需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

自动化多模态刺激与同步记录多种小型生物的神经元活动

2.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65042

⸱

2023年3月3日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Graduate School of Biomedical Sciences, UMass Chan Medical School, 3Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

本文内容

摘要

我们介绍一种灵活的化学和多模式刺激方法，可同时对多条秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）进行神经活动的刺激与记录。该方法结合微流控技术、开源硬件与软件，以及有监督的自动化数据分析，能够测量神经元现象，如适应性、时间抑制和刺激串扰。

摘要

荧光遗传编码钙指示剂极大地促进了我们对从单个神经元到整个脑环路水平神经动态的理解。然而，神经反应可能因先前经验、内部状态或随机因素而有所不同，因此需要能够同时评估大量个体神经功能的方法。尽管大多数记录技术一次仅检测单个动物，本文介绍了利用宽场显微镜技术，同时对数十个秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）或其他亚毫米尺度生物体进行神经元活动记录的方法。开源硬件与软件使得编程完全自动化的实验具有高度灵活性，可精确控制化学、光学、机械、热和电磁等多种刺激的强度与时间。特别是微流控流动装置，能够以亚秒级时间分辨率对化学感受刺激实现精确、可重复且定量的控制。随后，NeuroTracker半自动化数据分析流程可提取个体及群体范围的神经反应，揭示神经兴奋性与动态功能的变化。本文展示了测量神经元适应性、时间抑制以及刺激串扰的应用实例。这些技术提高了刺激的精确性与可重复性，支持对群体变异性的研究，并可推广应用于从小型生物系统（包括细胞、类器官、完整生物体乃至植物）中的其他动态荧光信号检测。

引言

钙成像技术使得利用荧光显微镜和在靶细胞中表达的基因编码钙指示剂，能够以非侵入方式实时记录体内神经活动动态1,2,3。这些传感器通常采用绿色荧光蛋白（GFP），例如GFP-钙调蛋白-M13肽（GCaMP）家族，在神经元激活及细胞内钙离子浓度升高时增强荧光强度。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，钙成像技术尤其强大，可用于研究神经元和神经回路在活体、行为状态下的动物中的功能4,5,6,7,8,9,10，因其身体透明，无需手术即可实现光学观测，且可通过细胞特异性基因启动子将表达靶向至目标细胞。这些技术常结合微流控装置使用，后者可在微小物理尺度上提供精确控制的环境，用于研究生物学、化学和物理现象11,12。目前已有大量用于测量神经活动的微流控装置设计，且新设计不断涌现，研究实验室可方便地自行制备。然而，许多设计一次仅能固定单个动物，限制了实验通量7,9,13。由于个体先前经历、应激或饥饿等内部状态差异，或基因表达水平等随机因素，神经反应在不同动物间常表现出显著变异。这些差异促使人们需要发展能够同时刺激并观察多个动物，并从个体中提取信息的方法4。

此外，某些神经调节现象仅在特定刺激条件下才会显现，例如时间抑制14，即当刺激快速连续发生时，神经反应会出现短暂的抑制。为此，电生理系统能够在广泛的刺激参数空间内驱动神经活动，调节例如电脉冲的电流、电压、频率、波形、占空比以及周期性刺激序列的时间特性。通过自然检测到的刺激或光遗传学系统进行的间接刺激，也将受益于类似范围的控制机制。目前，许多自然刺激通常采用简单的"开关"方式呈现，例如气味的施加与移除，而现有的商用系统在增加灵活性方面进展缓慢。然而，如今低成本的微控制器已能够以可定制化的方式自动递送多种类型的刺激。结合微流控技术，这些系统实现了提高实验通量和灵活性的目标，使得可在多个动物中同时测量其对多种精确刺激的神经反应4,6。多模态刺激还可用于进一步探究神经环路，例如在药物暴露等正交干扰前后及期间持续施加刺激，以监测神经兴奋性的变化4。低成本、开放式的显微系统在推动科学研究方面的优势显而易见，但在实际应用中，元件采购、系统搭建和性能验证的需求可能阻碍这些技术的广泛应用。

