用于胆道闭锁研究的慢性肝纤维化小鼠模型

摘要

我们建立了一种小鼠慢性肝纤维化模型，该模型为胆道闭锁（BA）相关的病毒诱导肝纤维化机制研究提供了合适的动物模型，同时也为未来BA的治疗提供了一个研究平台。

摘要

胆道闭锁（BA）是一种导致阻塞性黄疸的致命性疾病，也是儿童肝移植最常见的指征。由于其病因复杂且发病机制尚不明确，目前仍缺乏有效的药物治疗手段。当前，由恒河猴轮状病毒（RRV）诱导的经典BA小鼠模型是研究BA发病机制最常用的动物模型。该模型表现为生长迟缓、皮肤和黏膜黄疸、陶土样大便以及深黄色尿液。组织病理学显示严重的肝脏炎症以及肝内和肝外胆管阻塞，与人类BA的症状相似。然而，该模型终末期小鼠的肝脏缺乏纤维化特征，无法完全模拟临床BA中肝纤维化的特性。本研究通过在每次间隔2天的情况下连续四次注射5-10 µg抗Ly6G抗体，建立了一种新型的慢性肝纤维化BA小鼠模型。结果显示，部分小鼠在一定时间后成功形成了具有典型纤维化的慢性BA，表明这些小鼠可作为研究病毒诱导BA肝纤维化机制的合适动物模型，并为未来BA治疗策略的开发提供了一个有效平台。

引言

胆道闭锁（biliary atresia, BA）是一种常见于婴幼儿的严重肝胆系统疾病，其特征为闭塞性胆管病，临床表现为新生儿黄疸和白陶土样大便¹。该病的临床特点为肝内和肝外胆管的炎症性破坏以及进行性纤维化，最终发展为肝功能衰竭²。据统计，亚洲国家胆道闭锁的发病率高于欧美国家，亚洲地区的发病率为1/8,000。胆道闭锁的病因包括病毒感染、胆管发育异常、免疫紊乱以及遗传变异³。Kasai手术是目前改善胆道闭锁患儿胆汁淤积最常用的方法，但该手术最终无法阻止纤维化的进展⁴。目前胆道闭锁的治疗主要依赖肝移植，但受限于供肝来源的缺乏。深入研究胆道闭锁的发病机制是解决该疾病挑战的最直接途径。然而，目前对胆道闭锁发病机制的研究主要依赖于动物模型，因此选择合适的动物模型至关重要。

大多数胆道闭锁（BA）的组织病理学研究显示，胆管增生（BDP）、胆栓形成和门静脉纤维化是BA最重要的病理特征，同时存在不同程度的其他病理表现，如门管区炎性细胞浸润和肝细胞肿胀^5,6。目前已有多种模拟BA的小鼠模型，例如长期喂食3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢吡啶（DDC）的小鼠模型，其表现为节段性胆管阻塞及累及肝外胆管的胆管周围炎⁷；以及通过腹腔注射四氯化碳建立的肝纤维化小鼠模型⁸。胆管结扎（BDL）模型的特点是出现黄疸和快速进展的门静脉纤维化⁹。喂食α-萘基异硫氰酸酯（ANIT）的小鼠模型则表现为局限于肝内胆管的胆管炎及肝细胞损伤¹⁰。通过延迟接种恒河猴轮病毒（RRV）可诱导产生持续黄疸的小鼠模型¹¹。尽管目前已建立多种动物模型，尤其是小鼠模型，但每种模型均存在各自的局限性。这些模型仅能模拟BA的部分疾病特征，例如胆道闭锁过程中的急性炎症或肝纤维化，尚无一种模型能与BA的疾病进程和病理特征高度一致。

经典的胆道闭锁（BA）小鼠模型由RRV诱导产生，该模型与人类BA最为相似。然而，尽管RRV诱导的BA模型小鼠表现出与某些肝外胆道闭锁相似的临床症状和病理特征，但该模型缺乏肝纤维化表现，这极大地限制了对BA发病机制的深入研究以及新疗法的开发¹²。因此，本研究建立了一种新型的伴有慢性肝纤维化的BA小鼠模型。在出生当天接种RRV之前，通过腹腔注射抗Ly6G抗体，随后每间隔2天注射一次，共注射四次，每次剂量为5–10 µg。结果显示，小鼠的BA症状得到改善，生存时间延长，并进入慢性纤维化阶段。该模型不仅模拟了BA的急性期反应，还再现了肝脏损伤及进行性纤维化的过程。因此，这是一种更适用于BA机制研究的动物模型，可为未来BA治疗策略的开发提供理论依据。

