用于成像程序性死亡配体1表达的68镓标记D-肽PET探针的开发

摘要

本研究基于 [⁶⁸Ga] D-十二肽拮抗剂的正电子发射断层成像，建立了一种无创且实时评估程序性死亡配体1在全身分布的方法。该技术相较于传统的免疫组织化学具有优势，可提高筛选适合接受免疫检查点阻断治疗患者的效率。

摘要

基于程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）的免疫检查点阻断疗法近年来彻底改变了癌症治疗格局。然而，由于肿瘤细胞中PD-L1的表达具有异质性，仅有部分患者对PD-1/PD-L1抑制剂产生应答。这种异质性给常用的免疫组织化学（IHC）方法精确检测肿瘤细胞带来了挑战。因此，亟需更优的方法对可能从免疫检查点阻断疗法中获益的患者进行分层，以提高治疗效果。正电子发射断层扫描（PET）能够以无创方式实时可视化全身PD-L1的表达情况。因此，有必要开发放射性标记的示踪剂，通过PET成像检测肿瘤中PD-L1的分布。

与左旋（L-）对应物相比，右旋（D-）肽具有抗蛋白水解以及代谢半衰期显著延长等特性。本研究设计了一种基于PET成像检测PD-L1表达的新方法 ⁶⁸Ga标记的靶向PD-L1的D-肽，一种D-十二肽拮抗剂（DPA），在荷瘤小鼠中的结果表明，[⁶⁸Ga]DPA 可特异性结合 PD-L1 高表达的肿瘤 体内，显示出良好的稳定性以及优异的成像能力，表明[⁶⁸Ga]DPA-PET 是一种用于评估肿瘤 PD-L1 状态的有前景的方法。

引言

免疫检查点蛋白的发现是肿瘤治疗领域的重大突破，推动了免疫检查点阻断疗法的显著进展¹。程序性死亡受体-1（PD-1）和程序性死亡配体-1（PD-L1）是具有潜力的药物靶点，已有多种针对这些靶点的抗体获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。PD-1由肿瘤浸润性免疫细胞表达，例如CD4⁺、CD8⁺ T细胞和调节性T细胞。PD-L1是PD-1的配体之一，在多种肿瘤细胞中呈过表达状态^2,3。PD-1与PD-L1之间的相互作用会抑制PD-1的活性，从而削弱抗肿瘤免疫应答⁴。这些研究结果提示，抑制PD-L1可能增强免疫细胞的杀伤效应，进而清除肿瘤细胞⁵。目前，显色免疫组织化学法（IHC）是最常用于识别最有可能对免疫检查点治疗产生应答的患者的方法^6,7。然而，由于肿瘤细胞中PD-L1的表达具有异质性，活检样本的IHC结果无法准确反映患者体内PD-L1的整体表达情况⁸。既往研究表明，仅有20%–40%的患者能从免疫检查点阻断治疗中获得长期益处^1,9,10。因此，迫切需要开发一种新方法，以克服因这些免疫检查点蛋白表达异质性所导致的假阴性结果。

