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小鼠与人泪腺类器官的建立、维持、分化、遗传操作及移植

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DOI：

10.3791/65040

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2023年2月3日

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1Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), University Medical Center Utrecht, 2Oncode Institute, Hubrecht Institute

本文内容

摘要

本方案描述了如何建立、维持、基因改造、分化、功能表征以及移植源自小鼠和人类原代组织的泪腺类器官。

摘要

泪腺是维持眼表稳态的重要器官。通过产生泪膜的水性成分，它保护眼睛免受干燥应激和外界损伤。由于缺乏合适的 体外 模型。类器官技术已被证实是多种器官的有用实验平台。本文分享了一种从小鼠和人泪腺活检组织建立和维持泪腺类器官的方案。通过优化培养条件，我们增强了泪腺类器官的功能性。类器官功能可通过“哭泣”实验进行检测，即通过给予特定神经递质刺激，诱导类器官腔内泪液释放。我们详细说明了如何对这一现象进行成像和定量分析。为研究特定基因在泪腺稳态中的作用，可对类器官进行遗传学修饰。我们系统阐述了使用碱基编辑器对泪腺类器官进行基因编辑的全过程——从向导RNA设计到类器官克隆的基因型鉴定。最后，我们展示了通过原位移植至小鼠体内，评估人泪腺类器官再生潜能的方法。综上，这一整套技术体系为利用小鼠和人泪腺类器官研究泪腺（病理）生理学提供了有力工具。

引言

泪腺是负责产生泪膜大部分水样层的腺上皮组织1。泪膜的水样层不仅含有用于润滑眼表的水分，还包含多种抗菌成分，可保护眼表免受感染2。当泪腺受损或发生炎症时，便会引发干眼症，导致患者不适，并可能最终造成视力丧失3。多年来，用于研究泪腺（尤其是人类泪腺）的模型系统十分有限4,5,6，这导致人们对泪腺在生理和病理条件下的功能仍存在知识空白。

最近， 体外 已开发出在培养皿中研究泪腺的模型7,8,9这些泪腺类器官来源于成体干细胞，在添加了多种生长因子混合物的细胞外基质中培养形成三维结构，以维持其再生能力 体外7成体干细胞（ASC）来源类器官的优势在于能够长期维持并重现健康组织的特征。这类类器官仅由上皮细胞组成，而诱导性多能干细胞（iPSC）来源类器官则可能还包含间质细胞等其他成分。与多能干细胞（PSC）来源类器官不同，ASC类器官直接来源于成体组织，无需任何遗传修饰即可扩增。ASC类器官表达成体特征10.

本方案提供了一套从鼠源和人源原代组织中获取泪腺类器官的工具。该方案描述了如何通过简单地撤除生长因子来进一步增强类器官的功能，以及如何通过进行肿胀实验诱导类器官分泌泪液。此外，本方案还包括一种基于电穿孔的转染方法，利用CRISPR衍生的碱基编辑器对鼠源类器官进行基因工程改造。与传统的Cas9不同，碱基编辑器可在不产生双链断裂的情况下实现基因组中单个碱基的修饰11,12。最后，方案还描述了将人源泪腺类器官原位移植到免疫缺陷小鼠体内，并对移植物进行后续组织学评估的方法。该泪腺类器官工具包可用于泪腺再生与功能研究，以及 遗传性和炎症性疾病建模。

方案

小鼠实验已获得荷兰皇家艺术与科学学院（KNAW）动物伦理委员会根据项目许可证 AVD8010020151 批准。类器官来源于小鼠的多余组织。人泪腺活检样本取自乌得勒支大学医学中心（UMCU）患者手术后的废弃组织，该方案已获得医学伦理委员会批准，方案编号为 18-740。该方案包含多个部分，如图 1所示。

泪腺类器官工作流程；包括建立、维持、分化和基因编辑。
图1：实验方案概览。 本图展示了该实验方案的不同步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

