冷 Ad-DMEM/F12。将离心管置于冰上 3–5 分钟。
    3. 在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，保留约 1 mL 液体。使用 200 µL 滤芯吸头剧烈吹打细胞沉淀 30–40 次。在光学显微镜下检查类器官大小，注意避免形成单细胞悬液。
    4. 机械解离后，加入 5 mL 冷 Ad-DMEM/F12，并在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟。
    5. 弃去上清液，将细胞悬液置于冰上，直至接种细胞。
    6. 接种 50 µL BMM 液滴（每孔含 35 µL BMM + 15 µL 细胞与 Ad-DMEM/F12，适用于 24 孔板）。
    7. 向 EM 培养基中添加 BMP7（25 ng/mL，见材料表），培养 3 天。第 4 天更换为分化培养基（步骤 1.4）。每 3 天更换一次培养基，持续培养至少 14 天。

5. eHEPOs 的表征

  1. 进行组织学检查。
    1. 进行石蜡包埋。
      1. 移除培养基，加入1-2 mL冷的1×PBS，轻轻重悬BMM于冷的1×PBS中。小心地将类器官转移至15 mL离心管中。让类器官依靠重力自然沉降，然后小心吸除PBS。重复洗涤步骤三次。
      2. 向类器官中加入10 mL新鲜固定液（10%中性缓冲福尔马林），于30 min内孵育。轻轻移除固定液，加入10 mL冷的1×PBS，孵育10 min。小心吸除PBS。
      3. 在室温下，用0.5%伊红（见材料表）溶于96%乙醇的溶液对类器官染色30 min。
        注：若需进行免疫染色，则不要使用伊红染色。
      4. 使用酒精梯度（70%乙醇、80%乙醇和96%乙醇）在室温下各洗涤5 min，对类器官进行脱水。将类器官浸泡于100%乙醇（无水乙醇）中30 min。
      5. 用二甲苯（见材料表）清洗类器官三次，每次20 min9。
        注意：二甲苯为高毒性和易燃化合物，操作时应佩戴适当的安全防护装备，避免大量使用。
      6. 使用塑料移液管将类器官轻轻转移至预热的金属底模（见材料表）中，模具内含有熔融石蜡。将类器官置于65 °C培养箱中，每次在新鲜熔化石蜡中浸泡30 min，共三次（每次更换新熔化石蜡）。
      7. 随后，将类器官包埋于新的新鲜石蜡中。轻轻将类器官移至金属底模中央。
        注：此步骤需迅速操作，因石蜡在室温下会迅速凝固。
      8. 将金属底模置于冷板上10–20 s以稳定类器官。然后倒入熔化石蜡覆盖整个金属底模，并在金属底模上方放置组织盒（见材料表）用于标记。确保模具中有足够的石蜡，随后在冷板上使其完全凝固。移除金属底模。
      9. 使用标准切片机（见材料表）切取5–7 µm厚的切片。将连续的石蜡切片置于防脱载玻片上。让载玻片在室温下过夜干燥。
    2. 进行苏木精-伊红（H&E）和过碘酸-雪夫（PAS）染色。
      1. 将石蜡包埋的切片置于63 °C培养箱中过夜以进行脱蜡。次日，将切片置于二甲苯中三次，每次20 min。切勿让切片干燥。
      2. 使用梯度酒精系列（100%乙醇、96%乙醇、80%乙醇和70%乙醇）各2 min对切片进行再水化。然后将切片放入蒸馏水中1 min。
      3. 进行H&E染色时，执行以下步骤。
      4. 将切片置于苏木精溶液中5 min。用流动自来水冲洗切片5 min。用1%伊红Y溶液（见材料表）染色10 s。
      5. 使用80%乙醇、96%乙醇和两次更换的100%乙醇系列对切片进行脱水，每次30 s。
      6. 将切片置于二甲苯中透明化处理三次，每次20 min。
      7. 使用封片剂（见材料表）小心地将盖玻片封固于玻璃载玻片上的切片上。确保无气泡残留。
      8. 进行PAS染色时，先执行步骤5.1.2.4–5.1.2.6，然后按照Akbari等10报道的PAS染色程序进行操作。随后小心地用封片剂将盖玻片封固于玻璃载玻片上的切片上。确保无气泡残留。
    3. 进行免疫组织化学（IHC）染色。
      1. 执行H&E染色方案中的步骤5.1.2.1和步骤5.1.2.2。
      2. 将切片置于0.1 M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中，微波加热10 min。