Gr-1分子是一种髓系来源的细胞表面标志物，最初发现其在中性粒细胞中表达¹³。使用抗Ly6G抗体清除后，循环中性粒细胞数量可减少90%以上，并改变其他免疫细胞的活化反应。已有多个研究利用特异性清除抗体报道了Gr-1⁺细胞群体的功能，发现其对细胞因子及介导的免疫保护作用具有不同影响¹⁴。我们研究了Gr-1⁺细胞在RRV接种的BA小鼠模型中的功能。然而，由于尚未在人类中发现Gr-1分子的表达，因此在BA患者中研究了类似分子CD177¹⁵。我们的数据证实了Gr-1⁺细胞群体在疾病慢性纤维化阶段的重要作用，并提供了一个合适的动物模型，可用于探索潜在的BA治疗方法。

方案

本研究经广州永诺生物医药动物中心机构动物护理和使用委员会批准（IACUC-AEWC-F2208020），所有动物实验均在此机构进行。

1. 慢性纤维化胆道闭锁小鼠模型的建立

注意：所有动物均在同一房间内的无特定病原体（SPF）环境中饲养，实验在普通环境中进行。选择妊娠第12.5天的BALB/c小鼠（年龄：10–12周；体重：35–40 g），在25°C、12小时明暗循环条件下、无特定病原体的房间内饲养，并可自由摄取经高压灭菌的食物和水。出生后24小时内（平均体重：1.5–1.6 g）的新生小鼠被选用于小鼠胆道闭锁模型。

1. 按照先前报道的方法制备RRV¹⁶。
   注意：由于模型小鼠存活状况较差，需在21日龄时将其分笼饲养，以避免被同笼其他小鼠咬伤甚至咬死。
2. 将新生小鼠分为三组：对照组、RRV组和RRV + 抗-Ly6G组。出生后24小时内，向新生小鼠腹腔注射20 µL RRV（滴度：1.5 × 10⁶ PFU/mL）（RRV组）或生理盐水（对照组）。为耗竭Gr-1⁺细胞，在RRV注射前4小时，每只小鼠预先腹腔注射5 µg抗-Ly6G抗体。
   注意：抗-Ly6G抗体溶液应保存在2–8 °C，不可冷冻。使用前取出，室温放置30分钟使其回温。
3. 从RRV注射当天起，每隔3天向小鼠腹腔注射10 µg抗-Ly6G抗体，直至第12天（图1A）。
4. 每日观察并记录所有小鼠的外观、体重及存活情况。

2. 小鼠腹腔注射

1. 将新生小鼠从笼中取出。使用1 mL胰岛素注射器注射20 µL RRV溶液或50 µL抗Ly6G抗体溶液。用一只手的食指和拇指捏住幼鼠颈部皮肤，并用无名指和小指轻轻固定其后肢，以暴露腹部。
2. 将针头向上倾斜抬起。以15°角将针头插入小鼠右后肢大腿中部的皮下，沿皮下路径推进，直至针尖到达小鼠右侧肋缘处，随后将针头转向下方进入腹腔，将液体注射至小鼠肝脏下方。
   注意：新生小鼠的胃和脾脏位于左腹部。若从左侧进针，容易刺破胃部或 导致脾脏出血。
3. 注射完成后立即拔出针头，观察注射部位是否有出血或渗漏。如有，用灭菌棉球擦拭，并将小鼠放回母鼠笼中。
   ​注意：为减少注射过程中液体渗漏对实验结果的影响，操作时应轻柔，缓慢拔出针头，并用棉签按压注射部位30秒。

3. 样本组织的采集

1. 第12天，通过吸入4%异氟烷对小鼠进行麻醉，并在显微镜下进行解剖。将1 mL胰岛素注射器插入小鼠心脏的左心室以采集血液。采血后，通过吸入4%异氟烷持续10分钟实施安乐死。在室温下以400 × g 离心5分钟，分离血清用于肝功能检测。
   注意：血液采集必须在小鼠存活状态下进行。若小鼠死亡，血液将滞留在血管中而无法采集。
2. 拍摄肝脏和胆管的整体外观照片。随后使用剪刀和镊子将小鼠肝脏和脾脏从周围组织中分离出来。
   ​注意：肝脏及其他组织采集后，应保存于−80°C用于RNA和蛋白质提取，或浸入10%福尔马林中用于制备组织学标本。

