我们介绍一种灵活的化学和多模式刺激方法，可同时对多条秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）进行神经活动的刺激与记录。该方法结合微流控技术、开源硬件与软件，以及有监督的自动化数据分析，能够测量神经元现象，如适应性、时间抑制和刺激串扰。
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本文内容
摘要
摘要
荧光遗传编码钙指示剂极大地促进了我们对从单个神经元到整个脑环路水平神经动态的理解。然而，神经反应可能因先前经验、内部状态或随机因素而有所不同，因此需要能够同时评估大量个体神经功能的方法。尽管大多数记录技术一次仅检测单个动物，本文介绍了利用宽场显微镜技术，同时对数十个秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）或其他亚毫米尺度生物体进行神经元活动记录的方法。开源硬件与软件使得编程完全自动化的实验具有高度灵活性，可精确控制化学、光学、机械、热和电磁等多种刺激的强度与时间。特别是微流控流动装置，能够以亚秒级时间分辨率对化学感受刺激实现精确、可重复且定量的控制。随后，NeuroTracker半自动化数据分析流程可提取个体及群体范围的神经反应，揭示神经兴奋性与动态功能的变化。本文展示了测量神经元适应性、时间抑制以及刺激串扰的应用实例。这些技术提高了刺激的精确性与可重复性，支持对群体变异性的研究，并可推广应用于从小型生物系统（包括细胞、类器官、完整生物体乃至植物）中的其他动态荧光信号检测。
引言
钙成像技术使得利用荧光显微镜和在靶细胞中表达的基因编码钙指示剂，能够以非侵入方式实时记录体内神经活动动态1,2,3。这些传感器通常采用绿色荧光蛋白（GFP），例如GFP-钙调蛋白-M13肽（GCaMP）家族，在神经元激活及细胞内钙离子浓度升高时增强荧光强度。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，钙成像技术尤其强大，可用于研究神经元和神经回路在活体、行为状态下的动物中的功能4,5,6,7,8,9,10，因其身体透明，无需手术即可实现光学观测，且可通过细胞特异性基因启动子将表达靶向至目标细胞。这些技术常结合微流控装置使用，后者可在微小物理尺度上提供精确控制的环境，用于研究生物学、化学和物理现象11
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方案
1. 神经成像设备
注：参见 Lawler 和 Albrecht15 有关构建成像与刺激系统的详细说明，该系统可控制显微镜照明时序、图像采集以及刺激递送（图1）。一个低成本的 Arduino Nano 刺激控制器通过数字信号向阀门控制器驱动流体阀，并通过模拟电压信号向 LED 控制器调控光遗传学照明。其他刺激方式（如振动电机和热加热器）可通过数字或模拟信号进行控制。该刺激控制器实现刺激与图像记录的同步 通过 相机信号，由开源的 Micro-Manager 显微镜控制软件指定（µ经理16。参见 材料清单 有关本方案中使用的所有材料、试剂、设备和生物体的详细信息。
- 设置神经成像设备，包括配备GFP光学元件的落射荧光显微镜、具有数字曝光输出信号的sCMOS相机以及刺激控制器15.
- 将刺激控制器连接到目标系统 通过 数字或模拟信号。以下示例中使用的系统如下：
- 使用阀门控制器进行化学刺激。将阀门控制器连接至流体电磁阀或夹管阀（图1)
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结果
我们展示了多种刺激模式示例，用于评估不同的神经现象，包括时间抑制、适应和去抑制。 时序性抑制 是指对紧随初始呈现之后出现的第二次刺激呈现所产生的神经反应的瞬时抑制。14为验证这一现象，在配对脉冲实验中，我们呈现了八种刺激模式，每种模式由两个持续1秒的气味脉冲组成，脉冲间隔时间范围为0秒至20秒。图 6B；参见 图 3B （对应刺激控制文件）。实验区域设置单一刺激液（1.1 µM 二乙酰)、缓冲液和对照流路管，未使用的入口端口用实心销钉封堵。图 6A）。通过开启阀门1，控制液进入 ctrl1 入口，切换流体流路，使刺激物进入实验区；当阀门1关闭时，对照流体进入。 ctrl2 入口，缓冲液流经实验区（参见 图 2G,H)。尽管首个持续1秒的二乙酰.......