本方案旨在缓解其中一些技术难题。以往的方案主要关注微流控装置的使用和基本刺激9,15,17我们在此描述一种用于神经成像研究的灵活、自动化、多模态刺激递送系统的构建与使用方法 秀丽隐杆线虫 或利用先前描述的微流控装置的其他小型生物体4. 该开源系统已进行编程 通过 使用简单的文本文件定义实验，NeuroTracker 数据分析程序可从显微镜视频中半自动提取神经活动数据。我们以化学感受神经元 AWA 为例，展示该系统的应用，用于评估时间抑制、去抑制以及刺激串扰；AWA 神经元在响应不同食物气味时会发生去极化，或在表达光遗传学光敏离子通道时响应光照而发生去极化。5,6.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 神经成像设备

注：参见 Lawler 和 Albrecht15 有关构建成像与刺激系统的详细说明，该系统可控制显微镜照明时序、图像采集以及刺激递送（图1）。一个低成本的 Arduino Nano 刺激控制器通过数字信号向阀门控制器驱动流体阀，并通过模拟电压信号向 LED 控制器调控光遗传学照明。其他刺激方式（如振动电机和热加热器）可通过数字或模拟信号进行控制。该刺激控制器实现刺激与图像记录的同步 通过 相机信号，由开源的 Micro-Manager 显微镜控制软件指定（µ经理16。参见 材料清单 有关本方案中使用的所有材料、试剂、设备和生物体的详细信息。

  1. 设置神经成像设备，包括配备GFP光学元件的落射荧光显微镜、具有数字曝光输出信号的sCMOS相机以及刺激控制器15.
  2. 将刺激控制器连接到目标系统 通过 数字或模拟信号。以下示例中使用的系统如下：
    1. 使用阀门控制器进行化学刺激。将阀门控制器连接至流体电磁阀或夹管阀（图1)15.
    2. 使用安装在显微镜载物台上方的615 nm红色LED及其控制器进行光遗传学刺激。
  3. 使用显微镜控制软件设置计算机，创建包含设备参数的配置预设， 并确保刺激控制的正常运行15.

2. 微流控装置的制备

注意：有关获取或制作母模以及微流控装置的生产、使用和清洗的详细信息，请参见 Lagoy 等人17。这些步骤在下方进行了简要总结。

  1. 使用提供的微流控设计文件（albrechtlab.github.io/microfluidics）17 获取或制作母模。对于成年早期的 C. elegans，确保通道高度为 55–70 µm。
  2. 按 10:1 的质量比混合 PDMS 基底与固化剂，并用移液管充分混合。
  3. 在真空干燥器中脱气 30–60 分钟，直至气泡完全消失。
  4. 将母模放入一个大（直径 150 mm）培养皿中，倒入脱气后的 PDMS 至 4–5 mm 深度（约 100 g）。用移液管检查并清除任何灰尘或气泡。
  5. 在水平烘箱中以 65 °C 烘烤 3 小时至过夜。
  6. 固化后，使用解剖刀将 PDMS 从模具上切下，并用直刃剃刀片分离各个装置。
  7. 使用 1 mm 皮肤打孔器打出入液口和出液口，并依次用 dH2O、乙醇和 dH2O 清洗孔道。用气流吹干装置（见 图 2A）。
  8. 用胶带清洁 PDMS 装置的两面，去除任何灰尘或碎屑。
  9. 按文献所述17 准备玻璃载片以完成微流控装置。使用金刚石钻头在顶片上钻出入口孔，并通过 TFOCS 蒸气处理或疏水性玻璃涂层使底片具有疏水性（图 2B）。
  10. 将玻璃-PDMS 装置夹心结构装入夹具中（图 2C）。