4. 肝外胆管的荧光素血管造影

1. 处死小鼠后，使用剪刀和棉签完全暴露肝脏、胆囊和肝外胆管。
2. 在体视显微镜下观察，用1 mL胰岛素注射器向胆囊内注射5–10 µL荧光染料罗丹明123（20 mg/mL），并拍照。该操作步骤与先前报道的方法相同¹⁶。
   注意：同一组中的不同小鼠分别用于组织样本采集和荧光血管造影。

5. H&E 染色

1. 将新鲜的小鼠肝脏组织浸入10%福尔马林中固定24小时。
2. 将组织包埋于石蜡中后，使用石蜡切片机将石蜡块切成4 µm厚的切片，并将两张连续切片置于同一张载玻片上。操作需由有经验的人员完成，以标准化操作流程并避免割伤手指¹⁷。
3. 将切片放入切片架中，依次用二甲苯脱蜡，再经无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和蒸馏水逐级水化，每步浸泡5分钟。
4. 用苏木精溶液染色5分钟，再用1%盐酸乙醇（75%酒精）分化5秒，自来水冲洗后，用伊红溶液复染1分钟。

6. CK19 和 F4/80 免疫组织化学染色

1. 前三个步骤与H&E染色部分的组织包埋、切片和脱蜡步骤相同。
2. 使用Tris-EDTA缓冲液（10 mmol/L Tris碱，1 mmol/L EDTA溶液，pH 9.0）进行抗原修复，将切片置于微波炉中95°C加热10分钟，然后取出并自然冷却至室温。
3. 将组织切片放入3%过氧化氢溶液中孵育10分钟，以去除内源性过氧化物酶。
4. 用5%山羊血清处理切片，以封闭非特异性结合位点。
5. 向切片中加入大鼠抗小鼠细胞角蛋白19（cytokeratin 19）或大鼠抗小鼠F4/80单克隆抗体，4 °C孵育过夜。
6. 在室温下用适当的二抗孵育切片30分钟。
7. 以3,3'-二氨基联苯胺（DAB）作为显色剂，在显微镜下观察显色反应。
8. 在40倍显微镜下观察切片并拍照，根据需要进行分析。

7. Sirius Red 染色

1. 按照苏木精-伊红（H&E）染色部分所述，完成组织包埋、切片和脱蜡的前三个步骤。
2. 组织切片经苏木精复染后，在室温下每张切片加50 µL Sirius Red染液，染色1小时。
3. 将载玻片在室温下自然干燥4小时，每张切片滴加一滴中性树胶，盖上盖玻片，缓慢覆盖组织以避免产生气泡。将切片在室温下放置24小时，使中性树胶完全固化。
4. 使用偏振光显微镜观察胶原沉积的细节；选择清晰且合适的视野，调节显微镜视野的亮度和白平衡。获取图像，并根据需要在40倍镜下进行分析。

结果

出生后24小时内，小鼠腹腔注射5 µg抗Ly6G抗体，4小时后腹腔注射20 µL RRV。随后每隔3天注射10 µg抗Ly6G抗体，直至第12天（图1A）。RRV组小鼠的中位生存时间为13天。相反，大多数接受抗体处理的小鼠出现轻度黄疸，但未观察到体重下降（图1C）。约20%-30%的小鼠表现出胆道闭锁（BA）综合征，表现为长期黄疸和低体重，但存活超过42天。抗Ly6G抗体处理后，Gr-1⁺细胞数量减少¹⁵，小鼠进入慢性纤维化阶段，称为慢性BA。在第12天和第42天采集标本，天狼星红染色的组织切片显示肝纤维化程度逐渐加重。存活至42天的慢性BA小鼠用于后续详细分析。除体型较小外，这些小鼠的耳部、足部和尾部皮肤均表现出明显黄疸（图1E中的蓝色箭头）。RRV注射后第6天，小鼠粪便颜色变浅，尿液颜色加深；至第12天时，与对照组差异显著，RRV组小鼠表现为白色粪便和深黄色尿液。至第42天，慢性BA小鼠的尿液和粪便仍表现出明显的黄疸特征（图1D、E）。取出BA小鼠的肝脏并与对照组比较，发现肝脏体积减小（图2B），肉眼可见坏死病灶（图2A，黑色三角），并在肝外观察到一段胆管闭锁（图2A，白色星号）。