      3. 静置至切片冷却至室温（约20 min），然后用蒸馏水冲洗切片。
      4. 将切片置于新配制的含3% H2O2的甲醇溶液中，室温孵育10 min。随后用蒸馏水冲洗切片1 min。
      5. 为阻断一抗的非特异性结合，将切片与封闭液（2%血清 + 0.1% Triton X-100 + 0.1% BSA）在室温下孵育1 h。
      6. 轻轻移除封闭液，加入用封闭液稀释的一抗（E-CAD、ALB、EpCAM、A1AT、CK19）（见材料表），于4 °C孵育过夜。
      7. 次日，小心冲洗切片两次，每次10 min。
      8. 加入二抗（羊抗兔、羊抗鼠）（见材料表），室温孵育1 h，并用蒸馏水冲洗切片5 min（三次）。
      9. 配制3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB，见材料表）溶液（必须在使用前30 min内配制）。
      10. 将DAB溶液应用于切片1–5 min，随后用蒸馏水冲洗切片5 min（三次）。
      11. 用苏木精对切片进行复染1 min，并用流动自来水冲洗1 min。
      12. 使用80%乙醇、96%乙醇和两次更换的100%乙醇系列对切片进行脱水，每次30 s。
      13. 将切片置于二甲苯中20 min（三次）。
      14. 使用封片剂小心地将盖玻片封固于玻璃载玻片上的切片上。确保无气泡残留。
    4. 进行OCT包埋。
      1. 使用新配制的冷4%多聚甲醛（PFA）在4 °C下固定类器官过夜。小心移除固定液，用1×PBS洗涤15 min（三次）。
      2. 使用蒸馏水配制30%蔗糖溶液（w/v）。移除1×PBS，加入30%蔗糖溶液以对类器官进行脱水。
      3. 将类器官在4 °C下孵育过夜。初始阶段大多数组织会漂浮于30%蔗糖溶液中，渗透完成后会下沉。此时可认为冷冻保护已完成。
      4. 准备干冰或液氮用于包埋过程。
      5. 向塑料冷冻模具中滴加两至三滴OCT（见材料表）。将类器官按正确切面方向放置于其上。
      6. 缓慢而小心地将OCT覆盖于类器官上方，注意避免产生气泡。让类器官在室温下依靠重力沉降10–15 min。
      7. 在冷冻前标记冷冻模具。将模具置于干冰或液氮上进行快速冷冻。将冷冻模具转移至−80 °C保存，直至切片前。
    5. 进行免疫荧光（IF）染色。
      1. 进行冷冻切片染色。
        1. 在室温下将冷冻切片空气干燥20–30 min。用蒸馏水再水化5 min（三次）。使用疏水笔（见材料表）在组织周围绘制疏水屏障。
        2. 每张切片加入200–300 µL 0.2% Triton X-100 。小心洗涤5 min（三次）。确保在洗涤过程中切片不从载玻片上脱落。
        3. 加入封闭液（2%血清 + 0.1% Triton X-100 + 0.1% BSA），室温孵育1 h。
        4. 轻轻移除封闭液，加入用封闭液稀释的一抗（E-CAD、A1AT、HNF4α）（见材料表），于4 °C孵育过夜。次日，小心冲洗切片10 min（两次）。
        5. 加入合适的二抗（Alexa Fluor 488 [小鼠]、Alexa Fluor 594 [小鼠]、Alexa Fluor 594 [兔]）（见材料表），室温孵育1 h，并用蒸馏水冲洗切片5 min（三次）。
        6. 每张切片加入100–200 µL Hoechst或DAPI核染料，染色3 min，用1×PBS洗涤切片，并重复洗涤三次。
        7. 使用抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固于玻璃载玻片上的切片上。将切片在4 °C避光保存过夜，直至成像。
      2. 进行整体染色。
        1. 执行石蜡包埋程序中的步骤5.1.1.1和步骤5.1.1.2。
        2. 加入封闭液（0.1%–1% Triton X-100、1% DMSO、1% BSA和1%山羊血清溶于1×PBS中，见材料表），将类器官与封闭液在室温下孵育2–3 h。
        3. 轻轻移除封闭液，加入用封闭液稀释的一抗（CK19、CK18、ZO-1、ALB）（见材料表），于4 °C孵育过夜。