3. 动物准备

  1. 获取或构建在目标神经元中表达遗传编码钙指示剂的动物。
    注：例如，品系 NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::dsRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) 在 AWA 感觉神经元对中表达 GCaMP 以及对红光敏感的阳离子通道 Chrimson6。这两个转基因均整合至基因组中，可在每只动物中实现稳定表达。
  2. 实验前一天，将每组至少 20 只 L4 幼虫期的 C. elegans 转移至接种了 OP50 E. coli 菌苔的线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上。在 20 °C 条件下培养，可使野生型动物于次日同步化至年轻成虫阶段。
    注：对于转基因阵列，应使用荧光体视显微镜挑选动物，以确保所选个体中存在转基因表达。

4. 溶液配制

  1. 从10x储存液配制1x S基础缓冲液（100 mM NaCl 和 0.05 M KPO4，pH 6.0）。
  2. 通过将1 M储存液稀释至1x S基础缓冲液中，配制1 mM四甲唑缓冲液。使用该麻痹缓冲液配制所有刺激溶液。一次实验通常使用约150 mL。
  3. 向“对照”缓冲液储液槽中加入0.1–1 µg/mL荧光素，以可视化液体流动。
  4. 通过连续稀释法配制所需终浓度的刺激溶液。例如，可通过先配制10−3的储存液，再进一步稀释获得10−7的二乙酰刺激物溶液。
    注意： 可在刺激液或缓冲液中添加少量荧光素（0.1–1 µg/mL）以验证刺激时序，但浓度应尽可能低，以避免对神经荧光信号造成干扰。

5. 微流控装置的制备

注意：有关储液池制备、装置设置及动物装载的视频方案，请参见 Reilly 等人9。另请参见 Lagoy 等人17 提供的书面方案，其中包含许多实用建议。

  1. 准备三个或更多液体储液罐。每个储液罐连接一个30 mL或60 mL的储液注射器、一个3 mL的预充注射器和一根针头短管至一个三通鲁尔阀（图2D）。将针头连接至末端带金属管的微孔管路。标记各储液罐，将其安装在固定于铁架台的支架上，并注入相应的缓冲液或刺激液（图2E）。
  2. 将组装好的微流控装置置于真空干燥器中脱气约1小时。
  3. 使用预充注射器填充储液罐管路并排除其中的气泡。用缓冲液填充出口管路。
  4. 将微流控装置从真空环境中取出，迅速插入出口管路，并通过装置注入液体，直至某一入口处出现液滴。
  5. 在该入口处，采用“液滴对液滴”连接方式17插入对应的流体入口管（图2F）。确保入口管和装置端口孔上均有液滴存在，以避免引入气泡。
  6. 从出口继续注入液体，连接下一个入口管，并重复此过程直至所有入口均被填充。在任何未使用的入口及线虫加样口插入实心阻塞针。
  7. 打开入口和出口的鲁尔阀以启动流体流动。使用显微镜实时成像软件检查装置入口和玻璃基底是否存在泄漏，以及流道或入口中是否存在气泡。
    ​注意：若存在气泡，请等待其被PDMS材料吸收。

6. 动物装载

注意：参见 Lagoy 等人17。

  1. 使用金属丝尖的“挑针”将年轻成虫转移到未接种的 NGM 琼脂平板上。
  2. 向平板中加入约 5 mL 的 1× S 基础缓冲液，使线虫处于游动状态。
  3. 将线虫吸入加样注射器（1 mL 或 3 mL 注射器，连接一段预先充满 1× S 基础缓冲液的软管）中。
    1. 在体视显微镜下，用一只手将软管末端移至液面以下，对准目标线虫，另一只手操作注射器将线虫吸入软管中。
    2. 仅将线虫吸入软管内，不要吸入注射器本体。
      注意：软管通常仅能容纳约 100 µL。可将线虫排出至局部区域，再用少量液体重新吸入软管。
  4. 关闭出口管路，取下线虫加样针，通过液滴对液滴连接方式将线虫加样注射器连接至装置。
  5. 轻柔地将线虫流入记录区域，建立缓冲液流动，并给予最多 1 小时的四甲咪唑处理以实现固定。
    ​注意：在固定期间，确保仅有缓冲液进入记录区域。此期间可关闭刺激液和对照液储液器，但在开始刺激实验前需打开并确认流动正常。

