一项针对人脐带间充质干细胞注射治疗糖尿病足溃疡的前瞻性、随机对照研究

摘要

本方案描述了一项前瞻性、随机、对照的临床研究，旨在评估人脐带间充质干细胞注射治疗慢性糖尿病足溃疡的效果。

摘要

随着社会和经济的发展，糖尿病足溃疡的发病率持续上升。目前临床实践中主要采用清创换药、高压氧和负压封闭引流等保守治疗方法，大面积创面常需进行植皮或皮瓣移植。然而治疗效果并不理想，且存在诸多并发症。由于糖尿病足溃疡病因复杂、病程长、伴随困难显著、致残率高，给患者、社会及医疗体系带来沉重负担。根据我们前期研究，人脐带血干细胞的药理作用包括非特异性免疫调节；促进生长因子、血管活性因子和抗炎因子的分泌；增强人体抗感染能力；消除炎症反应；以及促进血管生成和溃疡愈合。这些作用提示干细胞可能作为自体或异体治疗手段用于难治性创面的治疗。因此，我们正在本 clinic 针对符合纳入标准的糖尿病足溃疡患者，开展一项应用人脐带干细胞治疗难治性糖尿病创面的临床试验。

引言

糖尿病是一种影响全球人群的疾病，世界卫生组织（WHO）预测，糖尿病患者人数将从2010年的2.85亿增加到2030年的4.39亿¹。糖尿病足溃疡（DFUs）是糖尿病最严重的并发症之一，也是全球范围内导致非创伤性下肢截肢的主要原因^2,3,4,5。

近年来，由于干细胞具有多能性、自我更新能力以及促进再生性细胞因子分泌的作用，其作为治疗方法得到了蓬勃发展^6,7。一项既往的临床试验表明，脂肪来源的干细胞凝胶对慢性糖尿病足溃疡的治疗具有积极效果⁸。作者在59例患者中验证了使用干细胞治疗糖尿病创面的有效性。在第12周时，治疗组和对照组的创面完全闭合率分别为82%和53%，表明干细胞对难治性糖尿病创面的治疗是有效的。总体而言，干细胞所具备的再生、替代、修复和分化能力，为生命科学领域带来了无限希望⁹。

2008年，Dulchavsky等人¹⁰采用含有自体骨髓基质细胞（BMSCs）的移植物治疗了20例不同原因导致的难愈性伤口。组织学检查显示，其中18例患者的皮肤伤口完全实现了再上皮化。类似地，将异体非糖尿病来源的间充质干细胞（MSCs）植入明胶支架中，用于治疗糖尿病难愈性创面，可促进血管生成、增加再上皮化程度，并缩小溃疡面积¹¹。然而，在国内外临床研究中，干细胞治疗糖尿病足创面的案例仍较少；多数仅为病例报告或缺乏严格实验设计的探索性临床研究，具有良好设计的大样本研究或随机对照临床试验极为罕见。由于干细胞并非常规药物或生物制品，不同研究之间的制备方法和质量控制标准存在差异，因此某一项研究的数据可能无法全面反映同一种类所有干细胞的安全性。为此，我们进一步总结了与人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）相关的基础研究和非临床前实验，并系统评估了其临床应用的安全性和有效性。在此基础上，开发了通过注射人脐带来源间充质干细胞修复糖尿病足创面的治疗方法。本研究旨在验证干细胞修复糖尿病足创面在临床应用中的有效性和安全性。

总之，干细胞治疗具有广泛的应用前景和巨大的潜力，代表了一种有希望的新型医学治疗方法。在中国国家自然科学基金（编号：81571901、81501671 和 82172224）的持续支持下，我们开展了关于人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）治疗糖尿病创面的一系列研究。已在《Investigative Dermatology 杂志》、《Stem Cell Research and Therapy》和《Cell Death and Disease》等期刊发表相关论文20余篇，并申请了三项国家发明专利，积累了扎实的研究基础^12,13。本文提供了一种评估HUCMSCs注射用于糖尿病足创面修复的标准方法。该标准操作程序已获得中国药物临床试验批准（试验注册号：中国药物临床试验：MR-32-21-015759，[首次发布：2021年10月20日]）。

方案

本项前瞻性、单中心、随机、对照临床研究已获得徐州医科大学附属医院伦理委员会批准（批准号：XYFY2021-KL124-02）。研究自2021年7月启动，将持续至2023年7月；本实验共招募了60例患者。所有患者均签署了知情同意书，允许研究人员使用其临床资料和生物数据。