        4. 次日，轻轻移除溶液，加入1×PBS。让类器官依靠重力沉降最多10 min。小心移除溶液，并重复洗涤三次。
        5. 将类器官与二抗（Alexa Fluor 594 [小鼠]、Alexa Fluor 488 [兔]、Alexa Fluor 488 [小鼠]）在室温下孵育至少1 h。小心移除溶液，并重复洗涤四次。
        6. 进行核染色时，将类器官与Hoechst或DAPI核染料孵育10 min。加入1×PBS洗涤类器官，并重复洗涤三次。让类器官沉降至管底。
        7. 使用塑料巴氏吸管将类器官从管中取出，置于玻璃载玻片上。操作时应尽量减少对类器官的损伤。
        8. 移除多余的PBS，加入适量（一至两滴）封片剂。小心地用封片剂将盖玻片封固于玻璃载玻片上的类器官上。将切片在4 °C避光保存，直至成像。
  2. 进行电子显微镜检查。
    1. 使用Karnovsky溶液（2.5%缓冲戊二醛 + 2%多聚甲醛溶于0.1 M磷酸钠缓冲液[Sorensen缓冲液]，pH 7.4，见材料表）在4 °C下固定类器官过夜。
    2. 用0.1 M Sorensen缓冲液 + 0.1 M蔗糖（1:1）洗涤类器官15 min（三次）。随后在2%磷酸钠缓冲的四氧化锇（见材料表）中后固定90 min。
    3. 将类器官包埋于2%温热琼脂中。使用穿刺针切除类器官周围的多余琼脂。用Sorensen缓冲液洗涤类器官15 min（三次）。
    4. 使用50%丙酮脱水15 min（两次）。
    5. 在4 °C下，使用70%丙酮 + 1%磷钨酸 + 0.5%醋酸铀酰（见材料表）染色过夜。
    6. 次日，使用丙酮梯度（80%丙酮、90%丙酮、96%丙酮和100%丙酮）各15 min（两次）对类器官进行脱水。
    7. 使用环氧丙烷清洗类器官10 min（两次），然后将类器官置于环氧树脂：环氧丙烷（见材料表）混合液中，室温孵育30 min。
    8. 向类器官中加入新的环氧树脂溶液，于4 °C孵育过夜。
    9. 次日，将新的新鲜环氧树脂溶液加入底模中，然后包埋类器官。置于65 °C培养箱中聚合48 h。
    10. 使用超薄切片机将类器官环氧树脂块切成50–100 nm厚的切片。将切片转移至覆有Formvar膜的铜网上。
  3. 测定CYP3A4酶活性。
    1. 按照制造商说明书，使用市售试剂盒（见材料表）测定CYP酶活性。
      注：CYP酶将底物转化为可检测的中间产物11,12,13。测定CYP酶活性有两种方法（细胞裂解法和非裂解法）。该试剂盒可用于分析基础CYP活性及化合物处理后的诱导CYP活性。
    2. 每组实验设三个重复。使用化学发光仪读取发光信号并计算数值。为进行归一化处理，将类器官用胰蛋白酶消化并计数细胞数量。
  4. 进行人白蛋白定量。
    1. ELISA检测前24 h更换新鲜培养基。孵育24 h后，收集细胞培养基（300–500 µL），在4 °C下以500 × g离心2 min以去除细胞碎片和颗粒。分装上清液，并将样品在−80 °C保存（最长3个月）。
    2. 标准品和样品均设两个重复。成熟类器官会向培养基中分泌白蛋白；使用ELISA定量试剂盒（见材料表）测定白蛋白含量。在终止反应后30 min内使用ELISA酶标仪在450 nm波长下测定吸光度。将类器官用胰蛋白酶消化并计数细胞数量以进行归一化。
  5. 进行氨清除实验。
    1. 按照制造商说明书进行氨清除实验（见材料表）。简要步骤：向培养基中加入1.5 mM NH4Cl，孵育24 h。
    2. 孵育后，使用氨检测试剂盒（见材料表）测定氨浓度。使用多功能多孔板读数仪计算测量值，并将结果归一化至细胞数量。
  6. 进行甘氨胆酸荧光素（CLF）实验。
    1. 简要步骤：将类器官与10 µmol/L CLF（见材料表）共孵育，在37 °C培养箱中孵育1 h。孵育结束后，用1×PBS洗涤类器官。使用荧光显微镜进行成像。
  7. 进行基因表达分析。
    1. 按照RNeasy试剂盒说明书（见材料表）从eHEPOs中提取总RNA。
    2. 使用市售主混合液（见材料表）配制PCR反应体系，遵循制造商说明书。每对引物的PCR混合液配制完成后，将每份样品10 µL加入96孔qPCR板（表1）中。
    3. 用粘性封板膜密封反应板，随后在室温下以1,000 × g离心2 min。将反应板装入PCR仪中。以内部对照（RPL41，表1）为参照，采用2−ΔΔCt法进行相对基因表达的归一化与分析14。