7. 自动化刺激与神经元记录

  1. 创建一个名为刺激定义的文本文件 "用户自定义采集设置.txt" 使用文本编辑器（例如记事本）打开包含自动图像采集刺激参数设置的文件（参见示例于 图3）。设置分为两个部分：
    1. 显微镜采集参数设置： 定义实验类型（单刺激或多重模式）、曝光与激发时间、试验持续时间及间隔，并设置保存目录。
    2. 刺激设置： 定义刺激控制参数。A "刺激指令" 指定在特定视频帧上发生的操作，其语法为 <字母代码><帧数>，其中字母代码对应关系为：A = 阀门1，B = 阀门2，C = 阀门3，L = LED 光源；此外，大写字母表示开启，小写字母表示关闭。LED 光源强度通过字母代码设定 "i" 0（关闭）到255（最大亮度）的数值。
      注意：LED 强度值从 0 到 255 可设置输出模拟电压从 0 V 到 5 V。此处使用的电流控制器具有线性强度缩放，其他控制器应使用光功率计进行校准。
      1. 对于仅包含一次重复刺激指令的单刺激实验，使用以下格式 图3A.
      2. 对于包含多个刺激指令的多模式实验，请使用以下格式 图3B。包括一个 "模式序列" 代表刺激模式顺序的数字序列。每种模式需在单独一行输入一个刺激指令。
        注意：伪随机序列或m序列可用于研究刺激历史依赖性。
  2. 运行显微镜控制软件。确认所有流体入口均已打开，且竞技场内的流速符合预期（参见 图2H），且在实时窗口中目标神经元处于聚焦状态。
  3. 关闭实时窗口并运行脚本 "MultiPattern_RunScript.bsh" 在软件内。
    注意：在不使用动物的情况下运行一次测试实验有助于验证流动和刺激是否正常。为每种刺激液替换不同浓度的荧光素可帮助观察和记录新的刺激模式。
  4. 实验结束后，拆卸微流控装置，并用水冲洗所有表面、管路和储液池。
    ​注意：所有组件若保持清洁，可重复使用数十次。确保储液器、管路和微流控装置保持湿润，或用气流彻底干燥，以避免盐结晶，盐结晶可能导致堵塞且难以清除。装置可用乙醇保存以达到灭菌目的，但重复使用前应彻底干燥。>65 ℃下 1 小时 °C)17.

8. 使用 NeuroTracker 进行数据分析

注意：NeuroTracker4,18,19 是一个用于 ImageJ/FIJI20 的软件插件，可用于追踪多个神经元和动物在实验过程中运动时的荧光强度。该插件将数据保存为文本文件，其中包含每个神经元的位置及经背景校正后的荧光强度（F）。荧光数据将归一化至基线荧光强度（F0），例如刺激前数秒的平均值，表示为 ΔF/F0 = (F -F0)/F0，该值可在群体水平上进行平均。

  1. 按照说明安装 NeuroTracker 脚本（github.com/albrechtLab/Neurotracker）。
  2. 通过点击 Plugins | Tracking | NeuroTracker 运行 NeuroTracker。
  3. 选择包含待追踪 .TIF 视频文件的文件夹，并选择所需的设置。
    注意：如果仅需追踪部分视频文件，请在提示时选择要分析的文件的数值范围。默认追踪设置适用于分辨率为 250 pix/mm 的非运动性动物。对于其他分辨率，请按比例调整参数。更多设置信息请参见用户指南19。
  4. 设置强度阈值，使神经元可见以便选择（图 4）。
  5. 使用 Image | Adjust 菜单打开 亮度/对比度 (B/C) 和 阈值 控制窗口。
  6. 在 B/C 窗口中，调节 最小值 和 最大值 滑块，直到神经元清晰可辨（图 4A）。
  7. 在 阈值 窗口中，勾选 暗背景 和 不要重置范围。
  8. 滑动帧滑块以观察神经元的运动和强度变化，注意记录需要排除追踪的个体，例如因与其他个体重叠而无法分辨的情况。
  9. 确定用于追踪的神经元。
  10. 对每个个体，调节阈值水平，确保在刺激前、刺激中和刺激后每一帧中，神经元上方的红色阈值区域均可见。
  11. 点击神经元以记录其位置和阈值水平。
  12. 对每个需要追踪的个体和神经元重复进行阈值调节和选择。良好的阈值水平示例见 图 4C，过高和过低阈值的示例分别见 图 4D、E。先前已选中的神经元将以一个小方框标示。
  13. 当所有神经元均被选中后，按下 空格键 开始追踪。
    注意：更多 NeuroTracker 使用示例请参见先前文献4,19。
  14. 监控每个个体的追踪过程，并进行必要的修正。
  15. 如果 NeuroTracker 暂停，说明已丢失神经元。请重新点击该神经元，并根据需要调整阈值水平。
  16. 如果积分框跳转到附近另一个个体或非神经元结构上，请按下 空格键 暂停，将 滑块 回退至第一个出错的帧，然后重新点击正确的神经元位置。

