方法文章

功能性内胚层肝类器官的生成

DOI：

10.3791/65027

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2025年5月2日

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1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Department of Histology and Embryology, Health Science Institute, Dokuz Eylul University, 3Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Izmir Tinaztepe University, 4Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 5Department of Pediatric Gastroenterology and Metabolism, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 6Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Koc University, 7Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了快速且可重复地生成内胚层肝类器官（eHEPOs）的方法。通过本方案，可在2周内生成eHEPOs，并能够长期扩增（超过1年）而不丧失其分化能力与功能特性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

类器官技术使我们能够在体外生成多种类似人类器官的微型结构，例如肝脏、大脑和肠道的类器官。in vitro。类器官模型的显著进展最近为疾病建模、发育生物学和药物发现等领域的各种应用开辟了新的实验时代。成体干细胞或诱导 多能干细胞（iPSC）来源的肝类器官可用于生成肝细胞，以满足多种应用需求。本文介绍了一种从多能干细胞生成肝类器官的稳健且可重复的实验方案。该方案适用于健康个体及患者来源的细胞。为获得三维内胚层来源的肝类器官（eHEPOs），首先将iPSC直接分化为内胚层细胞，然后通过FACS富集EpCAM阳性（EpCAM+）细胞，并利用扩增培养基建立肝类器官。我们提供了一种快速高效的方法，可在2周内生成肝类器官。所生成的类器官模拟了肝细胞的关键特性和功能，例如白蛋白分泌、糖原储存以及细胞色素P450酶活性。除了表现出与肝脏特异性基因表达相似的特征外，eHEPOs还包含具有胆小管结构的极化上皮细胞。此外，eHEPOs可在长期（长达1年）内进行扩增和连续传代，同时不丧失其向成熟肝细胞分化的潜能。因此，eHEPOs为功能性肝细胞的获取提供了替代来源。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

类器官是在三维培养条件下生长的微型器官样结构，能够模拟器官的微环境，并包含器官发育过程中自我组织和自我更新所必需的内在因素。类器官可来源于多能干细胞（PSCs）或成体组织来源的细胞（干细胞或前体细胞）1。尽管其精确的器官样结构和特定器官的功能相似性使其成为疾病建模的重要工具，但在培养标准化方面仍需进一步改进。特别是，目前已发表多种肝脏类器官的构建方案，这些方案在复杂性和可重复性方面存在差异2。例如，Takebe 等人开发的肝芽类器官是由以下诱导性多能干细胞（iPSCs）形成的致密多细胞结构：肝内胚层前体细胞、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和间充质干细胞（MSCs）。然而，这些类器官不具备长期自我更新能力3,4。

从历史角度来看，Huch 等人首次报道了来源于成人组织的人肝上皮类器官的构建，其中细胞具有极性并特化，能够再现天然上皮组织的某些特征5。随后，Guan 等人利用诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肝类器官建立了Alagille综合征（ALGS）模型，ALGS是一种与肝脏内胆管减少相关的罕见遗传病6。这两种类器官均具备自我更新能力，并可获得成熟肝细胞的功能，例如胆汁和....

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

实验步骤相关的许可已获得 Dokuz Eylul 大学医学院当地临床研究伦理委员会的批准（2013/25-4，2013年5月12日；2016/30-29，2016年11月24日）。

1. 细胞培养溶液的配制

  1. 在超净工作台中混合以下组分，配制内胚层分化培养基：1% B27、100 ng/mL Activin A、Wnt3a 或 30% wnt3a-CM，以及 R-spo1 或 10% R-spo1-CM（参见材料表）。
  2. 配制荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液，组成为：PBS、1 mM EDTA、25 mM HEPES、1% FBS。
  3. 配制扩增培养基（EM）：在Advanced DMEM/F-12培养基中加入1% N2、1% B27、1.25 mM N-乙酰-L-半胱氨酸、50 ng/mL EGF、10% R-spo1条件培养基、100 ng/mL FGF 10、10 mM 烟酰胺、5 µM A8301和10 µM 福斯科林（FSK）。再加入10 nM Y-27632和0.3 nM WNT3a（参见材料表）。
    注意：完全培养基在2–8 °C下保存不得超过2周。
  4. 配制分化培养基（DM）：在Ad-DMEM/F-12培养基中加入1% N2、1% B27、10 nM 胃泌素、50 ng/mL....

