本研究建立了一种抗体摄取检测法，用于成像胚胎斑马鱼大脑中分裂的放射状胶质前体细胞内同一谱系中的 Notch/DeltaD 信号传导。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
不对称细胞分裂（ACD）可产生命运不同的两个子细胞，是生成细胞多样性的基本机制。在无脊椎动物和脊椎动物发育中的器官内，不对称分裂的前体细胞产生 Notch你好 自我更新和Notchlo 分化子细胞。在胚胎期斑马鱼大脑中，放射状胶质前体细胞（RGPs）——主要的脊椎动物神经干细胞——通常通过不对称细胞分裂（ACD）产生一个RGP和一个正在分化的神经元。斑马鱼胚胎具有光学通透性强和易于操作的优势，使其成为理想的研究模型 体内 延时成像以直接观察不对称Notch信号在不对称细胞分裂（ACD）过程中建立的时间与机制。近期研究表明，Notch配体DeltaD的动态内吞在ACD期间的细胞命运决定中起关键作用，该过程受进化上保守的极性调节因子Par-3（又称Pard3）和驱动蛋白dynein复合物的调控。为实现对这一过程的可视化 体内 我们开发了这种抗体摄取实验，以研究有丝分裂期放射状胶质前体细胞（RGPs）中Notch信号内体的运输模式。利用该实验，我们揭示了含有DeltaD的内体在RGP分裂过程中的动态行为。
引言
Notch 信号通路在后生动物发育过程中调控细胞命运决定和模式形成1，近期研究表明，干细胞分裂中的 Notch 信号主要依赖于内吞运输2,3。内吞后的 Notch/Delta 可激活细胞核内的 Notch 信号，增强 Notch 靶基因的转录4,5,6。定向的 Notch/Delta 内体运输最初在果蝇感觉器官前体（SOP）细胞的不对称细胞分裂（ACD）过程中被观察到，导致 pIIa 细胞中的 Notch 信号活性高于 pIIb 细胞7,8。已有研究利用抗 Delta 和抗 Notch 抗体的抗体摄取实验，监测有丝分裂期 SOP 细胞中的内吞过程。Notch/Delta 内体在细胞质分裂期间随驱动蛋白马达蛋白向中心纺锤体移动，并由于细胞分裂末期不对称中心纺锤体的反平行排列，被不对称地转移到 pIIa 细胞中3,8。这些研究揭示了调控果蝇 SOP 细胞不....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究使用了AB野生型品系及转基因品系Tg [ef1a:Myr-Tdtomato]。所有动物实验均经美国加利福尼亚大学旧金山分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准（批准编号：AN179000）。
1. 斑马鱼胚胎的制备
- 在当天下午5:00前设置鱼类交配缸，每个缸中放入一条野生型雌鱼和一条Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] 雄鱼，并使用隔离板将它们分隔开。
- 次日上午11:00前，从所有交配缸中移除隔离板。保持安静，避免干扰鱼类交配。产卵通常在移除隔离板后30分钟内发生，受精卵会留在缸底。
- 使用筛网从缸中收集受精卵，通过冲洗将卵转移至盛有卵水的培养皿中，并在解剖显微镜下以10倍至20倍放大倍数观察胚胎。
- 使用大口径玻璃巴斯德移液管将受精胚胎转移至含有约20 mL胚胎培养基的洁净培养皿中（100 mL 1,000倍浓缩储备液包含29.4 g NaCl、1.27 g KCl、4.85 g CaCl2·2H2O和8.13 g MgSO4·7H2O）。将胚胎置于28 °C环境中培养。每30 mL胚胎培养基中放置50个受精胚胎，培养温度为28.5 °C。
注意：一对鱼类通常可....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在图2A中，注射了Atto647N但未与一抗结合的胚胎在脑室中显示出背景荧光，细胞中几乎观察不到被吞噬的荧光颗粒。而注射了抗-Dld-Atto647N的斑马鱼胚胎在发育中的前脑大多数细胞内显示出大量内化的荧光颗粒（图2A，右图）。如图2B所示，通过放大聚焦于有丝分裂的放射状胶质前体细胞（RGPs），我们能够记录细胞分裂过程中细胞内抗-Dld-Atto647N内吞体的动态运动（视频1）。大多数有丝分裂的RGPs表现出抗-Dld-Atto647N内吞体向两个子细胞的前部或后部不对称分配12。我们还注意到，这种不对称性在后期末趋于稳定，导致子细胞随后不对称地继承Notch信号内吞体12。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们开发了一种高效的抗体摄取检测方法，用于标记和成像斑马鱼放射状胶质前体细胞中内体内的 Notch/Delta 转运过程。与先前用于追踪果蝇 SOP 细胞中标记抗 DeltaD 抗体的方法相比7,8，本方法采用显微注射而非将样品与偶联抗体共同孵育。将荧光标记的抗Dld抗体显微注射至后脑室；该技术不会造成损伤，注射后胚胎发育正常并完全恢复即为证据。胚胎脑室系统相互连通，使得注射后的抗体在显微注射后可自由扩散至前脑。注射的抗Dld-atto647N在脑内可持续稳定存在超过24小时，为持续性抗体摄取提供了稳定来源。与此前报道的神经管注射相比10斑马鱼后脑脑室注射不会造成组织损伤，并能实现有丝分裂期放射状胶质前体细胞选择性摄取抗-Dld-Atto647N，这些细胞位于脑室壁内衬 体内尽管我们尚未检测抗体在脊髓神经上皮细胞中的摄取情况，但抗Dld-Atto647N抗体的摄取在该区域也应适用，与在脑部的情况一致。注射至后脑室的偶联抗体预计同样可沿脊髓扩散。
.......访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
该项目由美国国立卫生研究院（NIH）R01NS120218项目、加州大学旧金山分校（UCSF）Mary Anne Koda-Kimble 创新种子奖以及陈-扎克伯格生物中心（Chan Zuckerberg Biohub）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35 mm 玻璃底培养皿 | MatTek 公司 | P35GC-1.5-10-C | |
| 气压注射仪 | Narishige | IM300 | |
| 抗小鼠 IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| 毛细管，外径 1.2 mm，内径 0.9 mm，带纤维丝 | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 转盘式/高速宽场共聚焦系统 | Nikon | N/A | Nikon Ti 倒置荧光显微镜，配备 CSU-W1 大视野共聚焦系统。 |
| Dumont 医用镊子 5 号 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 拉针仪 | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| 显微操作器 | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| 小鼠抗 Dld 抗体 | Abcam | AB_1268496 | |
| Zenon 小鼠 IgG 封闭缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 酚红 | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPure™ 低熔点琼脂糖 | Invitrogen | 16520050 |
参考文献
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daed....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