注意：所有培养基和缓冲液的成分均在补充表1中描述。

1. 小鼠和人泪腺类器官的建立

  1. 小鼠泪腺的解剖
    1. 准备解剖工具，包括剪刀、镊子和解剖垫。通过吸入 O2/CO2 对小鼠实施安乐死13。
    2. 将已安乐死的小鼠腹部朝下放置于解剖垫上，并固定其四肢。用70%乙醇润湿小鼠耳间及前额部位的毛发。
    3. 使用解剖剪在颅骨后方两耳之间剪开一个切口，将切口向前延伸至前额直至鼻部。继续使用剪刀在耳后剪开皮肤，形成两个皮瓣。
    4. 用力将皮瓣向前拉向鼻部，直至暴露泪腺，如图2A所示。将皮瓣用针固定在解剖垫上。使用剪刀在泪腺上方的膜上做一小切口，以完全暴露泪腺。
    5. 用镊子轻轻牵拉泪腺，应能感到一定阻力，直至主泪管被撕裂。如需要，也可直接用剪刀剪断主泪管。
    6. 将小鼠泪腺放入组织培养级PBS中，待后续处理。应在2–4小时内尽快进行泪腺处理，以减少细胞死亡。若处理时间更长，应将小鼠泪腺放入活检采集培养基中（补充表1）。
      ​注意：若需立即获得大量类器官，可将多个泪腺组织合并使用。
  2. 采集人泪腺活检组织
    1. 手术前，将20 mL活检采集培养基（补充表1）分装至50 mL离心管中，并提前交予外科医生。该培养基可在4 °C保存数月。
    2. 手术当天，由外科医生取一小块泪腺组织（通常<1 mm3），并将其保存于4 °C的活检采集培养基中（补充表1）。
    3. 尽快收集活检组织并进行处理。理想情况下，应在活检取样后2小时内于同一天完成处理。
  3. 类器官的建立
    1. 提前准备好以下材料：解冻的细胞外基质（ECM）、室温（RT）小鼠或人扩增培养基（补充表1）、解冻的胶原酶、基础培养基（补充表1）、两把手术刀、一个10 cm培养皿、装有70 µm滤网的15 mL离心管，以及已在37 °C预热30分钟的12孔悬浮培养板。
    2. 通过混合补充表1中列出的所有组分来配制消化液。将手术刀预先浸入该消化液中，以防止组织粘附。
    3. 从小鼠或人泪腺组织保存液中取出组织，置于培养皿中。
    4. 使用已预湿的手术刀将组织切碎。当组织块变得非常细小（即<0.5 mm3）时，用手术刀刮取并转移至消化液中。若人活检组织本身已非常细小，可直接将其放入消化液中，无需切碎，以避免组织损失。
    5. 将组织块在37 °C水浴中孵育最多15分钟。定期倒置15 mL离心管以重悬组织块。在台式显微镜下观察细胞解离情况，避免组织过度消化。
    6. 同时，将巴斯德吸管尖端置于火焰中旋转加热以拉细，然后在基础培养基中预湿。为有效解离组织，确保吸管孔径略小于剩余最大组织块。为促进解离过程，每隔5分钟用预湿的拉细巴斯德吸管轻轻吹打混合液。
    7. 当显微镜下可见大量单个细胞和小细胞团时，加入10 mL基础培养基终止消化。在400 × g 条件下离心5分钟，使细胞沉淀。
    8. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL基础培养基中，重复洗涤一次。通过70 µm滤网过滤，以去除未消化的大块组织和残留的胶原纤维，这些杂质会影响ECM的充分聚合。将滤液在400 × g 条件下离心5分钟。
      ​注意：若出现红色沉淀，表明存在红细胞，通常不会影响类器官的建立。但对于某些应用（如流式细胞术），需裂解红细胞。此时，将细胞在5 mL新鲜红细胞裂解缓冲液中室温孵育5分钟，然后在400 × g 条件下离心5分钟收集细胞。
    9. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100 µL冷的ECM中（单个小鼠泪腺）或50 µL冷的ECM中（人活检组织）。重悬时应避免产生气泡，因为气泡会影响ECM的聚合和稳定性。
    10. 每孔12孔悬浮培养板接种最多100 µL细胞悬液。使用P200移液器在孔内形成约20 µL的液滴。液滴越小，生长因子和营养物质在基质中的扩散效果越好。
    11. 将培养板倒置放入37 °C、加湿的培养箱中，孵育20–30分钟，使ECM凝固。
    12. ECM凝固后，每孔加入约1 mL室温的小鼠或人扩增培养基。每2–3天更换一次培养基，直至类器官生长至300 µm大小。换液时，吸除孔内旧培养基，并沿孔壁轻轻加入新鲜扩增培养基，避免触碰ECM液滴，以防破坏结构。
      ​注意：若出现细菌污染，可在分离时添加Primocin（100 mg/mL；按商品储备液1:1,000稀释）。但由于其会减缓类器官生长，建议尽量不添加，或在传代一至两次后停止使用。

2. 扩增小鼠和人类泪腺类器官

  1. 对于小鼠类器官约7天后，人类类器官约10天后，当类器官大小达到约300 µm时，移除培养基。
  2. 用P1,000移液器剧烈吹打1 mL胰蛋白酶溶液，使含有类器官的ECM液滴重悬并分散成单个液滴。将此混合物转移至15 mL离心管中，并在37 °C水浴中短暂孵育。
  3. 2–3分钟后，使用已剪窄并预先润湿的巴斯德吸管上下吹打类器官悬液10–15次。在台式显微镜下检查类器官的解离状态；应获得约含20个细胞的小细胞团。若解离不充分，继续在37 °C水浴中孵育并重复吹打步骤，直至解离效果满意。
    注意：由于人类类器官具有多层结构，此步骤可能需要更长时间。过程中会产生单细胞，但只要大部分类器官悬液为小细胞团，就不会影响后续类器官的生长。
  4. 加入10 mL基础培养基以终止解离反应，随后在400 × g 条件下离心5分钟，收集细胞沉淀。
  5. 移除上清液以及可能浮在类器官上方的残留ECM（无类器官的透明胶状层），然后按照步骤1.3.10所述，在接种至悬滴培养板前，将细胞沉淀重悬于适当体积的冷ECM中。
    ​注意：通常小鼠泪腺类器官以1:5比例传代，人类类器官以1:3比例传代。这意味着，若起始类器官位于100 µL ECM中，则传代后应分别重悬于500 µL和300 µL ECM中。
  6. 将培养板倒置，于37 °C培养箱中孵育30分钟，待ECM完全凝固后，室温下加入小鼠或人类扩增培养基覆盖类器官。

3. 小鼠和人泪腺类器官的冷冻保存

  1. 为冻存类器官，首先根据第2节中的说明，在扩增培养基中将类器官进行分传。
  2. 大约3-4天后，当类器官处于生长期时，移除培养基并重悬 100 µL 将含有ECM的类器官置于10 mL冷基础培养基中。冰上孵育10分钟以促进ECM解离，期间定期翻转离心管以加速该过程。
  3. 将类器官在500 x g下离心成团 g 5 分钟。弃去上清液，将类器官沉淀重悬于 1 mL 冷冻保存液中（残留的 ECM 不影响冷冻保存效果）。将类器官悬液转移至冻存管，并立即置于 −80 °C 冷冻机
    注意：使用本方案中所述的冷冻保存培养基时 材料清单，冷冻管可无限期保存于 −80 °C 冻存管。如果使用其他冷冻保存液，则在24小时后将冻存管转移至液氮罐中，以确保最佳保存效果。
  4. 为解冻类器官，从冷冻柜中取出冻存管，并用干冰运输至 37 °C 水浴。将冻存管置于水中，直至其内容物大部分融化。将内容物转移至含有10 mL基础培养基的15 mL离心管中，于400 x g离心沉淀细胞 g 5 分钟。
  5. 将类器官接种到培养板中 100 µL 按照步骤2.5和步骤2.6所述，用扩增培养基替换细胞外基质（ECM）。

