方法文章

废水和空气样本中SARS-CoV-2 RNA的定量与全基因组表征

DOI：

10.3791/65053

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2023年6月30日

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1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

本文内容

摘要

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本方案旨在定量废水中和空气样本中的SARS-CoV-2 RNA，用于基于废水的流行病学研究，并评估室内和室外气溶胶中SARS-CoV-2的暴露风险。本方案还描述了一种用于SARS-CoV-2全基因组表征的分段扩增长模板测序方法。

摘要

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基于废水的流行病学已成为许多国家监测SARS-CoV-2及其他传染病的一种前景广阔且高效的监测系统。该过程通常包括废水浓缩、核酸提取、特定基因组片段的扩增，以及对扩增产物的检测与定量。该方法同样可用于检测和定量空气样本中的病原体，例如SARS-CoV-2。最初，人们认为SARS-CoV-2主要通过感染者在说话、打喷嚏、咳嗽、唱歌或呼吸时产生的飞沫，经由密切人际接触传播。然而，越来越多的研究报告了在医疗机构空气中存在SARS-CoV-2的RNA，证实了气溶胶传播是该病毒的一种可行传播途径。本研究整合了一系列成熟的实验方案，以促进从废水和空气样本中对病毒进行环境检测、定量及测序分析。

引言

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2019年12月，一种由先前未知的冠状病毒SARS-CoV-2引起的新型疾病COVID-19出现1。由此引发的全球大流行对世界各地的临床和公共卫生实验室构成了重大挑战，因为需要对大量个体进行检测，以准确评估病毒在社区中的传播情况和流行程度。然而，在许多地区，及时且全面覆盖空间范围的必要检测水平在经济上难以实现2,3。目前基于个体临床诊断的监测系统在很大程度上依赖于症状严重程度和个体报告情况，同时也受到这些症状与人群中正在流行的其他疾病症状重叠程度的影响4,5,6,7,8,9,10。因此，大量无症状病例导致了对疾病负担的严重低估7,11。

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方案

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本文所述所有方法此前已在其他地方发表，并对原始方法进行了少量修改。

1. 废水采集与样品预处理

注意：由于环境样本中SARS-CoV-2 RNA的浓度较低，因此实施浓缩步骤对于成功检测至关重要33,34,35。此处描述的是首个报道的废水中SARS-CoV-2检测方法36。

  1. 废水样品的采集与浓缩
    1. 采集1 L的24小时混合废水样品。将样品储存在4 °C条件下，并在24小时内开始进行实验操作。
    2. 通过轻轻摇动瓶子使样品均质化，取70 mL转移至一个100 mL离心管中，或分装至两个50 mL离心管中。
    3. 向每份70 mL样品中加入20 µL的脑心肌炎病毒（mengovirus，3.2 x 103 拷贝/µL），作为浓缩过程的内参对照；或者，向每个50 mL离心管中加入10 µL的脑心肌炎病毒（3.2 x 103 拷贝/µL）。
    4. 将样品混匀后，在4 °C条件下以700 x g离心10分钟，以去除大颗粒物质和生物体....

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结果

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上述结果总结于 表3 展示使用本文所述方法检测和定量废水中及空气样本中SARS-CoV-2 RNA的示例。废水样本采集自西班牙和斯洛文尼亚的污水处理厂，若三个重复样本中至少有两个的Ct值低于40，则视为阳性；若Ct值变异小于5%，则认为定量结果有效。在西班牙和葡萄牙，采集了室内和室外空气样本，并采用相同的判定标准。空气样本使用双重复而非三重复，因为本研究的目标是检测SARS-CoV-2 RNA的存在，而非对其进行精确定量。此外，只有当所有使用的对照（如本方案所述）结果符合预期，且mengovirus RNA对照未出现显著偏差时，RT-qPCR运行才被视为有效。在这些样本中，mengovirus的回收效率介于13.7%至19.7%之间。通过将提取的RNA稀释10倍和100倍后比较RT-qPCR结果，并结合使用商业抑制检测试剂盒，评估了PCR抑制效应。每种抑制对照试剂盒的使用应严格按照制造商提供的说明进行。

废水样品在三个重复样本之间的标准偏差为1.91%至13.98%，基因拷贝数范围为3.05 × 103 至 2.83 × 10.......