分子成像技术（如正电子发射断层扫描，PET）能够以非侵入性方式实现对全身的实时可视化，因此可优于传统的免疫组织化学（IHC）方法^11,12,13放射性标记的抗体、多肽和小分子是用于监测癌症患者PD-L1表达的有前景示踪剂^{14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25}美国食品药品监督管理局（FDA）已批准三种PD-L1治疗性单克隆抗体：avelumab、atezolizumab和durvalumab²⁶基于这些抗体的免疫PET示踪剂已有充分报道^{27,28,29,30,31,32}早期临床试验由于药代动力学不理想，显示出有限的临床应用价值³⁰与抗体相比，多肽在健康器官中的血液和组织清除速度更快，且易于进行化学修饰³³已报道多种对PD-1/PD-L1具有高亲和力的多肽²；WL12 是一种已报道的肽，可特异性结合 PD-L1³⁴放射性标记示踪剂，[⁶⁴Cu]WL12, [⁶⁸Ga]WL12, 和 [¹⁸F]FPyWL12 据报道具有高 体内 特异性的肿瘤靶向能力，可实现对肿瘤中PD-L1表达的高质量成像^26,35,36,37此外，放射性标记的WL12首次人体评价研究表明，[⁶⁸Ga]WL12（由NOTA螯合）在临床肿瘤成像中具有安全且高效的潜力³⁸由于WL12具有高疏水性且在健康肝脏中摄取较高，其临床应用受到限制。其他放射性标记肽类，如TPP1和SETSKSF，可特异性结合PD-L1，也显示出良好的稳定性和特异性，可用于全身PD-L1表达的显像。^39,40然而，未经修饰的肽类容易被蛋白酶降解，并被肾脏快速代谢。由于左旋（L）肽稳定性较差，右旋（D）肽已被广泛用作有效的介导分子。^41,42,43D型多肽对蛋白水解降解具有高度抗性，且代谢半衰期显著延长。与相应的L型多肽相比，D型多肽大多表现出特异性结合能力^44,45,46.

本研究设计了一种基于⁶⁸Ga标记的靶向PD-L1的D型多肽——D-十二肽拮抗剂（DPA）在荷瘤小鼠模型中进行PET成像的新方法，用于检测PD-L1的表达⁴⁷。首先在磷酸盐缓冲液（PBS）和小鼠血清中研究了[⁶⁸Ga]DPA的稳定性，随后检测了[⁶⁸Ga]DPA在PD-L1高表达肿瘤中的结合亲和力。之后，在胶质母细胞瘤异种移植模型中进行PET成像，以验证[⁶⁸Ga]DPA是否为监测肿瘤中PD-L1表达的理想PET示踪剂。PET成像与DPA的结合不仅为克服PD-L1表达异质性相关挑战提供了新途径，也为基于D-多肽的放射性示踪剂的开发奠定了基础。