4. 泪腺类器官的分化及其功能评估

  1. 类器官分化
    1. 为了分化泪腺类器官，首先根据第2节中的说明，在扩增培养基中将类器官进行分割。
    2. 2天后，按照步骤1.3.12所述，将扩增培养基更换为小鼠或人类分化培养基。每2-3天更换一次培养基，使小鼠类器官在此培养基中维持培养5天，人类类器官维持培养9天。
    3. 为了评估类器官在分化培养基中培养5天或9天后的分化情况，收集 100 µL 将含有细胞外基质（ECM）的类器官重悬于含有1 mL培养基的孔中，使用P1,000移液器吹打混匀，然后将类器官悬液转移至3 mL预冷的冰浴基础培养基中。在500 × g条件下离心沉淀类器官。 g 5 分钟。
    4. 弃去上清液，将沉淀重悬于RNA提取缓冲液中。根据RNA提取试剂盒的说明书进行后续的RNA提取操作。所得RNA可用于例如干细胞基因表达的RT-qPCR分析TP63, KRT5, KRT14）以及分化细胞标志物（LCN2, WFDC2, AQP5, LTF、ACTA2…)14.
      注意：为了获得相关的表达分析结果，需测量一个或多个组织样本中所选标志物的表达水平。在分化条件下培养的类器官通常含有较少的RNA。
  2. 功能肿胀实验
    注意：进行本方案的此部分时，应使用已分化至少7天的人类泪腺类器官。最少需要7天的分化时间，以确保功能泌泪相关标志物的充分表达。12孔板中的每孔构成一个实验条件。最少实验条件数量为三种：阳性对照、阴性对照和待测条件。
    1. 新鲜配制1 mL含有个体组分的人类分化培养基，用于诱导泪腺类器官分泌。例如，加入 100 µM 去甲肾上腺素和 1 µM forskolin，并充分混匀。
      注意：佛司可林作为阳性对照，通常可诱导最大肿胀。
    2. 在自动明场延时显微镜上，设置培养板中待成像的位置、时间间隔（5 min）和持续时间（4 h）。确保每个位置均能完整观察到整个ECM液滴。
    3. 成像开始前，无需将培养板从显微镜上移开，直接吸除待成像孔中的培养基，并替换为步骤4.2.1中重新悬浮的培养基。设置一个阴性对照孔，仅用分化培养基替换分化培养基，以排除培养基更换可能引发类器官轻微肿胀的干扰。
    4. 孵育最长4小时后，肿胀实验结束。分析实验结果。
      注意：这些步骤使用 EVOS M7000 显微镜进行，该显微镜支持自动明场延时成像。对于该显微镜，请参考制造商提供的详细使用手册以设置延时成像程序。值得注意的是，任何具有类似特性的其他显微镜也可用于此实验。
    5. 为量化类器官肿胀，测量每个类器官在0 h和4 h时的直径。在ImageJ中打开同一类器官液滴在0 h和4 h的图像。
    6. 点击 直线 工具栏中的图标，首先绘制类器官在 0 h 时的直径。然后，使用 测量 ImageJ 中的工具分析 > 测量使用此方法测量该线段的长度，从而获得类器官在肿胀前的直径。在4小时后对同一个类器官重复该过程，以获得类器官肿胀后的直径。
    7. 在肿胀实验前后，每种条件下测量约20个类器官的直径。

5. 构建敲除 Pax6 的质粒

  1. 使用 C > T 碱基编辑器敲除 Pax6 的 gRNA 设计
    注意：目前有许多可用于 gRNA 设计的软件程序。此处使用 Benchling，因其支持集成化的 gRNA 设计、注释以及 Sanger 测序结果比对。因此，后续所有步骤也可使用其他软件程序完成。
    1. 通过点击 新建 (+) > DNA 序列 > 导入 DNA 序列，在 Benchling 中可视化目标基因，启动 gRNA 设计流程。
    2. 在 从数据库导入 选项卡中，输入目标基因 Pax6，然后点击 搜索。
    3. 选择最新版本的小鼠参考基因组 GRCm38（mm10，Mus musculus），然后点击 导入。
    4. 根据以下规则选择可用于设计敲除 gRNA 的外显子：
      1. 避免将 gRNA 设计在第一个编码外显子中，因为细胞可能利用后续外显子中的替代起始位点来绕过早期引入的终止密码子。
      2. 将 gRNA 设计在所有可由 Pax6 mRNA 剪接产生的替代转录本中均存在的外显子中。为确保这一点，可在 Ensembl 基因组浏览器中可视化 Pax6，并选择在所有转录本中均被使用的外显子。
      3. 为进一步避免可变剪接的影响，优先选择包含不完整密码子（三联体中剩余一个或两个碱基）的外显子。这一点重要性较低，但能更可靠地预测诱导插入缺失（indel）的效果。对于 Pax6，外显子 4 至外显子 11 是理想的靶点。此外，应选择包含色氨酸（W）、谷氨酰胺（Q）或精氨酸（R）残基的外显子。
        注意：使用 SpCas9 的标准 C > T 碱基编辑器的编辑窗口位于 gRNA 起始位置第 4 至第 8 个核苷酸（远离 PAM 序列一侧）。C > T 碱基编辑器可在反义链上将所有色氨酸（W）残基（TGG 转变为 TGA、TAG 或 TAA）、谷氨酰胺（Q）残基（CAG 转变为 TAG 或 CAA 转变为 TAA）以及正义链上的精氨酸（R）残基（CGA 转变为 TGA）引入终止密码子。
    5. 选择目标外显子及其上下游各 20 个碱基。点击屏幕右侧的靶标符号 CRISPR，然后点击 设计并分析向导序列。
    6. 在新打开的菜单中，在 设计类型 选项卡下勾选 用于“碱基编辑”（Komor 等，2016）的向导序列。保持 向导序列长度 为 20 个核苷酸，并在 基因组 下拉菜单中为小鼠选择 GRCm38（mm10，Mus musculus）。
    7. 点击绿色的 + 按钮后，软件将自动检测所有原间隔序列邻近基序（PAM）序列，并在屏幕右侧生成目标外显子周围所有潜在 gRNA 的列表。
    8. 浏览该列表，直到发现红色方框中的终止密码子符号（*），该符号表示该 gRNA 可能将某个氨基酸密码子转变为终止密码子，从而实现基因敲除。
    9. 在 gRNA 序列右侧第一列中，软件会针对编辑窗口附近的每个目标“C”碱基计算 in silico 预测的编辑效率。请确保导致终止密码子形成的 C > T 编辑效率至少达到 ~10。
    10. 点击 脱靶 列中的数值，以查看该 gRNA 可能结合的脱靶位点。为提高特异性，应避免选择会结合其他额外基因的 gRNA。例如，一个适用于 C > T 碱基编辑器靶向 Pax6 的优良 gRNA 靶向外显子 7，其序列为 5'-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3'。
    11. 通过点击屏幕右上角的 注释 图标，然后选择 新建注释，在 Benchling 文件中创建注释。为注释命名，并在 链 下拉菜单中确保选择正确的 gRNA 方向。
  2. gRNA 质粒构建
    注意：目前有多种可用于将 gRNA 递送至类器官的载体。以下质粒被用作 gRNA 构建的基础：pFYF1320（Addgene #47511，由 Keith Joung 惠赠）。
    1. 为将 gRNA 克隆至 pFYF1320 中，采用反向 PCR 策略，使用标准正向引物："/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC。设计反向引物时，将 gRNA spacer 序列的反向互补序列（务必再次确认 gRNA 方向 [+ 或 - 链]）置于以下通用反向引物片段之前：CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG。例如，使用 C > T 碱基编辑器靶向小鼠 Pax6 外显子 7 时，反向引物序列为：TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG。订购上述两条引物。
    2. 以 1 ng pFYF1320 为模板，使用高保真 DNA 聚合酶进行反向 PCR 反应，共 35 个循环，退火温度为 61 °C。
    3. 在 TAE 缓冲液中以 100 V 电压对 PCR 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳约 45 分钟，以观察预期大小为 2,281 个碱基对（bp）的条带。使用所选试剂盒对目标条带进行凝胶回收纯化。
    4. 设置如下连接反应体系：100 ng 纯化后的 PCR 产物、DpnI 酶（用于降解初始的 pFYF1320 模板 DNA）以及 T4 DNA 连接酶。将反应混合物在 20 °C 孵育 15 分钟，37 °C 孵育 30 分钟，80 °C 孵育 20 分钟。
    5. 将连接反应产物转化至化学感受态 DH5α 细菌中，并将菌液涂布于含氨苄青霉素15的琼脂平板上。
    6. 次日，挑取三个单菌落，并分别接种至 3 mL 含 50 µg/mL 氨苄青霉素的 LB（Lysogeny Broth）培养基中进行扩增培养。
    7. 再过一天，使用质粒小提试剂盒对三个小规模培养物各取 1 mL 进行质粒小提，其余菌液保存于 4 °C。使用 U6_Forward 引物对提取的质粒进行 Sanger 测序，以确认 gRNA 已正确插入载体16。
    8. 在确认某一单菌落含有正确质粒后，取其对应的 500 µL 小规模培养物接种至 50 mL 含氨苄青霉素的 LB 培养基中，过夜培养以扩增质粒 DNA。次日使用质粒中提试剂盒进行中提。该质粒将用于第 6 节的电穿孔实验。