9. 数据探索与可视化

注意：MATLAB 分析脚本用于数据处理与可视化，并为每次分析生成摘要 PDF 文件。

  1. 在 MATLAB 中运行“NeuroTrackerSummary_pdf.m”文件，并选择包含 NeuroTracker 数据文本文件的文件夹。
  2. 等待生成摘要 PDF 文件，以验证追踪过程（图 5）。每只动物以编号标识（图 5A），可查看每只动物每次实验的神经反应，以评估群体间的变异性（图 5B）。
  3. 使用“databrowse.m”函数浏览神经数据，例如按实验编号（图 5C）、按动物编号（图 5D）、按刺激模式或其他类别进行分组。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

我们展示了多种刺激模式示例，用于评估不同的神经现象，包括时间抑制、适应和去抑制。 时序性抑制 是指对紧随初始呈现之后出现的第二次刺激呈现所产生的神经反应的瞬时抑制。14为验证这一现象，在配对脉冲实验中，我们呈现了八种刺激模式，每种模式由两个持续1秒的气味脉冲组成，脉冲间隔时间范围为0秒至20秒。图 6B；参见 图 3B （对应刺激控制文件）。实验区域设置单一刺激液（1.1 µM 二乙酰)、缓冲液和对照流路管，未使用的入口端口用实心销钉封堵。图 6A）。通过开启阀门1，控制液进入 ctrl1 入口，切换流体流路，使刺激物进入实验区；当阀门1关闭时，对照流体进入。 ctrl2 入口，缓冲液流经实验区（参见 图 2G,H)。尽管首个持续1秒的二乙酰...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

在本实验方案中，我们描述了一种开放获取的显微成像系统，该系统通过精确控制不同刺激模式的时间序列，用于评估神经活动现象。该微流控平台能够在保持数十个样本始终处于显微镜视野内的同时，重复递送可重现的刺激。目前市面上的商业显微镜软件中，仅有少数支持便捷地编程设置多种刺激时间模式，而具备此功能的软件通常需要手动输入每个刺激模式或依赖专有文件格式。相比之下，本系统通过文本文件定义实验流程，这些文件既可由计算机自动生成，也可被数据分析软件直接读取。本文展示了利用可变刺激模式评估神经元现象（如时间抑制、适应性以及多模态刺激下的信号串扰）的有效性。数据分析流程可将庞大的显微成像视频文件转化为神经活动数据，进而用于可视化和分析群体间的变异性（图5B）、随时间变化的趋势（图7C 和 图8C、D），以及扰动后的变化情况（图7C）。