6. eHEPOs 的冷冻保存

  1. 使用耐氮标记笔标记冻存管，并检查冻存容器中的异丙醇液位；实验开始前将冻存容器置于 4 °C 环境中预冷 15–30 分钟。
  2. 将一个 50 µL 的 BMM 液滴冻存于一支冻存管中。按照步骤 4.3 所述进行类器官机械解离。解离完成后，将细胞团块重悬于 500 µL 冷冻冻存液中，轻轻混匀后转移至冻存管，并将冻存管放入冻存容器中。
  3. 将细胞冻存容器转移至 −80 °C 环境中；24 小时后，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。

7. eHEPOs 的解冻

  1. 将水浴锅和 Ad-DMEM/F12 预热至 37 °C。
  2. 使用低温手套从液氮储存中取出一管 eHEPOs，将冻存管放入 37 °C 水浴中，直至冰晶完全融化。将细胞悬液转移至 15 mL 圆底离心管中，在 4°C 下以 200 × g 离心 5 分钟。
  3. 吸除上清液，按第 4 节所述方法接种 eHEPOs。用添加了 10 µM Y-27632 的扩增培养基覆盖 BMM 液滴（参见材料表）。每 3 天更换一次培养基，并在 3 天后去除 ROCK 抑制剂。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

首先，将人成纤维细胞或外周血单个核细胞（PBMC）进行培养并重编程为诱导多能干细胞（iPSCs） 通过 附加体重编程。新鲜的敲除血清对于获得健康的iPSCs至关重要。随后，将iPSCs以50%-60%的融合度接种至BMM包被的培养板中。保持iPSC克隆处于较小或中等大小有助于提高分化效率。接着，将iPSCs在含有Activin A、Wnt3a和R-spo1因子的培养基中诱导分化为定型内胚层，持续5天。在分化过程中，细胞数量和体积显著增加，因此必须注意及时更换培养基。在内胚层分化结束时，通过荧光激活细胞分选（FACS）方法富集EpCAM+细胞，将分选后的细胞嵌入BMM中，并在扩增培养基（EM）中培养10-14天。类器官形成能力依赖于新鲜的培养基成分和高纯度的细胞群体，因此，成功的细胞分选是关键步骤。当eHEPOs的尺寸大于 100 µm 当细胞融合度达到70%-80%时，进行解离。eHEpO具有长期培养（1年）的能力，所获得的eHEpO可进行冷冻保存。融合度为70%-80%的四个类器官液滴最适合用于冷冻保存。在启动成熟/分化之前进行类器官分割步骤非常关键。大型类器官在分化过程中存活率会下降。本研究中，将所获得的...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案详细描述了一种从诱导性多能干细胞（iPSCs）出发，生成、扩增以及冻存/复苏肝类器官的综合性方法。该方案涵盖了所有步骤，包括在饲养层及无饲养层条件下培养iPSCs、二维内胚层分化、通过流式细胞分选（FACS）富集前体细胞并形成类器官，以及生成获得功能的类器官。此外，还提供了对类器官进行验证和表征的详细操作说明。目前成熟且具有功能的肝细胞广泛应用的主要障碍在于原代肝细胞来源有限、无法实现肝细胞的长期扩增，以及细胞的低温冻存困难15,16。将iPSC技术与类器官技术相结合，为获得无限量的功能性肝细胞提供了强有力的工具。

在该实验方案的前5天，使用Activin A、Wnt3A和R-spo1将iPSCs诱导分化为内胚层细胞。R-spo1作为Wnt信号通路的激动剂蛋白，可促进EpCAM+细胞数量的增加10。当获得的EpCAM+细胞融合度超过60%–70%时，表明内胚层分化效果良好。为实现这一目标，iPSCs的大小和细胞融...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。作者声明无利益冲突。Esra Erdal 是 ORGANO-ID 生物技术公司的联合创始人。