方案

动物实验程序已获得南京医科大学动物伦理委员会或国家量子科学技术研究院的批准。小鼠实验严格遵循实验室动物护理与使用委员会的机构指南进行。

1. 肽的合成

1. 溶胀100 mg 4-甲基二苯甲基胺（MBHA）树脂（载样量为0.37 mmol/g）于1 mL中 N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中轻柔处理30分钟₂ 冒泡。
2. 配制新鲜的储备缓冲液：将Fmoc保护的氨基酸（5.0当量）、HCTU（4.9当量）和DIPEA（10.0当量）溶于1 mL NMP中，加入树脂（100 mg）。使偶联反应进行1.5–2小时。
3. 配制脱保护缓冲液，其中含50%（体积比）吗啉的NMP溶液。取树脂（100 mg），每次用1 mL脱保护缓冲液洗涤2次，每次30分钟，以去除胺基上的Fmoc保护基团。随后用二氯甲烷（DCM；1 mL）洗涤树脂1分钟，弃去DCM，再用NMP（1 mL）洗涤树脂1分钟。接着弃去NMP，再用DCM（1 mL）洗涤树脂1分钟。
   注意：所有洗涤步骤均在温和的 N 条件下进行₂ 气泡。重复上述步骤直至最后一个氨基酸。
4. 为了将1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）添加至多肽中，需先用以下方法预活化DOTA： N-(3-二甲基氨基丙基)-N盐酸乙基碳二亚胺（EDC·HCl）和 N-hydroxysuccinimide (NHS)。将DOTA/EDC·HCl/NHS以1:1:1的摩尔比溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制储备缓冲液，于3 h内反应，最终DOTA浓度为1 M。随后，将该储备缓冲液（1 mL）加入树脂（100 mg）中，于温和氮气氛围下反应2 h。₂ 冒泡。
   注意：1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸（NOTA）也可用作螯合剂 ⁶⁸Ga 配合物的形成。相同的步骤也可用于 NOTA 偶联。
5. 用二氯甲烷（DCM）从上至下彻底冲洗树脂，同时施加真空以去除残留的反应溶液。用二氯甲烷（DCM，1.5 mL）冲洗树脂3次，然后用甲醇（MeOH，1.5 mL）冲洗以使树脂收缩。将树脂置于氮气氛围中过夜，或置于高真空下至少4小时，直至树脂完全干燥。
6. 将含有干燥 DPA 肽的树脂置于带有螺帽的 2 mL 聚丙烯容器中。加入适当的裂解混合液（95/2.5/2.5 TFA/TIS/H₂O）₂O 溶于体积中；1 mL/100 mg 树脂），用螺旋盖紧密封容器。在通风橱中，于 20–25 °C 在轨道摇床上轻轻振荡反应 2 小时。
   警告：由于三氟乙酸（TFA）具有强腐蚀性，必须在通风橱内穿戴防护服进行配制。
7. 在通风橱中用氮气吹干除去大部分三氟乙酸（TFA）。加入乙醚（约1.5 mL/100 mg树脂）使多肽沉淀。
8. 涡旋混合物以充分破碎肽段，并在室温下以10,000 × g，5 分钟）。小心将溶剂从容器中倒出。重复步骤 1.7–1.8。
9. 将残留物在敞口容器中风干10分钟。加入50%（体积/体积）水-乙腈溶液，涡旋震荡1–2秒以溶解产物（每100 mg树脂加入1 mL溶液）。
10. 通过过滤混合物去除树脂，再用 0.2 mL 的 50%（体积比）水-乙腈溶液洗涤树脂 2 次。合并滤液用于高效液相色谱（HPLC）纯化。采用以下 HPLC 条件：色谱柱：YMC-Triat-C18（4.6 mm 内径 [i.d.]，150 mm，5 mm）；溶剂梯度：溶剂 A—去离子水；溶剂 B—乙腈（含 0.1% TFA）；流速时间：20 分钟，乙腈浓度从 10% 升至 90%；流速：1 mL/min。
11. 将收集的HPLC洗脱液于-80 °C冷冻过夜，随后进行冻干（-50 °C和 <1 帕。用于放射性标记时，将固体肽溶解于醋酸钠缓冲液（100 mM，pH 5.0）中，配制成终浓度为 1 mg/mL 的储备缓冲液。

2. ⁶⁸Ga 放射性标记

注意：在南京第一医院（中国南京）使用⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生器自制生成⁶⁸Ga。

1. 用移液器将5 µL储备缓冲液加入带有螺帽的1.5 mL聚丙烯容器中。向容器中加入200 MBq [⁶⁸Ga]GaCl₃（400 µL）。
2. 涡旋混合5秒。使用pH试纸测定pH值，并用NaOH（0.1 M）调节pH至4–4.5。
   NOTE: 合适的pH值对于⁶⁸Ga与DOTA之间的络合反应至关重要。
3. 在室温下孵育溶液5–10分钟。将反应混合物进行放射性高效液相色谱（radio-HPLC）分析，以测定放射性标记产率，条件如下：色谱柱：YMC-Triat-C18（4.6 mm内径，150 mm，5 mm）；溶剂梯度：溶剂A为去离子水，溶剂B为乙腈（含0.1%三氟乙酸）；流速时间：20分钟，乙腈浓度从10%升至90%；流速：1 mL/min。
   ​NOTE: 放射性薄层色谱法（radio thin-layer chromatography, TLC）可作为替代方法用于检测放射性标记产率。推荐的TLC洗脱缓冲液为0.1 M Na₃C₆H₅O₇，pH 4。