自动化的一个关键优势在于能够...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Fox Avery 对这些方案的测试和对稿件的审阅，感谢 Eric Hall 提供编程协助。本文所述方法的部分经费由美国国家科学基金会 1724026（D.R.A.）提供。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细菌菌株
E. coli (OP50)Caenorhabditis 遗传中心 (CGC)Cat# OP50
实验模型：生物体/菌株
C. elegans 菌株，在目标神经元中表达 GCaMP（可选地，同时表达 Chrimson）Caenorhabditis 遗传中心 (CGC) 或已发表文献的通讯作者例如 NZ1091
化学品、处理试剂及线虫制备耗材
2,3-丁二酮Sigma-AldrichCat# B85307二乙酰，示例化学刺激物
氯化钙，CaCl2Sigma-AldrichCat# C3881
荧光素钠盐Sigma-AldrichCat# F6377
玻璃防水涂层剂Rain-XCat #800002250玻璃疏水处理（一次性使用）
氯化镁，MgCl2Sigma-AldrichCat# M2393
线虫生长培养基（NGM）琼脂GeneseeCat #: 20-273NGM
培养皿（60 mm）TritechCat #T3305
聚二甲基硅氧烷（PDMS）：Sylgard 184Dow ChemicalCat# 1673921
磷酸二氢钾Sigma-AldrichCat# P5655
磷酸氢二钾Sigma-AldrichCat# P8281
氯化钠，NaClSigma-AldrichCat# S7653
(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷（TFOCS）GelestCAS# 78560-45-9玻璃疏水处理（耐用型）
软件与算法
Arduino IDEArduinohttps://www.arduino.cc/en/software
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-managerMicro-managerhttps://micro-manager.org/
显微镜控制软件Albrecht 实验室https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker 数据分析软件Albrecht 实验室https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
自动化显微镜与刺激系统
Axio Observer.A1 倒置显微镜，配置落射荧光系统（GFP 滤光片组，5× 物镜或类似规格）ZeissCat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED 照明器ExcelitasCat #XYLIS
Orca Flash 4.0 数字 sCMOS 相机HamamatsuCat #C11440-22CU
Arduino nanoArduinoCat #A000005
三通微型隔膜隔离阀（LQX12）ParkerCat #LQX12-3W24FF48-000阀门 1：控制
二通常闭（NC）夹管阀Bio-Chem Valve IncCat #075P2-S432阀门 2：流出
三通夹管阀NResearchCat #161P091阀门 3：刺激选择
光遗传学刺激 LED 及控制器（615 nm）MightexCat #PLS-0625-030-S 和 #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 数字/手动阀门控制器AutoMate ScientificCat #01-18
导线与连接器多种来源参见 Cell STARS 方案中的图 2（Lawler, 2021）
微流控装置制备
Dremel 可调速旋转切割器 4000 DremelCat #F0134000AB切割玻璃时设定转速为 5,000 RPM
Dremel 钻台旋转工具工作站DremelCat #220-01
金刚石钻头DremelCat #7134
载玻片，厚度 1 mmVWRCat #75799-268
玻璃刻划笔（金刚石刻划器）Ted PellaCat #54468
鲁尔三通旋塞阀Cole-ParmerCat #EW-30600-07
鲁尔 23G 钝头针VWRCat #89134-100
微流控装置通讯作者提供，或根据本文附带的 CAD 文件自行制备N/A
微流控装置夹具Warner Instruments（或机械加工车间）P-2
微流控管路，内径 0.02″Cole-ParmerCat #EW-06419-01
管路 19G，0.5″New England Small TubeCat #NE-1027-12

参考文献

  1. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
  2. Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008(2014).
  3. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  4. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
  5. Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
  6. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217(2018).
  7. Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
  8. Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
  9. Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026(2017).
  10. Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
  11. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
  12. Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
  13. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  14. Cohen, R. A. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. , Springer. New York, NY. 2480-2481 (2011).
  15. Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532(2022).
  16. Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10(2014).
  17. Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
  18. NeuroTracker. GitHub. , Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022).
  19. NeuroTracker User Guide. GitHub. , Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
  22. Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074(2019).
  23. Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234(2017).
  24. Boulin, T. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

自动化神经元记录微流控装置宽场显微镜秀丽隐杆线虫钙成像神经群体变异性基因编码指示剂NeuroTracker 分析刺激模式编程
自动化多模态刺激与同步记录多种小型生物的神经元活动
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。