6. 生成 Pax6 基因敲除克隆

  1. 类器官电穿孔
    1. 使用分裂不超过5天的小鼠类器官，以确保其处于增殖状态。每种基因敲除实验使用约300–400 µL的类器官液滴，并额外设置一个阴性对照组，该组在电穿孔时不加入任何质粒。
    2. 执行步骤2.1–2.4以解离类器官，但延长解离时间，使类器官完全解离为单细胞。弃去上清液。
    3. 将细胞重悬于80 µL电穿孔缓冲液中。
    4. 在1.5 mL离心管中，准备总量不超过20 µL的以下质粒：2.5 µg pFYF1320-gRNA质粒、2.8 µg含转座酶的质粒、7.2 µg含潮霉素抗性转座子的质粒，以及7.5 µg pCMV_ABEmax_P2A_GFP质粒。
      注：pFYF1320-gRNA质粒编码先前设计的gRNA，可引导碱基编辑器靶向目标位点。pCMV_ABEmax_P2A_GFP质粒编码碱基编辑器以及GFP报告基因，可用于电穿孔后监测表达碱基编辑器的细胞。含转座酶的质粒编码转座酶，可将含潮霉素抗性盒的质粒所提供的抗性序列随机插入基因组中。成功将该抗性盒整合至基因组的细胞将获得潮霉素抗性，可通过添加潮霉素进行正向筛选。由于多个质粒共整合的可能性很高，因此潮霉素抗性可作为功能筛选手段，用于富集Pax6基因编辑的细胞。
    5. 将质粒加入细胞中，通过上下吹打充分混匀。
    6. 设置电穿孔仪参数：穿孔脉冲（电压：175 V；脉冲时长：5 ms；脉冲间隔：50 ms；脉冲次数：2；衰减率：10%；极性：+）；转移脉冲（电压：20 V；脉冲时长：50 ms；脉冲间隔：50 ms；脉冲次数：5；衰减率：40%；极性：+/-）。
    7. 将含质粒的细胞转移至电穿孔比色杯中，立即测量电阻（Ω），其值应在0.30 A至0.55 A之间，并立即进行电穿孔。此步骤需迅速完成，以避免细胞沉降至比色杯底部，从而降低电穿孔效率。
    8. 将细胞转移至1.5 mL离心管中，加入400 µL含Rho激酶抑制剂的电穿孔缓冲液。在室温下恢复培养30分钟。
    9. 在500 x g条件下离心5分钟收集细胞，弃去上清液，将细胞接种于200 µL细胞外基质（ECM）中。待其凝固后，加入小鼠类器官扩增培养基。
    10. 囊状类器官将在2–3天后开始生长。每日监测GFP信号，以确认C > T碱基编辑器的存在。
  2. 类器官筛选
    1. 约3天后，当类器官恢复生长时，在小鼠扩增培养基中加入100 µg/mL潮霉素，以筛选整合了潮霉素抗性盒的类器官。摄取一个质粒的细胞极有可能同时摄取多个质粒。通过筛选潮霉素抗性类器官，可富集Pax6位点发生编辑的类器官。
    2. 当阴性对照组中所有细胞死亡且存活类器官直径达到约300 µm时，挑取潮霉素抗性类器官。
  3. 类器官挑取与基因分型
    1. 在显微镜旁准备好无菌P20枪头，并在冰上放置若干1.5 mL离心管，每管含100 µL胰蛋白酶溶液。
    2. 用镊子弯曲P20枪头。在台式显微镜下观察含有存活类器官的培养板。当某一存活类器官处于焦点时，打开培养板盖子。在显微镜下使用弯曲的P20枪头，逐一吸出每个存活类器官，并分别放入含有胰蛋白酶溶液的独立离心管中。
    3. 最多挑取20个克隆。具体挑取数量取决于实验设计所需克隆数以及编辑效率，后者因gRNA和靶位点不同而异。
    4. 所有克隆挑取完毕后，将1.5 mL离心管置于37 °C水浴中最多5分钟。定期涡旋各管以加快解离速度，并在台式显微镜下观察类器官状态。当类器官解离为小细胞团或单细胞时，加入1 mL基础培养基终止消化。
    5. 对每个挑取的克隆，保留约400 µL用于基因分型，并转移至另一1.5 mL离心管中。将剩余约600 µL在500 x g条件下离心5分钟，弃去上清液，将细胞重悬于20 µL ECM中，以单滴形式接种至24孔板的一个孔中，并加入不含潮霉素的小鼠扩增培养基。
    6. 为进行基因分型，将含约400 µL细胞悬液的离心管在500 x g条件下离心5分钟，弃去上清液，将细胞重悬于50 µL DNA提取缓冲液中以提取DNA。
    7. 立即按以下条件孵育细胞：60 °C孵育6分钟，涡旋混匀，再于95 °C孵育4分钟。提取的DNA可在−20 °C保存最多7天，但建议立即进行后续PCR扩增以获得最佳结果。
    8. 为扩增核酸酶靶向的位点，使用预先订购的合适基因分型引物及低保真DNA聚合酶，对2 µL提取DNA进行PCR扩增。基因分型引物序列为AGACTGTTCCAGGATGGCTG（Pax6_C>T_F）和TCTCCTAGGTACTGGAAGCC（Pax6_C>T_R）。扩增子应从预期编辑位点约100 bp处开始，以确保高效测序。
    9. 将PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，以评估PCR扩增效率（如步骤5.2.3所述）。当检测到正确大小的条带时，将其从凝胶中切下，并使用试剂盒进行DNA凝胶回收。
    10. 使用基因分型引物对先前挑取的每个类器官克隆提取的DNA进行测序。
    11. 将获得的序列在Benchling中与Pax6基因进行比对。打开步骤4.1中导入的基因序列，点击右侧的Alignments，然后点击Create new alignment。上传测序公司提供的.ab1文件，选择DNA作为核苷酸类型，点击Next。
    12. 在下一窗口中，选择Multisequence及比对程序Auto (MAFFT)，然后点击Create alignment。
    13. 鉴定在两个等位基因上均携带纯合提前终止密码子（由碱基编辑器产生）的基因型。保留相应的类器官克隆进行扩增，并冻存以供后续分析。理想情况下，应平行分析三个不同的类器官克隆，以排除潜在的脱靶效应。

