用于成像程序性死亡配体1表达的68镓标记D-肽PET探针的开发

摘要

本研究基于 [⁶⁸Ga] D-十二肽拮抗剂的正电子发射断层成像，建立了一种无创且实时评估程序性死亡配体1在全身分布的方法。该技术相较于传统的免疫组织化学具有优势，可提高筛选适合接受免疫检查点阻断治疗患者的效率。

摘要

基于程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）的免疫检查点阻断疗法近年来彻底改变了癌症治疗格局。然而，由于肿瘤细胞中PD-L1的表达具有异质性，仅有部分患者对PD-1/PD-L1抑制剂产生应答。这种异质性给常用的免疫组织化学（IHC）方法精确检测肿瘤细胞带来了挑战。因此，亟需更优的方法对可能从免疫检查点阻断疗法中获益的患者进行分层，以提高治疗效果。正电子发射断层扫描（PET）能够以无创方式实时可视化全身PD-L1的表达情况。因此，有必要开发放射性标记的示踪剂，通过PET成像检测肿瘤中PD-L1的分布。

与左旋（L-）对应物相比，右旋（D-）肽具有抗蛋白水解以及代谢半衰期显著延长等特性。本研究设计了一种基于PET成像检测PD-L1表达的新方法 ⁶⁸Ga标记的靶向PD-L1的D-肽，一种D-十二肽拮抗剂（DPA），在荷瘤小鼠中的结果表明，[⁶⁸Ga]DPA 可特异性结合 PD-L1 高表达的肿瘤 体内，显示出良好的稳定性以及优异的成像能力，表明[⁶⁸Ga]DPA-PET 是一种用于评估肿瘤 PD-L1 状态的有前景的方法。

引言

免疫检查点蛋白的发现是肿瘤治疗领域的重大突破，推动了免疫检查点阻断疗法的显著进展¹。程序性死亡受体-1（PD-1）和程序性死亡配体-1（PD-L1）是具有潜力的药物靶点，已有多种针对这些靶点的抗体获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。PD-1由肿瘤浸润性免疫细胞表达，例如CD4⁺、CD8⁺ T细胞和调节性T细胞。PD-L1是PD-1的配体之一，在多种肿瘤细胞中呈过表达状态^2,3。PD-1与PD-L1之间的相互作用会抑制PD-1的活性，从而削弱抗肿瘤免疫应答⁴。这些研究结果提示，抑制PD-L1可能增强免疫细胞的杀伤效应，进而清除肿瘤细胞⁵。目前，显色免疫组织化学法（IHC）是最常用于识别最有可能对免疫检查点治疗产生应答的患者的方法^6,7。然而，由于肿瘤细胞中PD-L1的表达具有异质性，活检样本的IHC结果无法准确反映患者体内PD-L1的整体表达情况⁸。既往研究表明，仅有20%–40%的患者能从免疫检查点阻断治疗中获得长期益处¹

方案

动物实验程序已获得南京医科大学动物伦理委员会或国家量子科学技术研究院的批准。小鼠实验严格遵循实验室动物护理与使用委员会的机构指南进行。

1. 肽的合成

1. 溶胀100 mg 4-甲基二苯甲基胺（MBHA）树脂（载样量为0.37 mmol/g）于1 mL中 N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中轻柔处理30分钟₂ 冒泡。
2. 配制新鲜的储备缓冲液：将Fmoc保护的氨基酸（5.0当量）、HCTU（4.9当量）和DIPEA（10.0当量）溶于1 mL NMP中，加入树脂（100 mg）。使偶联反应进行1.5–2小时。
3. 配制脱保护缓冲液，其中含50%（体积比）吗啉的NMP溶液。取树脂（100 mg），每次用1 mL脱保护缓冲液洗涤2次，每次30分钟，以去除胺基上的Fmoc保护基团。随后用二氯甲烷（DCM；1 mL）洗涤树脂1分钟，弃去DCM，再用NMP（1 mL）洗涤树脂1分钟。接着弃去NMP，再用DCM（1 mL）洗涤树脂1分钟。
   注意：所有洗涤步骤均在温和的 N 条件下进行₂ 气泡。重复上述步骤直至最后一个氨基酸。
4. 为了将1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）添加至多肽中，需先用以下方法预活化DOTA： N-(3-二甲基氨基丙基)-N....