3. 示踪剂稳定性 测试

1. 在 PBS 中进行示踪剂稳定性测试
   1. 将 [⁶⁸Ga]DPA（10 µL，3.7 MBq，溶于 NaOAc）加入 PBS（990 µL）中。在 37 °C 下轻微振荡孵育 1、2 和 4 小时。
   2. 在每个时间点取 200 µL 溶液，注入放射性高效液相色谱（radio-HPLC）进行分析。
2. 在小鼠血清中进行示踪剂稳定性测试
   1. 将 [⁶⁸Ga]DPA（10 µL，约 3.7 MBq，溶于 NaOAc）加入新鲜配制的小鼠血清（90 µL）中。在 37 °C 下轻微振荡孵育 1、2 和 4 小时。
   2. 在每个时间点取 20 µL 溶液，加入乙腈和水（100 µL，1:1，v/v）。
   3. 将混合物在 25 °C 下以 5,000 × g 离心 10 分钟，取上清液进行放射性高效液相色谱（radio-HPLC）分析。

4. 通过流式细胞术分析 PD-L1 表达

1. 通过在RPMI-1640培养基中添加10%（体积比）胎牛血清和1%（体积比）青霉素-链霉素配制培养基。将U87MG细胞重悬于培养基中，以每孔10⁵个细胞的密度接种至12孔板中。将细胞置于培养箱（5% CO₂，37 °C）中，静置培养至少24小时。
2. 用0.5 mL PBS洗涤细胞，加入250 μL胰蛋白酶-EDTA（0.25%）。将细胞重新放入培养箱（5% CO₂，37 °C）中孵育2分钟。
3. 加入1 mL培养基以终止细胞解离。通过反复吹打使细胞脱离培养皿，并将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。以100 × g离心5分钟。
4. 弃去上清液，将细胞重悬于1 mL PBS中。以100 × g离心5分钟。重复此步骤一次。
5. 将异硫氰酸荧光素（FITC）标记的PD-L1抗体用含3%牛血清白蛋白（BSA）的溶液稀释至20 nmol/L。加入细胞中，在4 °C孵育1小时。
6. 以100 × g离心5分钟，随后用预冷的PBS洗涤两次。使用流式细胞仪及分析软件检测PD-L1阳性细胞。

5. 免疫细胞化学

1. 将U87MG细胞以每孔2.5 × 10⁵个细胞的密度接种于玻璃底细胞培养皿（35 mm）中。当细胞融合度达到60%时，吸除培养基，加入1 mL PBS。轻轻摇晃数次后吸除，重复洗涤3次。
2. 向培养皿中加入500 µL 4%多聚甲醛，在室温下固定细胞30分钟。
3. 用PBS洗涤细胞3次。加入1 mL 3% BSA（w/v，溶于PBS）溶液，在室温下封闭固定后的细胞2小时。
4. 去除3% BSA溶液，直接加入一抗抗PD-L1抗体（单克隆抗体，1:100，用3% BSA稀释），在4 °C孵育过夜。
   注意：用BSA封闭细胞后，不要用PBS洗涤。
5. 用3% BSA缓冲液洗涤细胞3次。加入FITC标记的抗人IgG Fc二抗（1:500，用PBS稀释），室温孵育1小时。
6. 用PBS洗涤细胞3次。向细胞中加入0.5 mL DAPI（1 µg/mL），室温孵育1小时。再次用PBS洗涤染色后的细胞3次，然后使用共聚焦荧光显微镜观察。