7. 在 NSG 小鼠中进行人泪腺类器官的原位移植

  1. 类器官制备
    1. 人泪腺类器官必须在移植日前约3天进行传代，具体方法见第2节。在移植当天，确保类器官处于增殖期，以提高移植成功率。
    2. 为从细胞外基质（ECM）中提取类器官，向培养基中加入dispase，使其终浓度达到0.125 U/mL。使用P1,000移液器充分重悬ECM液滴以使其解离，并将培养板放回37 °C培养箱中孵育30分钟。100 µL的ECM体积足以用于约10个泪腺的注射。
    3. 将类器官重悬于10 mL基础培养基中以洗去酶。在400 x g 条件下离心5分钟，收集细胞。
    4. 将细胞（约1,500,000个）重悬于50 µL含5% ECM的冷人源扩增培养基中。将类器官悬液置于冰上，并立即进行移植操作。
  2. 小鼠原位移植
    1. 在动物实验设施中，将类器官悬液和胰岛素注射针置于冰上。用预冷的胰岛素注射针吸取类器官悬液。
    2. 使用3%异氟烷对NOD scid gamma（NSG）免疫缺陷小鼠进行麻醉诱导。当小鼠进入睡眠状态后，迅速将其侧卧，使主泪腺（位于眼睛与耳朵之间的中点处）暴露以便操作。
    3. 将5 µL类器官悬液直接经皮肤注射入泪腺。小鼠泪腺所能容纳的最大体积为5 µL。
    4. 让小鼠恢复，并每日监测其是否出现与移植相关的不适症状，尤其是眼部情况。
  3. 评估移植情况
    1. 根据需要评估短期或长期移植效果，在最多90天后通过吸入O2/CO2的方式处死小鼠13。
    2. 按照第1节所述方法解剖泪腺。在室温下用4%甲醛固定24小时。
    3. 将泪腺放入包埋盒中。通过以下步骤进行脱水处理：70%乙醇中孵育2小时，96%乙醇中2小时，100%乙醇中1小时（两次），二甲苯中2小时，最后在58 °C烘箱中过夜浸入液态石蜡。
    4. 次日，将泪腺按所需方向置于金属模具中，加入液态石蜡并使其在冷表面上凝固成块。此过程最好使用组织包埋机完成。
    5. 当石蜡块完全凝固后，使用切片机将整个组织块切成4–5 µm厚的切片。将所有切片（呈带状）保存在干燥、无风的环境中。切片可在室温下长期保存。
    6. 从整个石蜡块中每隔10张取1张切片进行取样。
      1. 按如下方法将切片贴附于载玻片：在载玻片上滴加一滴水，将切片置于其上，于42 °C加热板上静置约2分钟使其展开，然后用滤纸轻轻吸去水分。
      2. 将载玻片置于58 °C烘箱中过夜干燥。此后载玻片可在室温下长期保存。
    7. 为区分人源细胞与小鼠细胞，对这些切片进行人核抗原染色。通过以下洗涤步骤对切片进行复水处理：二甲苯中3分钟（两次），100%乙醇中1分钟（两次），96%、90%、80%、70%、60%和25%乙醇中各1分钟，最后在去离子水中1分钟（两次）。
    8. 将载玻片在PO缓冲液中孵育15分钟（补充表1）。用超纯水洗涤3次。
    9. 在高压灭菌器中进行基于柠檬酸盐的抗原修复：
      1. 将载玻片放入耐高压的染色架中，置于盛有柠檬酸盐缓冲液的篮子内（补充表1）。将篮子放入高压灭菌器，运行一个灭菌循环（压力：10 PSI；温度：121 °C；时间：15分钟）。
      2. 高压灭菌器降压后，取出装有载玻片的篮子，放入室温水中冷却，使载玻片恢复至室温。
        注：抗原修复策略取决于所用抗体。请参考供应商提供的产品说明书选择最合适的抗原修复方法。
    10. 将载玻片水平放置于孵育板上，组织面向上。每张切片上加500 µL含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS封闭液，孵育1小时。移除封闭液。
    11. 每张待染色的载玻片，取1 µL人核仁抗原抗体加入500 µL封闭液中配制抗体溶液。将抗体溶液加至各载玻片上，在4 °C湿盒中孵育过夜。
    12. 次日，用PBS洗涤载玻片3次。加入未稀释的HRP标记抗小鼠二抗，孵育45分钟。再次用PBS洗涤3次。
      注意：在通风橱中配制DAB缓冲液（补充表1）。将载玻片与DAB缓冲液孵育10分钟。所有废弃物应丢弃至有机化学液体废液容器中。
    13. 用蒸馏水洗涤载玻片。加入苏木精复染细胞核，孵育2分钟。用流动自来水冲洗10分钟。
    14. 依次在50%、60%、70%、80%、90%乙醇中各孵育1分钟，96%乙醇中1分钟（两次），100%乙醇中1分钟（两次），二甲苯中1分钟（两次），完成脱水透明步骤。
    15. 用封片剂和盖玻片封固载玻片。干燥约20分钟后，在显微镜下观察。