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讨论
在本实验方案中，我们描述了一种开放获取的显微成像系统，该系统通过精确控制不同刺激模式的时间序列，用于评估神经活动现象。该微流控平台能够在保持数十个样本始终处于显微镜视野内的同时，重复递送可重现的刺激。目前市面上的商业显微镜软件中，仅有少数支持便捷地编程设置多种刺激时间模式，而具备此功能的软件通常需要手动输入每个刺激模式或依赖专有文件格式。相比之下，本系统通过文本文件定义实验流程，这些文件既可由计算机自动生成，也可被数据分析软件直接读取。本文展示了利用可变刺激模式评估神经元现象（如时间抑制、适应性以及多模态刺激下的信号串扰）的有效性。数据分析流程可将庞大的显微成像视频文件转化为神经活动数据，进而用于可视化和分析群体间的变异性（图5B）、随时间变化的趋势（图7C 和 图8C、D），以及扰动后的变化情况（图7C）。
自动化的一个关键优势在于能够.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Fox Avery 对这些方案的测试和对稿件的审阅，感谢 Eric Hall 提供编程协助。本文所述方法的部分经费由美国国家科学基金会 1724026（D.R.A.）提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌菌株 | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis 遗传中心 (CGC) | Cat# OP50 | |
| 实验模型：生物体/菌株 | |||
| C. elegans 菌株，在目标神经元中表达 GCaMP（可选地，同时表达 Chrimson） | Caenorhabditis 遗传中心 (CGC) 或已发表文献的通讯作者 | 例如 NZ1091 | |
| 化学品、处理试剂及线虫制备耗材 | |||
| 2,3-丁二酮 | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | 二乙酰，示例化学刺激物 |
| 氯化钙，CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| 荧光素钠盐 | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| 玻璃防水涂层剂 | Rain-X | Cat #800002250 | 玻璃疏水处理（一次性使用） |
| 氯化镁，MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| 线虫生长培养基（NGM）琼脂 | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| 培养皿（60 mm） | Tritech | Cat #T3305 | |
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS）：Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| 磷酸氢二钾 | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| 氯化钠，NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷（TFOCS） | Gelest | CAS# 78560-45-9 | 玻璃疏水处理（耐用型） |
| 软件与算法 | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| 显微镜控制软件 | Albrecht 实验室 | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker 数据分析软件 | Albrecht 实验室 | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| 自动化显微镜与刺激系统 | |||
| Axio Observer.A1 倒置显微镜，配置落射荧光系统（GFP 滤光片组，5× 物镜或类似规格） | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED 照明器 | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 数字 sCMOS 相机 | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 三通微型隔膜隔离阀（LQX12） | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | 阀门 1：控制 |
| 二通常闭（NC）夹管阀 | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | 阀门 2：流出 |
| 三通夹管阀 | NResearch | Cat #161P091 | 阀门 3：刺激选择 |
| 光遗传学刺激 LED 及控制器（615 nm） | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S 和 #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 数字/手动阀门控制器 | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| 导线与连接器 | 多种来源 | 参见 Cell STARS 方案中的图 2（Lawler, 2021） | |
| 微流控装置制备 | |||
| Dremel 可调速旋转切割器 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | 切割玻璃时设定转速为 5,000 RPM |
| Dremel 钻台旋转工具工作站 | Dremel | Cat #220-01 | |
| 金刚石钻头 | Dremel | Cat #7134 | |
| 载玻片，厚度 1 mm | VWR | Cat #75799-268 | |
| 玻璃刻划笔（金刚石刻划器） | Ted Pella | Cat #54468 | |
| 鲁尔三通旋塞阀 | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| 鲁尔 23G 钝头针 | VWR | Cat #89134-100 | |
| 微流控装置 | 通讯作者提供，或根据本文附带的 CAD 文件自行制备 | N/A | |
| 微流控装置夹具 | Warner Instruments（或机械加工车间） | P-2 | |
| 微流控管路，内径 0.02″ | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| 管路 19G，0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
参考文献
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H.
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重印与许可