6. 细胞摄取与抑制实验

1. 细胞摄取实验
   1. 将U87MG细胞接种于12孔板中培养至80%汇合度。移除培养基，并用0.5 mL PBS洗涤细胞。
   2. 将[⁶⁸Ga]DPA用新鲜培养基稀释至浓度为74 KBq/mL。向每孔中加入0.5 mL稀释后的[⁶⁸Ga]DPA缓冲液。
   3. 在37 °C条件下，用[⁶⁸Ga]DPA孵育细胞不同时间（10、30、40和120分钟）。用移液器吸除培养基，再用PBS（0.5 mL）洗涤细胞三次。
   4. 加入NaOH溶液（0.5 M，每孔300 µL）以裂解细胞。30秒后，收集黏稠的细胞裂解液至1.5 mL离心管中。
   5. 用0.4 mL PBS洗涤培养板两次，将洗涤液收集至上述1.5 mL离心管中。
   6. 启动自动γ计数器的内置计算机，将离心管放入内置样品架中。将所有样品加载到传送装置后，按下“START”按钮。结果由内置软件自动计算，读数记录每个离心管经衰变校正后的每分钟计数（CPM）。
2. 竞争性结合实验
   1. 将U87MG细胞接种于12孔板中培养至80%汇合度。移除培养基，并用0.5 mL PBS洗涤细胞。
   2. 将[⁶⁸Ga]DPA用新鲜培养基稀释至浓度为74 KBq/mL。将适量BMS202化合物溶于10% DMSO中，配制成10 mM浓度（400 µL）。
   3. 取4 µL 10 mM BMS202加入396 µL PBS中，获得100 µM浓度。重复此步骤，配制不同浓度的BMS202溶液（1 µM、10 nM、100 pM和1 pM）。
   4. 向每孔中加入0.5 mL稀释后的[⁶⁸Ga]DPA缓冲液（每孔0.37 MBq）。向每孔中加入5 µL不同浓度的BMS202溶液（每个浓度设三孔）。将细胞在37 °C细胞培养箱中孵育120分钟。
   5. 用移液器吸除培养基，用3 × 0.5 mL PBS洗涤细胞。
   6. 加入NaOH溶液（0.5 M，每孔300 µL）裂解细胞。30秒后，将黏稠的细胞裂解液收集至1.5 mL离心管中。用2 × 0.4 mL PBS洗涤培养板。
   7. 将洗涤液收集至上述1.5 mL离心管中，将离心管放入自动γ计数器的内置样品架中。
   8. 操作步骤同6.1.6。

7. PET 成像

注意：使用微型 PET 扫描仪进行小动物 PET 成像，该扫描仪提供 159 个横断轴向切片，切片间距为 0.796 mm（中心到中心），横向视场为 10 cm，轴向视场为 12.7 cm。以列表模式采集的所有数据均被组织成三维正弦图。随后通过傅里叶变换重建成二维正弦图（帧 × 分钟：4 × 1，8 × 2，8 × 5）。

1. 本研究使用雄性5-8周龄BALB/C裸鼠。按照步骤4.1-4.4收集U87MG细胞，并将细胞吸入0.5 mL注射器中。将细胞悬液皮下注射至小鼠体内（1 × 10⁶ 每瘤细胞数、每鼠两瘤）。注射后监测肿瘤生长，直至肿瘤体积达100–300 mm³³.
2. 使用1%-2%（v/v）异氟烷（1 mL/min）对小鼠进行麻醉。打开加热装置，将PET设备的动物床温度维持在37 °C。 
3. 将麻醉后的小鼠正确放置在PET仪器动物床的指定位置。应用 双眼涂抹眼膏 眼睛以防止干燥。
   警告：扫描期间需将小鼠保持俯卧位，以避免死亡。在整个成像过程中，持续给予异氟烷气流（1.0 mL/min） 通过 使用预装的导管插入鼻腔。
4. 调整动物床位置 通过 控制面板。通过预先安装的尾静脉导管静脉注射示踪剂（10-17 MBq/100-200 µL）。
5. 在主机计算机中使用引用的软件创建扫描工作流程（参见 材料表) 创建研究文件夹，并根据制造商的协议设置采集方案。对所有小鼠进行动态扫描（每只小鼠扫描60分钟）。 3D 列表模式.
6. 根据制造商说明书定义直方图协议和重建协议。采用截止频率为0.5 周期/像素的汉宁滤波器，通过滤波反投影法重建PET动态图像（25–30 分钟和55–60 分钟）。为所有小鼠生成最大强度投影（MIP）图像。
7. 将各实验步骤整合为工作流程并运行该流程。按照制造商提供的方案，使用软件分析获得的三维图像。
   注意：使用模拟软件选择感兴趣区域。放射性已校正至注射时刻，并以每克组织占总注射剂量的百分比（% ID/g）表示。