结果

在分离小鼠泪腺后（图2A），通过酶解和机械消化产生小的组织碎片，其中可区分出腺泡和导管结构（图2B）。残留的大块组织会破坏细胞外基质（ECM）的稳定性，从而抑制类器官的初始出芽生长。当培养约7天后观察到直径约为500 µm的囊状类器官时，表明小鼠泪腺类器官培养成功，此时类器官已可进行传代（图2C）。即使整体类器官培养成功，部分类器官也可能在开始生长后停止发育。人泪腺类器官在组织分离后3-4天内即开始形成囊状结构，并在10-14天内达到成熟大小（图2D）。对于小鼠和人类样本，类器官培养有时会失败，表现为无或仅有少量类器官生长；这通常由组织消化过度所致。小鼠泪腺类器官可传代至少40次，人类泪腺类器官可传代至少20次。传代频率平均为每7-10天一次，具体间隔取决于类器官的生长速度。

用于研究分析的小鼠泪腺提取、细胞分离和类器官培养示意图。
图 2：小鼠和人类泪腺类器官的建立。（A）小鼠泪腺解剖不同阶段的照片。箭头指向其保护膜下的泪腺。（B）组织消化后立即拍摄的小鼠泪腺细胞明场图像，插图显示一个腺泡和一条导管。（C）成功与失败的小鼠泪腺类器官生成的明场图像。（D）人类类器官在14天内的生长过程明场图像。请点击此处查看该图的放大版本。

在扩增培养基中培养时，泪腺类器官含有大量干细胞。为了提高其分化水平，我们分别建立了生长因子含量降低的小鼠和人源分化培养基。小鼠和人源泪腺类器官在分化培养基中分别培养5天和7天后，结构变得更加致密（图3A-B）。这种形态学变化与功能特性的增强相关。加入环磷酸腺苷激活剂佛司可林或神经递质去甲肾上腺素后，类器官在不到3小时内出现肿胀（即顶膜水分泌）（图3C）。若肿胀过程超过3-4小时，则提示类器官分化程度不足和/或未表达功能性标志物（如神经递质受体）。

泪腺分化与肿胀、类器官随时间生长、显微镜结果
图3：小鼠和人泪腺类器官的分化及人源类器官的功能性肿胀实验。（A）小鼠泪腺类器官在扩增培养基中培养7天，随后在扩增培养基中培养2天后转入分化培养基中培养5天的明场图像。（B）人泪腺类器官在扩增培养基中培养11天，随后在扩增培养基中培养2天后转入分化培养基中培养9天的明场图像。（C）已分化的人泪腺类器官分别暴露于新鲜分化培养基（对照）、1 µM forskolin 和 100 µM 去甲肾上腺素后3小时内拍摄的明场图像。请点击此处查看该图的放大版本。

为了在小鼠泪腺类器官中敲除Pax6，通过PCR和连接反应构建了含有靶向Pax6的gRNA的质粒（图4A）。将该含gRNA的质粒与PiggyBac质粒（含潮霉素抗性转座子的质粒和含转座酶的质粒）以及C > T碱基编辑器Cas9共同电转染至已解离为单细胞的小鼠泪腺类器官中。3天后，当类器官恢复生长时，用潮霉素处理以筛选成功整合潮霉素抗性盒的克隆。在成功的电转染实验中，获得潮霉素抗性的类器官得以生长（图4B）。挑选直径大于约300 µm的生长中类器官克隆，理想情况下应在其开始自发分化之前进行（图4C）。从部分类器官中提取DNA，同时将剩余部分继续培养。对gRNA靶向的Pax6位点进行PCR扩增，结果显示所挑选的每个克隆均产生一条367 bp的条带（图4D）。对扩增产物测序后，保留纯合C > T编辑的克隆（n = 1），而未编辑的克隆（n = 4）、杂合编辑或错误编辑的克隆（n = 1）则被弃用（图4E）。总体而言，使用该靶向Pax6的gRNA，在测序的六个克隆中获得了一个纯合敲除的小鼠泪腺类器官克隆。部分克隆生长良好，但部分类器官克隆在挑取后丢失或开始分化（图4F）。在挑选的10个类器官克隆中，有7个成功生长。

基因编辑CRISPR过程；测序、潮霉素筛选、凝胶电泳、克隆分析。
图4：通过碱基编辑介导的小鼠泪腺类器官中Pax6基因的敲除。(A) 靶向Pax6位点的gRNA正确整合后，pFYF1320的Sanger测序结果图谱。(B) 小鼠泪腺类器官在电穿孔后暴露于潮霉素5天后的明场图像。类器官培养于小鼠扩增培养基中。左侧为电穿孔失败的示例，未见对潮霉素具有抗性的克隆生长；右侧为电穿孔成功的示例，可见多个具有潮霉素抗性的类器官克隆存活。(C) 应挑选和不应挑选的克隆的明场图像。(D) 琼脂糖凝胶电泳图，显示使用gRNA靶向扩增的Pax6位点。绿色标注的是预期大小为367 bp的条带。(E) 三个对潮霉素具有抗性的类器官克隆的Sanger测序结果图谱。顶部克隆未发生编辑；中间克隆为纯合的C > T编辑，因此为纯合敲除；底部克隆存在两个杂合点突变，可能为杂合敲除或混合克隆，属于错误编辑。(F) 被挑选出的类器官克隆的明场图像，显示出不同程度的外向生长。请点击此处查看该图的放大版本。