1. 患者招募

1. 纳入标准：
   1. 确保患者年龄在18至80岁之间（含18岁和80岁），性别不限。
   2. 确保患有2型糖尿病和糖尿病足溃疡的患者符合1999年世界卫生组织（WHO）诊断标准¹⁴，且在筛选期或随机分组前3个月内检测的糖化血红蛋白（HbA1c）水平≤10%。
   3. 确认目标肢体的踝肱指数¹⁵至少为0.8，且无间歇性跛行。
   4. 确保每位患者的溃疡具有以下特征：
      根据Wagner溃疡分级系统¹⁶为1级或2级。
      位于足部、踝部或小腿前侧。
      清创后横截面积为2–5 cm²。
      在随机分组前至少4周内肉眼未见脓液或坏死物质。
   5. 不将正在接受其他伤口常规治疗的患者纳入本研究。
      1. 若存在多个伤口，选择符合纳入标准且干预和评估面积最大的伤口。
      2. 若两个或以上伤口面积相近，则选择分级最严重的伤口。
      3. 若存在两个或以上面积和分级相同的伤口，则选择病程最长的伤口。
   6. 本临床研究的参与为自愿行为。确保患者配合研究医生，并签署知情同意书。
2. 排除标准：
   1. 排除具有明确手术指征的患者：包括血管闭塞、骨外露、脓肿、骨髓炎。
   2. 排除在入组前3个月内接受过血管重建术或血管成形术的患者。
   3. 排除存在肝功能损害的患者；特别是排除丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平高于正常值上限3倍的患者。
   4. 排除血清肌酐水平高于正常值上限2倍以上、血清白蛋白 <2.0 g/dL、正在接受免疫抑制药物治疗、患有各种恶性肿瘤以及妊娠、哺乳或近期有生育计划的患者。
   5. 排除对干细胞制备产品中任何成分有禁忌症、过敏或已知过敏的患者。
   6. 排除因其他情况导致研究者认为不应参与本研究的患者：
      1. 若入组后发现患者不符合最重要的入组标准，则予以排除。
      2. 排除出现严重不良反应、主动要求退出研究或其法定监护人要求退出研究的患者。
      3. 排除缺乏用药记录或有效入组后观察数据的患者。
3. 随机化与盲法
   1. 将来自徐州医科大学附属医院门诊招募的患者按1:1比例随机分配至干细胞治疗组和常规伤口治疗组。
   2. 治疗过程采用双盲试验设计。确保由第三方对每位患者的伤口面积进行测量。

2. 术前治疗

1. 患者入组后进行常规治疗前检查，包括血常规、尿常规、粪便常规、生化功能评估、凝血功能评估、病毒学检查等。确保患者在同一医院接受随访，以保证检查结果的准确性。
2. 纳入符合纳入标准且已签署书面知情同意书的患者。采用按比例抽样法，将每位受试者以1:1的比例随机分配至干细胞治疗组或常规创面治疗组。

3. 治疗步骤

注意：两组患者均每3天接受一次系统的常规换药。干细胞治疗组患者在入组后第1天、第8天、第15天和第22天共接受四次干细胞局部注射。常规伤口治疗组患者在入组后第1天、第8天、第15天和第22天共接受四次银离子敷料治疗。具体步骤如下。

图1：治疗过程。 每组30名患者将严格按照本研究中描述的方案接受治疗。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 干细胞治疗组
   1. 使用聚维酮碘对创面进行局部消毒，并用手术剪清除创面表面的坏死组织后，用注射器抽取50 mL生理盐水，彻底冲洗创面内外。
   2. 采用无菌箔边缘勾画法测量创面面积¹⁷。将带有坐标网格的无菌透明薄膜敷料贴附于创面，用记号笔沿其边缘描出创面轮廓，根据薄膜上每个坐标格的面积计算创面总面积。
   3. 将人脐带间充质干细胞（2 × 10⁵ 个细胞/cm²；0.4 mL/cm²）注射至创面周围及基底部（注射间距：0.75 cm；每点注射量：0.1 mL）。
      注：每位患者的注射次数根据创面面积而定。
   4. 将无菌敷料修剪至合适大小，覆盖于创面，并进行包扎。
2. 常规创面治疗组
   1. 使用碘伏对创面进行局部消毒，并用手术剪清除创面表面的坏死组织后，用注射器抽取50 mL生理盐水，彻底冲洗创面内外。
   2. 采用无菌箔边缘勾画法测量创面面积¹⁷。将带有坐标网格的无菌透明薄膜敷料贴附于创面，用记号笔沿其边缘描出创面轮廓，根据薄膜上每个坐标格的面积计算创面总面积。
   3. 将银离子敷料修剪至合适大小，覆盖于创面，并进行包扎。