肝脏组织切片分析显示，低剂量抗 Ly6G 治疗可减轻门静脉炎症。然而，在第 42 天的肝组织切片中仍可观察到炎性细胞的聚集（图 3A）。天狼星红染色显示，在 RRV 注射后第 12 天，门脉区胶原沉积略有增加。此外，抗 Ly6g 抗体治疗后胶原表达未见显著变化，但在第 42 天的胆道闭锁（BA）组织样本中，胶原表达显著升高（图 3B）。在偏振光显微镜下观察发现，胶原纤维在邻近肝组织中积聚。在第 42 天的 BA 组织标本中可见大量胶原沉积，主要呈绿色（图 3C），而在存活至第 42 天但未增重的小鼠中，胶原沉积进一步加重。随着门脉炎症的减轻，在第 12 天可观察到 CK19⁺ 胆管细胞。然而到第 42 天，尽管 CK19⁺ 胆管细胞数量有所增加，成熟的胆管几乎无法检测到（图 4A，红色箭头指示胆管上皮细胞）。在慢性 BA 小鼠的肝外胆管病例中，通过对小鼠门脉区进行连续解剖发现，肝外胆管发生阻塞，并伴有巨噬细胞的炎性浸润（图 4B，黑色箭头指示巨噬细胞）。

与仅使用RRV处理相比，低剂量抗Ly6G抗体治疗可降低RRV接种后第12天的肝酶水平，从而减轻肝脏损伤。慢性BA组小鼠肝脏中的丙氨酸氨基转移酶和碱性磷酸酶水平高于正常对照组。最显著的变化体现在胆红素水平上，在急性BA阶段，RRV联合抗Ly6G处理的小鼠其总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）和间接胆红素（IBIL）水平较仅使用RRV组有所降低。而在慢性BA小鼠中，TBIL、DBIL和IBIL水平均升高（图5），表明在BA的慢性纤维化阶段，肝功能显著下降。

图1：抗Ly6G抗体治疗在感染RRV的小鼠胆道闭锁模型中的作用。（A）低剂量抗体诱导小鼠急性与慢性期胆道闭锁的示意图，箭头表示抗体和RRV注射的时间点。（B）正常对照组（Cont.）、恒河猴轮状病毒（RRV）组以及RRV+抗Ly6G抗体组小鼠的生存曲线。（C）各组小鼠的体重变化曲线。（D）各组小鼠在第12天时的代表性图像及其粪便和尿液情况。（E）各组小鼠在第42天时的代表性图像及其粪便和尿液情况。蓝色箭头指示黄色的耳朵和尾巴。本图已获Zhang等¹⁵许可转载。请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：抗Ly6G抗体治疗对RRV感染的小鼠胆道闭锁模型肝脏的影响。 （A）慢性BA小鼠（右侧）与正常小鼠在第42天的肝脏解剖结构及肝外胆管荧光血管造影比较。（B）慢性BA小鼠与正常小鼠肝脏大小的比较。黑色三角形表示慢性BA小鼠的肝坏死区域。白色星号表示肝外胆道闭锁。本图已获Zhang等¹⁵许可转载。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：正常对照（Cont.）组、恒河猴轮状病毒（RRV）组以及RRV联合抗Ly6G抗体组小鼠在第12天和第42天的肝组织切片。 （A）苏木精-伊红（H&E）染色的肝组织切片图像。（B）天狼星红染色显示胶原沉积（PSR）。（C）利用偏振光显微镜（Pol. Light）对切片进行进一步观察。缩写：PV = 门静脉。比例尺 = 50 µm。本图经Zhang等¹⁵修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：正常对照组（Cont.）、恒河猴轮状病毒（RRV）组以及RRV联合抗Ly6G抗体组在第12天和第42天肝组织切片的免疫组织化学染色结果。 （A）不同处理组中胆管上皮细胞标志物（CK19）的表达情况。（B）不同处理组中巨噬细胞的炎性细胞浸润情况。缩写：PV = 门静脉。红色箭头指示胆管上皮细胞，黑色箭头指示巨噬细胞。比例尺 = 50 µm。该图改编自Zhang等¹⁵。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：不同处理组小鼠肝功能的比较。 实验结束后采集小鼠血液，并送至医院检验科进行检测。每组包含3至5只小鼠。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。缩写：ALT = 丙氨酸氨基转移酶；AST = 天冬氨酸氨基转移酶；ALP = 碱性磷酸酶；TBIL = 总胆红素；DBIL = 直接胆红素；IBIL = 间接胆红素。该图已根据 Zhang 等人¹⁵ 的研究修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