最后，为了在小鼠中进行人泪腺类器官原位移植，需提前3天将类器官进行分割（< 100 µm 直径）被使用。通过检测人源特异性标志物——人核仁抗原，对类器官注射至小鼠泪腺后1个月的移植情况进行染色确认。图5小鼠泪腺所有切片中均未见点状染色，表明无人类类器官移植成功。

人核仁抗原，显微镜结果；人细胞移植与无移植的比较。
图 5：将人泪腺类器官移植至小鼠泪腺。 移植后1个月，对移植的小鼠泪腺进行人核仁标记物染色，以监测移植情况。请点击此处查看该图的放大版本。

补充表1：培养基与缓冲液的组成。 请点击此处下载该表格。

讨论

本方案描述了用于功能检测、突变建模和移植的泪腺类器官的建立与使用。在建立小鼠和人源泪腺类器官时，组织解离至关重要。如果组织消化不充分，类器官的产量将很低；如果组织过度消化，细胞会死亡，无法形成类器官。每种组织都应使用特定酶在特定时间内进行消化，以确保类器官的最佳出球生长14,17,18。泪腺是一种较为柔软的组织，使用胶原酶消化5–10分钟并结合移液吹打进行机械解离，即可分离出小块组织。若需要获得单个细胞用于单细胞RNA测序等应用，可延长解离时间直至达到单细胞阶段，但一旦获得单细胞即应停止解离，以尽量减少细胞活力的下降。由于组织解离极为关键，过度消化是导致泪腺类器官建立失败的最可能原因。

泪腺类器官的适当维持对其应用至关重要。与诱导性多能干细胞来源的类器官相比，长期维持是成体干细胞来源泪腺类器官的一个显著特征。7,17为实现长期维持，应定期进行类器官传代和培养基更换。若不进行上述操作，类器官将开始分化，并出现干细胞潜能下降，从而影响其长期维持7在此步骤中，过度消化同样可能杀死干细胞并影响类器官的维持。对于常规维持培养，无需将类器官解离为单细胞。然而，若要建立克隆性基因敲除类器官品系，则必须从单细胞开始。否则，所形成的类器官将由具有不同遗传背景的细胞嵌合而成，从而无法分析单一明确突变的作用。此处，我们描述了使用一种C > T碱基编辑器用于生成终止密码子。该基因组编辑工具依赖于在NGG PAM序列上游12-18个碱基范围内存在精氨酸、谷氨酰胺或色氨酸密码子。当设计gRNA时若不满足这些条件，则需使用传统的Cas9或C >具有不同PAM序列的T碱基编辑器可用于7,18然而，传统的Cas9会引入双链断裂，修复时会产生插入或缺失突变（indels）11由于两个等位基因可能携带不同的插入缺失突变，克隆基因分型需格外谨慎。应解析所引入的修饰，以确认两个等位基因均含有移码型插入缺失突变，从而确保类器官克隆中目标基因被完全敲除。19. C的优势 > T碱基编辑器的优势在于其可用于构建不一定导致终止密码子的点突变模型。例如，它们可用于模拟特定的 Pax6 研究无虹膜症患者中发现的突变对其泪腺生理功能的影响20.

泪腺分泌泪膜的水性成分1。在生长因子撤除和NOTCH信号通路抑制介导的分化条件下，人类类器官可重现泪液分泌功能。在此条件下，类器官经历终末分化，无法进一步维持培养。然而，已分化的泪腺类器官可用于干眼症背景下促流泪药物的研发，有望应用于高通量筛选。本实验方案中介绍的流泪检测方法是目前能在短时间内引起类器官尺寸最大变化的方法，因此在药物筛选背景下更易于进行定量分析7,9,17。

干细胞治疗在干眼症的泪腺再生中具有广阔前景21。成体干细胞来源的泪腺类器官可作为此类应用的材料来源。本文所述方案可实现人泪腺类器官在体内移植，但多数形成囊状结构。类器官移植率低可能源于注射部位错误。通过使用染料预先训练注射操作，可追踪注射位置，从而提高注射准确性。 Alternatively，可切开小鼠表皮以直接暴露泪腺，此前在大鼠中已采用该方法22。该方法耗时较长，但可能更为准确。然而，采用本方案时，类器官未能在小鼠泪腺中实现功能性整合。iPSC来源的泪腺类器官移植也观察到了类似结果22。通过预先损伤泪腺、使用干眼小鼠模型，和/或以单细胞或小细胞团形式注射类器官，有望进一步优化移植方法。尽管如此，成体干细胞来源的泪腺类器官及相关技术工具仍可为未来泪腺研究与再生医学应用奠定基础。