8. 离体 生物分布

1. 给予[⁶⁸通过尾静脉注射向荷U87MG肿瘤的BALB/C裸鼠注射Ga]DPA（1.85 MBq/100 µL）。使用1%-2%（v/v）异氟烷（1 mL/min）麻醉小鼠，随后处死 在注射后5、30、60和120分钟，通过颈椎脱位处死三只小鼠。
   注意： 演示该操作的人员应接受过颈椎脱位技术的培训，以确保能够迅速诱导意识丧失。这将保证 本实验中的安乐死操作均以人道方式进行。
2. 确认动物死亡后，打开小鼠胸壁，随后打开心脏。用1 mL注射器抽血，将血液从注射器中挤出，收集至放射免疫分析（RIA）管（直径13 mm）中，用于γ计数器检测。
3. 切除主要器官和肿瘤，并将其放入伽马计数器用的RIA管（直径13 mm）中。主要器官包括全血、心脏、胸腺、肝、脾、骨、胃、肾、肌肉、肠系膜淋巴结、小肠、胰腺、睾丸、脑和肺。称量所有器官的重量。
4. 使用自动γ计数器测量所采集器官中的放射性，并对测量值进行衰变校正。计算每克湿组织中放射性占注射剂量的百分比（% ID/g）。

9. 免疫组织化学

1. 收集胶质瘤组织，用 PBS 洗涤 3 次。将新鲜组织置于 4% 多聚甲醛中，于 4 °C 过夜固定。
2. 将固定后的组织包埋于石蜡中，切片至厚度 10 µm。将切片置于 60 °C 烘箱中孵育 2 h。依次在以下试剂中各孵育 10 min 进行脱蜡和水化：二甲苯（两次）、无水乙醇、95% 乙醇、90% 乙醇、80% 乙醇、75% 乙醇。
3. 将切片置于 0.01 M 柠檬酸钠溶液中，加热至 92–95 °C，维持该温度 40 min，以实现抗原修复。
4. 向切片加入 200 µL 3% H₂O₂ 溶液，室温孵育 10 min，以灭活内源性过氧化物酶。用 3% BSA 处理 2 h，室温下封闭非特异性结合位点。
5. 将切片与一抗抗 PD-L1 抗体（mAb，1:100，用 3% BSA 稀释）于 4 °C 过夜孵育。
   注意：BSA 封闭后，不要用 PBS 洗涤。
6. 用 PBS 洗涤切片 3 次。加入 HRP 标记的山羊抗兔二抗（1:500，用 PBS 稀释），室温孵育 1 h。
7. 用 PBS 洗涤 3 次。向切片加入 200 µL 3,3-二氨基联苯胺（DAB）工作液（溶液 A : 溶液 B : 溶液 C = 1:1:18），避光孵育 5 min。
8. 用 PBS 洗涤切片 3 次。加入 500 µL 苏木精溶液（100%），室温孵育 5 min。用蒸馏水洗涤 30 s。将切片放入分化液（75% 乙醇 : HCl = 99:1）中 30 s。再用蒸馏水洗涤 1 min。
9. 依次用 75% 乙醇、80% 乙醇、90% 乙醇、95% 乙醇、无水乙醇和二甲苯（两次）各孵育 10 min 进行脱水。用中性树胶封片，光学显微镜下观察。

结果

[⁶⁸Ga]DPA 放射性标记与稳定性
模型肽 DPA 是一种有效的 PD-L1 拮抗剂。DOTA-DPA 的纯度超过 >95%，产率为 68%。DOTA-DPA 的质谱实测值为 1,073.3 ([M+2H]²⁺)。⁶⁸镓被认为是一种适用于肽类 PET 成像的合适放射性核素，因此本研究选择使用该核素。为了用 ⁶⁸Ga（半衰期：68 分钟）对 DPA 进行放射性标记，合成了 DOTA-PEG3-DPA（图 1A）。DOTA 作为 ⁶⁸Ga 放射性标记的螯合剂。为使 DOTA 与 DPA 之间保持空间距离，采用 PEG3 作为连接臂。[⁶⁸Ga]-DOTA-PEG3-DPA（在下文中简称为 [⁶⁸Ga]DPA）表现出较高的放射化学产率（>95%）和放射化学纯度（>95%）（表 1