致谢

本研究由土耳其科学技术研究理事会（TÜBİTAK）资助 通过 项目 SBAG-115S465 和 SBAG-213S182。 图1 使用 BioRender 生成。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 圆锥形离心管Corning430052
37 °C 水浴箱Nüve210.NB9
37 °C、5 % CO2 培养箱MemmertINCO 153
50 mL 圆锥形离心管Corning430290
70 µm 和 40 µm 细胞筛Falcon352350/ 352340
70% 乙醇Sigma1009832511
A1ATAbcamab166610稀释比例：1/500（IF），1/50（IHC）
A-83.01（TGF-β 抑制剂）Tocris Biosciene2939
丙酮Isolab9,01,026
粘附式显微镜载玻片HistobondC981040
高级 DMEM-F12 培养基Gibco12634-010
AFPAbcamab3980稀释比例：1/25（IHC）
琼脂EMS10200
ALBAbcamab10241稀释比例：1/100（IF），1/20（IHC）
Alexa Fluor 488（小鼠）InvitrogenA11001稀释比例：1/1000（IF）
Alexa Fluor 488（兔）InvitrogenA110034稀释比例：1/1000（IF）
Alexa Fluor 594（小鼠）InvitrogenA11005稀释比例：1/1000（IF）
Alexa Fluor 594（兔） InvitrogenA11037稀释比例：1/1000（IF）
氨检测试剂盒Sigma-AldrichMAK-310
氯化铵Santa Cruzsc-202936
B27 补充剂 50xGibco12587010
包埋模具Sakura4216
b-FGFPeprotech100-18B
生物安全二级柜ThermoSAFE 2020
校准移液器GilsonF167380
离心机Eppendorf5702
胆酰甘氨酰氨基荧光素Corning451041
柠檬酸盐缓冲液 pH 6.0Bio-optica15-M103
CK-18Santa Cruzsc-51582稀释比例：1/100（IF），1/20（IHC）
CK-19Santa Cruzsc-6278稀释比例：1/100（IF），1/20（IHC）
共聚焦显微镜ZeissLSM880
低温操作手套和眼部防护Cryokit5274
冷冻切片机LeicaCM 1950
冻存管Corning430659
DABRoche11718096001
DAPTSigma-Aldricha5942
地塞米松Sigma-AldrichD4902
Dispase Stem Cell Technologies7923
DMEM F12Gibco31330038
E-CADSanta Cruzsc-8426稀释比例：1/100（IF），1/20（IHC）
EDTAInvitrogen15575-020
电子显微镜ZeissSigma500
ELISA 试剂盒Fortis life sciences bethylE88-129
Embed 812 包埋试剂盒EMS14121
中性树胶（Entellan）Merck107961
1% 伊红 YSigma-AldrichHT110332
EpCAMMiltenyi Biotec130-059-901稀释比例：1/11（FACS）
乙醇Merck1,00,98,32,511
胎牛血清（FBS）Gibco26010066
福斯科林（FSK）Tocris Biosciene1099
冻存容器（Mr. Frosty）Thermo5100-0001
冻存培养基Gibco12648010
玻璃巴斯德吸管Isolab084.01.001
Glutamax 100xGibco35050-068
25% 戊二醛，电镜级EMS16210-1L
山羊抗小鼠 HRPThermo Fisher62-6520稀释比例：1/1000（IHC）
山羊抗兔 HRPThermo Fisher31460稀释比例：1/1000（IHC）
山羊血清Gibco162-10-072
H2O2Merck107209
苏木精MilliporeHX86017674
HEPES，1 MGibco15630-056
HNF-4αAbcamab55223稀释比例：1/50（IHC）
冰和干冰自制自制
65 °C 培养箱NüveEN 400
异丙醇Sigma-Aldrich24137
人胃泌素 I（Leu15）Sigma-AldrichG9145
发光仪Berthold TechLB 960
预混液 Applied Biosystems43676659
Matrigel 基质，hESC 认证Corning354277
Matrigel 基质，无酚红Corning356231
甲醇Merck179337
微量离心管Axygen321-02-501
显微镜ZeissAXIO VERT A1
切片机刀片FeatherS35, C35
mTeSR1Stem Cell Technologiessc-05850
多孔悬浮培养板Sarstedt83,39,21,500
N2 补充剂 100xGibco17502048
N-乙酰半胱氨酸Sigma-AldrichA9165
10% 中性缓冲福尔马林TekkimTK.60161.05001
烟酰胺Sigma-AldrichN0636
非必需氨基酸（NEAA）Gibco11140050
OCTTissue-Tek4583
四氧化锇EMS19110
P450-Glo 检测试剂盒 PromegaV9001
Pap-penSigmaZ377821-1EA
石蜡TekkimTK.200661.01002
PAS 染色试剂盒Abcamab150680
PBSLonzabe17-516
青霉素/链霉素Gibco15630-056
磷钨酸Ted Pella19402
移液器辅助器AxygenMotopet-1
多功能酶标仪（varioskan flash） Thermo5250040
Prolong 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36980
环氧丙烷，电镜级EMS20401
实时荧光定量 PCR 系统Applied Biosystems7500 Fast 
重组人 Activin AR&D338-Ac-050
重组人 BMP7Peprotech120-03
重组人 EGFPeprotechaf-100-15
重组人 FGF10Peprotech100-26
重组人 FGF19Peprotech100-32
重组人 HGFPeprotech100-39
Rho 激酶抑制剂 Y-27632 二盐酸盐Sigma-AldrichY0503
无 RNase/DNase 的 1.5 mL 管Axygen31108101
无 RNase/DNase 的滤芯吸头Sarstedt703031255
旋转式切片机LeicaRM 2245
RPMI 1640 培养基Gibco61870010
Rspo1 条件培养基自制
Slide masterBio-optica15-MEQ001
Sorenson’s 磷酸盐缓冲液EMS11600-10
旋转混合器ThermoMY SPIN 6
无菌刻度移液管Falcon357543
组织包埋盒Leica3802240
修块机LeicaEM TRIM2
吐温 X-100Thermo Scientific28314
TrypLE Express 酶Gibco12605010
胰蛋白酶-EDTAGibco25200-056
超薄切片机LeicaEM UC7
醋酸铀EMS22400
涡旋振荡器Thermo88880018
Wnt 替代-Fc 融合蛋白ImmunoPreciseN001
二甲苯Sigma 16446
ZO-1Invitrogen40-2200稀释比例：1/400（IF）