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Firstly, human fibroblast cells or peripheral blood mononuclear cells (PBMC) cells were cultured and converted to iPSCs via episomal reprogramming. The fresh knockout serum was essential for obtaining healthy iPSCs. Then, the iPSCs were seeded into the BMM-coated culture plates with 50%-60% confluency. Having iPSC colonies of a small/medium size improved the differentiation efficiency. Then, the iPSCs were differentiated into definitive endoderm with medium containing Activin A, Wnt3a, and R-spo1 factors for 5 d.......

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讨论

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本方案详细描述了一种从诱导性多能干细胞（iPSCs）出发，生成、扩增以及冻存/复苏肝类器官的综合性方法。该方案涵盖了所有步骤，包括在饲养层及无饲养层条件下培养iPSCs、二维内胚层分化、通过流式细胞分选（FACS）富集前体细胞并形成类器官，以及生成获得功能的类器官。此外，还提供了对类器官进行验证和表征的详细操作说明。目前成熟且具有功能的肝细胞广泛应用的主要障碍在于原代肝细胞来源有限、无法实现肝细胞的长期扩增，以及细胞的低温冻存困难15,16。将iPSC技术与类器官技术相结合，为获得无限量的功能性肝细胞提供了强有力的工具。

在该实验方案的前5天，使用Activin A、Wnt3A和R-spo1将iPSCs诱导分化为内胚层细胞。R-spo1作为Wnt信号通路的激动剂蛋白，可促进EpCAM+细胞数量的增加10。当获得的EpCAM+细胞融合度超过60%–70%时，表明内胚层分化效果良好。为实现这一目标，iPSCs的大小和细胞融.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。作者声明无利益冲突。Esra Erdal 是 ORGANO-ID 生物技术公司的联合创始人。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由土耳其科学技术研究理事会（TÜBİTAK）资助 通过 项目 SBAG-115S465 和 SBAG-213S182。 图1 使用 BioRender 生成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 圆锥形离心管Corning430052
37 °C 水浴箱Nüve210.NB9
37 °C、5 % CO2 培养箱MemmertINCO 153
50 mL 圆锥形离心管Corning430290
70 µm 和 40 µm 细胞筛Falcon352350/ 352340
70% 乙醇Sigma1009832511
A1ATAbcamab166610稀释比例：1/500（IF），1/50（IHC）
A-83.01（TGF-β 抑制剂）Tocris Biosciene2939
丙酮Isolab9,01,026
粘附式显微镜载玻片HistobondC981040
高级 DMEM-F12 培养基Gibco12634-010
AFPAbcamab3980稀释比例：1/25（IHC）
琼脂EMS10200
ALBAbcamab10241稀释比例：1/100（IF），1/20（IHC）
Alexa Fluor 488（小鼠）InvitrogenA11001稀释比例：1/1000（IF）
Alexa Fluor 488（兔）InvitrogenA110034稀释比例：1/1000（IF）
Alexa Fluor 594（小鼠）InvitrogenA11005稀释比例：1/1000（IF）
Alexa Fluor 594（兔） InvitrogenA11037稀释比例：1/1000（IF）
氨检测试剂盒Sigma-AldrichMAK-310
氯化铵Santa Cruzsc-202936
B27 补充剂 50xGibco12587010
包埋模具Sakura4216
b-FGFPeprotech100-18B
生物安全二级柜ThermoSAFE 2020
校准移液器GilsonF167380
离心机Eppendorf5702
胆酰甘氨酰氨基荧光素Corning451041
柠檬酸盐缓冲液 pH 6.0Bio-optica15-M103
CK-18Santa Cruzsc-51582稀释比例：1/100（IF），1/20（IHC）
CK-19Santa Cruzsc-6278稀释比例：1/100（IF），1/20（IHC）
共聚焦显微镜ZeissLSM880
低温操作手套和眼部防护Cryokit5274
冷冻切片机LeicaCM 1950
冻存管Corning430659
DABRoche11718096001
DAPTSigma-Aldricha5942
地塞米松Sigma-AldrichD4902
Dispase Stem Cell Technologies7923