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讨论

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利用（逆转录-）定量聚合酶链式反应（(RT-)qPCR）方法进行微生物和病毒的检测与定量因其极高的灵敏度而得到广泛认可。然而，在分析环境样品时，这些技术面临诸多挑战。废水样品中含有大量抑制性物质，可能扭曲检测结果并产生误导性数据。为克服这些局限性并提高检测精度，研究人员设计并实施了一套复杂的实验流程。该流程通过整合科学文献中的多种方案，并针对qPCR方法固有的限制，特别在每个操作步骤中引入了一系列严格的质控措施。通过整合这些严谨的质量控制手段，本方案为基于qPCR的检测与定量技术在复杂环境样品中的应用提供了可靠的解决方案51,52。核酸提取阴性对照（NCI）和无模板对照（NTC）是评估RNA提取及逆转录-定量PCR（RT-qPCR）反应过程中是否存在污染的关键工具。此外，引入孟加拉病毒（mengovirus）控制RNA可有效评估样品间的变异程度，以及浓缩步骤的效率和复杂环境样品中抑制性物质的影响。在每一次RT-qPCR反应中，必须设置阳性对照，以确认扩增过程的有效性。严格监控实验流程的每一个步骤至关重要，包括样品的储存与.......

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披露

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作者没有竞争性经济利益或其他利益冲突。

致谢

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本工作获得了卡斯蒂利亚-莱昂地区政府和欧洲区域发展基金（FEDER）项目（项目编号：CLU 2017-09、UIC315 和 VA266P20）的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
接头+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19Oxford NanoporeEXP-AMII001测序
AllPrep PowerViral DNA/RNA 试剂盒Qiagen28000-50RNA提取试剂盒
AMPure XP贝克曼库尔特A63880PCR 纯化，NGS 纯化，PCR 产物纯化
ARTIC SARS-CoV-2 扩增子面板IDT10011442SARS-CoV-2 基因组扩增
Blunt/TA连接酶预混液NEBM0367S文库构建
CENTRICON PLUS­70 10KDAFisher Scientific10296062浓缩过滤器
CORIOLIS COMPACT 空气采样器Bertin Technologies083-DU001空气采样器
杜兰 实验室瓶默克Z305200-10EA采样瓶
流动池（R9.4.1）Oxford NanoporeFLO-MIN106D测序
常规实验室耗材（离心管、qPCR 板等）
连接测序试剂盒Oxford NanoporeSQK-LSK109测序
LunaScript RT SuperMix试剂盒NEBE3010 cDNA合成
Mengovirus 提取对照试剂盒生物分子érieuxKMG浓度控制
Nalgene 通用长期储存冻存管赛默飞世尔科技5011-0012样品储存
原生条形码扩展 1-12（无需 PCR）Oxford NanoporeEXP-NBD104条形码技术
NEBNext Ultra II 末端修复/dA加尾模块NEBE7595DNA修复
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 引物混合物NEBE7658SARS-CoV-2 基因组扩增
NEBNext 快速连接反应缓冲液NEBB6058S测序 
磷酸盐缓冲液默克P4474收集缓冲液
磷酸盐缓冲液（PBS，1×），经无菌过滤赛默飞世尔科技J61196.AP空气样品的洗脱
Q5 热启动高保真2X预混液NEBM0494S热启动DNA聚合酶
Qubit RNA HS 检测试剂盒赛默飞世尔科技Q32852RNA定量
SARS-CoV-2 RUO qPCR 引物 & 探针试剂盒IDT10006713引物-探针混合液与qPCR阳性对照
TaqPath 1-Step RT-qPCR 预混液赛默飞世尔科技A15299RT-qPCR试剂盒

参考文献

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  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(cover-2019)-and-the-virus-that-causes-it (2020).
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http....

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标签

RNA RT qPCR

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