参考文献

  1. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).
  2. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  3. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  4. Takebe, T., et al. Massive and reproducible production of liver buds entirely from human pluripotent stem cells. Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).
  5. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  6. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  7. Ramli, M. N. B., et al. Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease. Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486 (2020).
  8. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 3(1997).
  9. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Histopathology: Methods and Protocols. 1180, 31-43 (2014).
  10. Akbari, S., et al. long-term culture of endoderm-derived hepatic organoids for disease modeling. Stem Cell Reports. 13 (4), 627-641 (2019).
  11. Meisenheimer, P. L., et al. Proluciferin acetals as bioluminogenic substrates for cytochrome P450 activity and probes for CYP3A inhibition. Drug Metabolism and Disposition. 39 (12), 2403-2410 (2011).
  12. Cali, J. J., Ma, D., Wood, M. G., Meisenheimer, P. L., Klaubert, D. H. Bioluminescent assays for ADME evaluation: dialing in CYP selectivity with luminogenic substrates. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (9), 1115-1130 (2012).
  13. Cali, J. J., et al. Luminogenic cytochrome P450 assays. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (4), 629-645 (2006).
  14. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  15. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  16. Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
  17. Akbari, S., Arslan, N., Senturk, S., Erdal, E. Next-generation liver medicine using organoid models. Frontiers in Cell Development and Biology. 7, 345(2019).
  18. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mule, K., Stolz, D. B. Histological organization in hepatocyte organoid cultures. American Journal of Pathology. 159 (5), 1877-1887 (2001).
  19. Shinozawa, T., et al. High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids. Gastroenterology. 160 (3), 831-846 (2021).
  20. Wu, F., et al. Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Hepatology. 70 (6), 1145-1158 (2019).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

内胚层类器官多能干细胞类器官技术疾病建模肝细胞分化FACS富集EpCAM阳性细胞白蛋白分泌细胞色素P450活性
功能性内胚层肝类器官的生成
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。