披露

Hans Clevers 是位于巴塞尔的罗氏制药研究与早期开发部门负责人，并拥有多项与类器官技术相关的专利。

致谢

感谢 Yorick Post 对本实验方案的初步开发工作。本研究部分得到了英国癌症研究基金会大挑战奖（C6307/A29058）以及马克癌症研究基金会向 SPECIFICANCER 团队提供的资助支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 安全锁离心管EppendorfEP0030 120.094
3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物（DAB）Sigma-AldrichD5637CAS: 868272-85-9 ，注意：6 g/L 溶液可分装后于 -20 °C 保存
5x 绿色 GoTaq Flexi 缓冲液PromegaM891A于 -20 °C 保存
A83-01Tocris2939于 -20 °C 保存，储存液浓度为 30 mM，10000 倍
高级 DMEM/F12 培养基Invitrogen12634-010于 4 °C 保存
含氨苄青霉素的琼脂平板Hubrecht Institute
氨苄青霉素钠盐Sigma-AldrichA9518
VAPOUR-Line lite 型高压灭菌器VWR chemicals
B27 添加剂Invitrogen17504-044于 -20 °C 保存，50 倍浓缩液
BD Micro-Fine 胰岛素针头 1 mLBD Bioscience324825
台式显微镜 DMI1Leica
牛血清白蛋白（BSA）MP biomedicals160069于 4 °C 保存
BTXpressBTXMDS450805
C57BL/6 小鼠Hubrecht Institute
包埋盒Klinipath410-02S
CellBanker 1amsbio11910冻存培养基，遵循说明书操作
离心机Eppendorf
柠檬酸一水合物J.T. Baker0088CAS: 5949-29-1
胶原酶 ISigma AldrichC9407分装为 20 mg/mL，20 倍浓缩液，于 -20 °C 保存
15 mL 锥形离心管Greiner Bio-One5618-8271
50 mL 锥形离心管CorningCLS430828-500EA
盖玻片 24 mm x 50 mmMenzel-GläzerBB024050S1
Cultrex 基底膜提取物（BME），生长因子减少型，2 型 — 细胞外基质R&D Systems, Bio-Techne3533-001-02于 -20 °C 保存，可于 4 °C 保存最多 1 个月
DAPTSigma AldrichD5942于 -20 °C 保存，储存液浓度为 10 mM，1000 倍
无水磷酸氢二钠VWR chemicals28026.292CAS: 7558-79-4
磷酸氢二钠二水合物Sigma-Aldrich71643CAS:10028-24-7
中性蛋白酶（Dispase）ThermoFisher Scientific17105-041分装为 50 U/mL，使用前于 -20 °C 保存，400 倍浓缩液
一次性无菌手术刀片 N° 10Swann Morton3033838
DM4000 显微镜Leica
dNTPs 25 mMPromegaU1420将四种核苷酸混合，于 -20 °C 保存
Dpn1New England BiolabsR0176
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Gibco141901441 倍
70 µm 孔径一次性滤器Greiner542170
电穿孔比色皿NepageneEC002S
EnVision+/HRP 小鼠二抗AgilentK400111-2
乙醇 100%BOOM84045206;5000注意：用于配制其他浓度乙醇溶液
乙醇 70%BOOM84010059.5000注意
乙醇 96%BOOM84050065.5000注意
EVOS FL Auto 2 细胞成像系统ThermoFisher Scientific活细胞成像明场显微镜
FGF10Peprotech100-26于 -20 °C 保存，储存液浓度为 100 mg/mL，100 倍浓缩液
FijiNIH, Fiji 开发者
4% 甲醛溶液Sigma-Aldrich1.00496CAS: 50-00-0，注意
佛司可林（Forskolin）Tocris1099于 -20 °C 保存，储存液浓度为 10 mM，10000 倍
GlutamaxGibco35050-061100 倍浓缩液
GoTaq G2 Flexi DNA 聚合酶PromegaM7805于 -20 °C 保存
苏木精VWR chemicals10047105室温保存
HEPESGibco15630-080于 4 °C 保存，100 倍浓缩液
Leica Histocore H 和 C 组织包埋机Leica
加热板Meidax
人核仁抗原抗体Abcamab-190710
盐酸 5 NThermoFisher Scientific10605882CAS: 7647-01-0，注意
过氧化氢 30%Chem-labCL00.2308.1000CAS: 7722-84-1，注意
Hygromycin B-goldInvivoGenant-hg储存液浓度为 100 mg/µL，1000 倍浓缩液
含潮霉素抗性盒的质粒Andersson-Rolf 等，Nature Methods，2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
IsoFlo 100%Mecan5960501
LB 培养基Hubrecht Institute
MgCl2 25 mMPromegaA351H于 -20 °C 保存
RM2235 型切片机Leica
中量质粒 DNA 提取试剂盒ThermoFisher ScientificK210005
小量质粒 DNA 提取试剂盒ThermoFisher scientificK210003
N-乙酰半胱氨酸Sigma AldrichA9165于 -20 °C 保存，储存液浓度为 500 mM，400 倍浓缩液
NEPA21 电穿孔仪Nepagene
烟酰胺Sigma AldrichN0636于 -20 °C 保存，储存液浓度为 1 M，100 倍浓缩液
NOD Scid Gamma（NSG）小鼠Hubrecht Institute 种群
Noggin 条件培养基U-Protein Express定制订购于 -20 °C 保存
去甲肾上腺素Sigma AldrichA7257于 -20 °C 保存，储存液浓度为 100 mM
烘箱Memmert设定温度为 58 °C
P20、P200 和 P1000 移液器Gilson
石蜡VWR chemicals10048502
巴斯德移液管，带玻璃棉ThermoFisher Scientific1150-6973
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG IDT
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC IDT
pCMV_ABEmax_P2A_GFPAddgene112101
青霉素/链霉素Invitrogen15140-122于 -20 °C 保存
PertexKlinipathAM-08010
pFYF1320 Addgene47511
PrimocinInvivoGenant-pm-11000 倍浓缩液，于 -20 °C 保存
前列腺素 E2（PGE2）Tocris2296于 -20 °C 保存，储存液浓度为 10 mM，10000 倍
培养皿，10 cmGreiner633102
Q5 缓冲液New England BiolabsB9027S
Q5 高保真 DNA 聚合酶New England BiolabsM0491S
QIAquick 凝胶提取试剂盒Qiagen28704
QuickExtract DNA 提取液LucigenQE09050分装后于 -20 °C 保存
R-spondin 3 条件培养基U-Protein Express定制订购于 -20 °C 保存
sgRNA 反向引物：TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGIDT
载玻片StarFrostMBB-0302-55A带粘附层，磨砂面
叠氮化钠Merck8.22335.1000CAS: 26628-22-8，注意
柠檬酸钠二水合物J.T. Baker0280CAS: 6132-04-3
标准正向引物：“/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
TTAAAATAAGGC		IDT
高效克隆感受态细胞 DH5alphaInvitrogen18265-017
悬浮细胞培养板（24 孔）Greiner Bio-One66210224 孔
悬浮细胞培养板（12 孔）Greiner Bio-One66510212 孔
T4 DNA 连接酶New England BiolabsM0202
TAE 缓冲液ThermoFisher ScientificB49储存液为 50 倍，使用时用超纯水稀释至 1 倍
含转座酶的质粒Andersson-Rolf 等，Nature Methods，2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
TrypLE Express 酶Invitrogen12605-028于 4 °C 保存
U6 正向引物：GGGCAGGAAGAGGGCCTATIDT
UltraPure 琼脂糖 1000Invitrogen16550
水浴锅Tulabo
二甲苯Klinipath4055-9005CAS: 1330-20-7，注意
Y-27632Abmole BioscienceY-27632 二盐酸盐于 -20 °C 保存，储存液浓度为 10 mM，1000 倍

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