DMEM F12Gibco31330038
E-CADSanta Cruzsc-8426稀释比例：1/100（IF），1/20（IHC）
EDTAInvitrogen15575-020
电子显微镜ZeissSigma500
ELISA 试剂盒Fortis life sciences bethylE88-129
Embed 812 包埋试剂盒EMS14121
中性树胶（Entellan）Merck107961
1% 伊红 YSigma-AldrichHT110332
EpCAMMiltenyi Biotec130-059-901稀释比例：1/11（FACS）
乙醇Merck1,00,98,32,511
胎牛血清（FBS）Gibco26010066
福斯科林（FSK）Tocris Biosciene1099
冻存容器（Mr. Frosty）Thermo5100-0001
冻存培养基Gibco12648010
玻璃巴斯德吸管Isolab084.01.001
Glutamax 100xGibco35050-068
25% 戊二醛，电镜级EMS16210-1L
山羊抗小鼠 HRPThermo Fisher62-6520稀释比例：1/1000（IHC）
山羊抗兔 HRPThermo Fisher31460稀释比例：1/1000（IHC）
山羊血清Gibco162-10-072
H2O2Merck107209
苏木精MilliporeHX86017674
HEPES，1 MGibco15630-056
HNF-4αAbcamab55223稀释比例：1/50（IHC）
冰和干冰自制自制
65 °C 培养箱NüveEN 400
异丙醇Sigma-Aldrich24137
人胃泌素 I（Leu15）Sigma-AldrichG9145
发光仪Berthold TechLB 960
预混液 Applied Biosystems43676659
Matrigel 基质，hESC 认证Corning354277
Matrigel 基质，无酚红Corning356231
甲醇Merck179337
微量离心管Axygen321-02-501
显微镜ZeissAXIO VERT A1
切片机刀片FeatherS35, C35
mTeSR1Stem Cell Technologiessc-05850
多孔悬浮培养板Sarstedt83,39,21,500
N2 补充剂 100xGibco17502048
N-乙酰半胱氨酸Sigma-AldrichA9165
10% 中性缓冲福尔马林TekkimTK.60161.05001
烟酰胺Sigma-AldrichN0636
非必需氨基酸（NEAA）Gibco11140050
OCTTissue-Tek4583
四氧化锇EMS19110
P450-Glo 检测试剂盒 PromegaV9001
Pap-penSigmaZ377821-1EA
石蜡TekkimTK.200661.01002
PAS 染色试剂盒Abcamab150680
PBSLonzabe17-516
青霉素/链霉素Gibco15630-056
磷钨酸Ted Pella19402
移液器辅助器AxygenMotopet-1
多功能酶标仪（varioskan flash） Thermo5250040
Prolong 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36980
环氧丙烷，电镜级EMS20401
实时荧光定量 PCR 系统Applied Biosystems7500 Fast 
重组人 Activin AR&D338-Ac-050
重组人 BMP7Peprotech120-03
重组人 EGFPeprotechaf-100-15
重组人 FGF10Peprotech100-26
重组人 FGF19Peprotech100-32
重组人 HGFPeprotech100-39
Rho 激酶抑制剂 Y-27632 二盐酸盐Sigma-AldrichY0503
无 RNase/DNase 的 1.5 mL 管Axygen31108101
无 RNase/DNase 的滤芯吸头Sarstedt703031255
旋转式切片机LeicaRM 2245
RPMI 1640 培养基Gibco61870010
Rspo1 条件培养基自制
Slide masterBio-optica15-MEQ001
Sorenson’s 磷酸盐缓冲液EMS11600-10
旋转混合器ThermoMY SPIN 6
无菌刻度移液管Falcon357543
组织包埋盒Leica3802240
修块机LeicaEM TRIM2
吐温 X-100Thermo Scientific28314
TrypLE Express 酶Gibco12605010
胰蛋白酶-EDTAGibco25200-056
超薄切片机LeicaEM UC7
醋酸铀EMS22400
涡旋振荡器Thermo88880018
Wnt 替代-Fc 融合蛋白ImmunoPreciseN001
二甲苯Sigma 16446
ZO-1Invitrogen40-2200稀释比例：1/400（IF）

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).
  2. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. ....

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FACS EpCAM P450

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