在本研究中，我们采用抗 Ly6G 抗体清除或减少感染 RRV 的胆道闭锁小鼠模型中的 Gr-1⁺ 细胞，以改善急性胆道闭锁综合征、延长存活率，并促使胆道闭锁小鼠进入慢性阶段。降低抗体剂量可导致出现伴有肝纤维化的慢性胆道闭锁，这表明 Gr-1⁺ 细胞的数量变化影响胆道闭锁在急性和慢性阶段的疾病结局。在我们之前的研究中，给予抗 Ly6G 抗体后，Gr-1⁺ 细胞数量减少，胆道闭锁小鼠的整体生存状况得到改善¹⁵。同时，已有报道指出，Gr-1⁺ 巨噬细胞¹⁹、Gr-1⁺ 中性粒细胞²⁰、Gr-1⁺ 髓系细胞²¹ 以及 Gr-1⁺ 粒细胞在某些动物模型中可促进纤维化²²。然而，在本研究中，使用低剂量抗 Ly6G 抗体部分耗竭了小鼠体内的 Gr-1⁺ 细胞，但胶原沉积仍然存在。因此，可能需要更长时间才能更彻底地控制疾病进展。

应用抗Ly6G抗体可减轻炎症，部分保留胆管，并防止小鼠因胆道闭锁（BA）引起的急性死亡。然而，仅有20%至30%的小鼠进入BA的慢性阶段；这可能与抗Ly6G抗体注射的时间点和注射次数有关。我们需要进一步探索这一关键点，以提高实验成功率。此外，我们认为不仅Gr-1⁺细胞，其他免疫细胞如自然杀伤细胞（NK细胞）、T细胞、B细胞和巨噬细胞也可能发挥重要作用。

关于实验方案，需要注意一些细节。（i）为避免注射药物外漏，我们使用带有直径为0.33 mm针头的1 mL胰岛素注射器，因为针头直径较小，针头在组织上形成的孔洞也较小，有利于降低药物泄漏的可能性。（ii）注射前应固定小鼠，防止其移动，以避免药物泄漏，从而进一步保证实验效果。（iii）在注射药物时，应尽可能将药物注射至小鼠肝脏表面或下缘位置，使药物进入腹腔并充分接触肝脏以发挥效应。（iv）通常从小鼠右上腹部进行注射，因为新生小鼠的胃和脾脏位于左腹部，且胃内充满乳汁。若从左侧进针，容易刺破胃部导致乳汁流入腹腔，或刺破脾脏引起出血。

CD177 是 Ly6G 的同源物，已有研究探讨了 CD177 在胆道闭锁（BA）患者中的表达。CD177 可作为儿童 BA 早期诊断的标志物，表明 CD177⁺ 细胞在 BA 病程中发挥重要作用²³。通过分析 RNA 测序数据，我们团队发现 CD177 细胞是 Gr-1⁺ 细胞中的优势群体；同时，用 RRV 疫苗接种的 Cd177^−/− BALB/c 小鼠表现出 BA 发病延迟，且发病率和死亡率降低¹⁸。因此，我们的慢性 BA 小鼠模型在研究 BA 的发病机制和疾病进展方面具有明显优势；同时也为探索 BA 潜在治疗方法提供了合适的动物模型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Balb/c 小鼠	广东赛杰生物技术有限公司	20221000112
大鼠抗小鼠 Ly6G 抗体	Bio X Cell	克隆号 1A8	新罕布什尔州西黎巴嫩
大鼠抗小鼠细胞角蛋白 19 抗体	发育研究杂交瘤库	克隆号 TROMA III	爱荷华州爱荷华城
大鼠抗小鼠 F4/80 抗体	R&D Systems	MAB5580	明尼苏达州明尼阿波利斯
RRV 毒株	美国典型培养物保藏中心（ATCC）	MMU 18006	弗吉尼亚州马纳萨斯
荧光体视显微镜	Olympus	SZX7
Leica 光学显微镜	Leica Microsystems	Leica DMI8+DFC7000T	德国韦茨拉尔
日立前处理自动化系统	日立	7600 临床分析仪	日本东京
异氟烷麻醉剂	RWD	R510-22-10
罗丹明 123	Sigma-Aldrich	83702
天狼星红染料	Leagene	DC0041
石蜡切片机	Leica Microsystems	RM2235
中性树胶	Solarbio	G8590