结果

[⁶⁸Ga]DPA 放射性标记与稳定性
模型肽DPA是一种有效的PD-L1拮抗剂。已获得DOTA-DPA。 >95% 纯度和 68% 产率。DOTA-DPA 的质谱实测值为 1,073.3 ([M+2H]²⁺). ⁶⁸镓被认为是一种适用于标记肽类用于PET成像的放射性核素，因此本研究选择了镓。将DPA进行放射性标记以 ⁶⁸Ga（半衰期：68 分钟），合成了 DOTA-PEG3-DPA图1A）。DOTA 被用作螯合剂 ⁶⁸Ga放射性标记。为了间隔DOTA和DPA，采用PEG3作为连接臂。[⁶⁸Ga]-DOTA-PEG3-DPA（以下简称[⁶⁸Ga]DPA 在下文中）显示出高放射化学产率（>95%）和放射化学纯度（>95%) (表1). 采用高效液相色谱法（HP.......

讨论

本方法中描述的关键步骤包括高效地将⁶⁸Ga标记到DPA，以及选择适合的PET成像时间窗口，该时间窗口必须与DPA在肿瘤中的药效动力学模式完全匹配。

与免疫组化（IHC）相比，PET成像能够以非侵入性方式实时检测全身范围内的PD-L1表达，从而实现对异质性肿瘤中每个阳性区域的可视化。^6,7. 选择多肽作为配体，以避免抗体和小分子的缺点。抗体分子量较大，通常具有较长的循环半衰期，导致对健康器官的毒性较高。小分子清除速度通常过快，难以实现所需的肿瘤滞留。多肽的分子量介于抗体与小分子之间，使基于多肽的放射性示踪剂能够同时实现长期的肿瘤滞留和良好的组织穿透性，且毒性最小^{13,49,50,51.......}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）	默克	60239-18-1	68Ga  螯合
3,3-二氨基联苯胺（DAB）试剂盒	Sigma-Aldrich	D7304-1SET	免疫组织化学
抗PD-L1单克隆抗体	武汉普罗亭科技	17952-1-ap	免疫组织化学：一抗
BMS202	Selleck	1675203-84-5	竞争性结合实验：抑制剂
BSA	默克	V900933	免疫荧光：封闭
DAPI	默克	D9542	免疫荧光：细胞核染色
二氯甲烷（DCM）	默克	34856	溶剂
DIPEA	默克	3439	肽偶联
EDC·HCl	默克	E6383	DOTA的活化
FBS	Gibco	10099	细胞培养：补充剂
FITC标记的抗人IgG Fc抗体	Biolegend	409310	免疫荧光：二抗
FITC标记的抗PD-L1抗体	Biolegend	393606	流式细胞术：直接抗体法
HCTU	能源化学	E070004-25g	肽偶联
HRP标记的山羊抗兔抗体	Servicebio	GB23303	免疫组织化学：二抗
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）	默克	130672	DOTA的活化
MeCN	默克	PHR1551	溶剂
吗啉	默克	8.06127	Fmoc-去保护
NMP	默克	8.06072	溶剂
多聚甲醛	默克	30525-89-4	组织固定
PBS	Gibco	10010023	细胞培养：缓冲液
青霉素-链霉素	Gibco	10378016	细胞培养：补充剂
RIA管	PolyLab	P10301A	作为组织样本容器
RPMI-1640 培养基	Gibco	11875093	细胞培养：基础培养基
乙酸钠	默克	1.06264	缓冲液用盐
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200056	细胞培养：解离试剂
U87MG细胞系	普罗赛生命科学 & 技术有限公司	CL-0238	细胞模型
<强>仪器设备
68Ge/68镓发生器	慕尼黑同位素技术公司，ITM	不适用	[的生成68Ga
自动伽马计数器	Perkin Elmer	Wizard2	放射性检测
共聚焦荧光显微镜	Keyence		免疫荧光结果的观察
流式细胞仪	Becton Dickinson, BD	LSRII	监测 PD-L1 阳性细胞
高效液相色谱法（HPLC）	SHIMAZU	LC-20AT	DPA 肽的纯化
PET 扫描仪	西门子医疗解决方案	Inveon 多模态系统	PET成像
光学显微镜	尼康	Eclipse E100	免疫组织化学结果的观察
固相多肽合成仪	Promega Vac-Man 实验室真空抽滤装置	LOT#11101	DPA-DOTA 肽的合成
<强>软件
ASIPro	西门子医疗解决方案	不适用	PET-CT结果分析
FlowJo	Becton Dickinson，BD	FlowJo 7.6.1	流式细胞仪结果分析
Inveon Acquisition Workplace (IAW)	西门子医疗解决方案	不适用	PET 机器的管理
Prism	Graphpad	Prism 8.0	数据分析