讨论

本方法中描述的关键步骤包括高效地将⁶⁸Ga标记到DPA，以及选择适合的PET成像时间窗口，该时间窗口必须与DPA在肿瘤中的药效动力学模式完全匹配。

与免疫组化（IHC）相比，PET成像能够以非侵入性方式实时检测全身范围内的PD-L1表达，从而实现对异质性肿瘤中每个阳性区域的可视化。^6,7. 选择多肽作为配体，以避免抗体和小分子的缺点。抗体分子量较大，通常具有较长的循环半衰期，导致对健康器官的毒性较高。小分子清除速度通常过快，难以实现所需的肿瘤滞留。多肽的分子量介于抗体与小分子之间，使基于多肽的放射性示踪剂能够同时实现长期的肿瘤滞留和良好的组织穿透性，且毒性最小^{13,49,50,51...}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）	默克	60239-18-1	68Ga  螯合
3,3-二氨基联苯胺（DAB）试剂盒	Sigma-Aldrich	D7304-1SET	免疫组织化学
抗PD-L1单克隆抗体	武汉普罗亭科技	17952-1-ap	免疫组织化学：一抗
BMS202	Selleck	1675203-84-5	竞争性结合实验：抑制剂
BSA	默克	V900933	免疫荧光：封闭
DAPI	默克	D9542	免疫荧光：细胞核染色
二氯甲烷（DCM）	默克	34856	溶剂
DIPEA	默克	3439	肽偶联
EDC·HCl	默克	E6383	DOTA的活化
FBS	Gibco	10099	细胞培养：补充剂
FITC标记的抗人IgG Fc抗体	Biolegend	409310	免疫荧光：二抗
FITC标记的抗PD-L1抗体	Biolegend	393606	流式细胞术：直接抗体法
HCTU	能源化学	E070004-25g	肽偶联
HRP标记的山羊抗兔抗体	Servicebio	GB23303	免疫组织化学：二抗
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）	默克	130672	DOTA的活化
MeCN	默克	PHR1551	溶剂
吗啉	默克	8.06127	Fmoc-去保护
NMP	默克	8.06072	溶剂
多聚甲醛	默克	30525-89-4	组织固定
PBS	Gibco	10010023	细胞培养：缓冲液
青霉素-链霉素	Gibco	10378016	细胞培养：补充剂
RIA管	PolyLab	P10301A	作为组织样本容器
RPMI-1640 培养基	Gibco	11875093	细胞培养：基础培养基
乙酸钠	默克	1.06264	缓冲液用盐
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200056	细胞培养：解离试剂
U87MG细胞系	普罗赛生命科学 & 技术有限公司	CL-0238	细胞模型
<强>仪器设备
68Ge/68镓发生器	慕尼黑同位素技术公司，ITM	不适用	[的生成68Ga
自动伽马计数器	Perkin Elmer	Wizard2	放射性检测
共聚焦荧光显微镜	Keyence		免疫荧光结果的观察
流式细胞仪	Becton Dickinson, BD	LSRII	监测 PD-L1 阳性细胞
高效液相色谱法（HPLC）	SHIMAZU	LC-20AT	DPA 肽的纯化
PET 扫描仪	西门子医疗解决方案	Inveon 多模态系统	PET成像
光学显微镜	尼康	Eclipse E100	免疫组织化学结果的观察
固相多肽合成仪	Promega Vac-Man 实验室真空抽滤装置	LOT#11101	DPA-DOTA 肽的合成
<强>软件
ASIPro	西门子医疗解决方案	不适用	PET-CT结果分析
FlowJo	Becton Dickinson，BD	FlowJo 7.6.1	流式细胞仪结果分析
Inveon Acquisition Workplace (IAW)	西门子医疗解决方案	不适用	PET 机器的管理
Prism	Graphpad	Prism 8.0	数据分析