图 2：足部溃疡面积测量示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 3：人脐带间充质干细胞注射示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

4. 观察指标

1. 获取受试者的 demographic 数据。
2. 记录合并治疗情况；具体记录伤口状况（部位、面积、深度、感染和缺血情况）、伤口愈合率、愈合时间及并发症。
3. 进行实验室检查。采集伤口分泌物进行拭子检查及细菌培养。进行血常规以及肝肾功能检测。

5. 随访

1. 在治疗的第一天以及末次治疗后的第15天和第30天随访时对患者进行检查。
2. 通过门诊和电话随访相结合的方式，记录治疗效果、病情变化、恢复情况及当前生活状态。

6. 结局疗效评估

1. 根据以下标准进行临床评估。
   1. 计算主要结局指标：
      30天创面愈合率 = （原始创面面积 − 30天时未愈合创面面积）/ 原始创面面积 × 100%。
   2. 计算次要结局指标
      1. 创面愈合时间：将创面闭合时间定义为创面完全再上皮化的时间点。
      2. 计算完全愈合率：
         完全愈合率 = 完全愈合病例数 / 总病例数 × 100%
   3. 计算手术干预率：
      手术干预率 = 接受手术干预的病例数 / 总病例数 × 100%。
      注：接受以下任一手术操作的受试者，记录为接受手术干预的患者：清创引流、植皮术、邻近皮瓣、远端皮瓣、非吻合皮瓣以及截肢术。
   4. 按照标准临床检验程序进行细菌培养¹⁸，并将检出≥1种病原体的培养结果记录为阳性。计算病原体阳性率：
      病原体阳性率 = 病原体检测阳性病例数 / 总病例数 × 100%。

7. 安全规程

1. 在发生不良事件（干细胞临床研究期间出现的任何疾病、新发症状、体征或实验室检查异常，或原有症状和体征的加重，无论该事件是否与临床研究用药相关）时，应采取必要的治疗和抢救措施。
2. 对所有不良事件及其治疗过程进行追踪和调查，并详细记录结果，直至事件得到妥善解决或病情稳定。若某项检查结果异常且具有临床意义，应持续随访直至其恢复正常。

结果

目前，我们的研究仍处于患者招募阶段，现已完成3例使用HUCMSCs治疗组的患者和3例使用银离子敷料的对照组患者，共计6例慢性糖尿病足创面患者。HUCMSCs治疗组患者溃疡面积的平均值为3.5 cm²，在接受HUCMSCs治疗后的第8、15和22天，该平均值分别减少至2.6 cm²、1.8 cm²和1.25 cm²（图4A-D）。对照组患者在使用银离子敷料治疗前的平均溃疡面积为1.25 cm²；在接受银离子敷料治疗后的第8、15和22天，平均溃疡面积分别减少至0.875 cm²、0.8 cm²和0.75 cm²（图5A-D）。两组患者的溃疡面积均有所改善，且未出现伤口感染或实验室检查异常等并发症。现有患者的数据已汇...

讨论

糖尿病足溃疡（DFUs）是一个重大的全球公共卫生问题，也是导致下肢截肢和健康相关生活质量下降的主要原因^19，20。目前，临床治疗仍以传统清创、高压氧治疗、负压封闭引流（VSD）和保守治疗为主。较大的创面常需进行皮肤及皮瓣移植。许多患者长期反复患病，导致严重的身心痛苦，生活质量受到极大限制²¹。因此，迫切需要更有效的DFU治疗方法。

干细胞治疗作为一种新型治疗策略，在多种疾病的治疗中具有广阔的应用前景²²。干细胞是再生医学的重要种子细胞，以其自我更新能力、修复受损组织能力以及多向分化潜能而著称²³。其中，人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）是研究最为广泛的细胞类型，具有免疫幼稚性、低免疫原性以及无致瘤性等特点²⁴。这些特性使HUCMSCs成为理想的干细胞来源。此外，HUCMSCs...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含银离子伤口敷料	山东正维医疗科技有限公司	20152640521	医用无菌银离子敷料（F型） 10 cm × 10 cm
人脐带间充质干细胞注射液	山东齐鲁细胞治疗工程技术有限公司	32183185-X	主要成分：人脐带间充质干细胞。药理作用：非特异性免疫调节剂，可增强生长因子、血管活性因子和抗炎因子的分泌，提高人体抗感染能力，消除炎症，促进血管新生及溃疡愈合。
无菌网状薄膜透明敷料	Smith & Nephew	20162644490	无菌网状薄膜透明敷料（用于伤口面积测量） 6 cm × 7 cm