废水和空气样本中SARS-CoV-2 RNA的定量与全基因组表征

摘要

本方案旨在定量废水中和空气样本中的SARS-CoV-2 RNA，用于基于废水的流行病学研究，并评估室内和室外气溶胶中SARS-CoV-2的暴露风险。本方案还描述了一种用于SARS-CoV-2全基因组表征的分段扩增长模板测序方法。

摘要

基于废水的流行病学已成为许多国家监测SARS-CoV-2及其他传染病的一种前景广阔且高效的监测系统。该过程通常包括废水浓缩、核酸提取、特定基因组片段的扩增，以及对扩增产物的检测与定量。该方法同样可用于检测和定量空气样本中的病原体，例如SARS-CoV-2。最初，人们认为SARS-CoV-2主要通过感染者在说话、打喷嚏、咳嗽、唱歌或呼吸时产生的飞沫，经由密切人际接触传播。然而，越来越多的研究报告了在医疗机构空气中存在SARS-CoV-2的RNA，证实了气溶胶传播是该病毒的一种可行传播途径。本研究整合了一系列成熟的实验方案，以促进从废水和空气样本中对病毒进行环境检测、定量及测序分析。

引言

2019年12月，一种由先前未知的冠状病毒SARS-CoV-2引起的新型疾病COVID-19出现¹。由此引发的全球大流行对世界各地的临床和公共卫生实验室构成了重大挑战，因为需要对大量个体进行检测，以准确评估病毒在社区中的传播情况和流行程度。然而，在许多地区，及时且全面覆盖空间范围的必要检测水平在经济上难以实现^2,3。目前基于个体临床诊断的监测系统在很大程度上依赖于症状严重程度和个体报告情况，同时也受到这些症状与人群中正在流行的其他疾病症状重叠程度的影响^{4,5,6,7,8,9,10}。因此，大量无症状病例导致了对疾病负担的严重低估^7,11。

由于这些挑战，基于废水的流行病学（WBE）被提出作为新冠肺炎监测的一种补充性监测策略。WBE 最早于2001年被描述¹²，最初用于追踪可卡因及其他非法药物¹³。该方法基于一个假设：对于任何在废水中稳定且由人类排泄的物质，均可计算其初始浓度^8,12。WBE 已在多个国家成功实施，作为SARS-CoV-2监测的一种补充且高效的监测系统^3,8,14,15,16。在水环境中检测人类病毒的大多数方法均遵循以下步骤：浓缩、核酸提取、选定的基因组片段（或多个片段）扩增，以及扩增后基因组片段的检测/定量³。

检测和定量SARS-CoV-2的另一个重要环境是空气样本。最初认为SARS-CoV-2主要通过感染者在说话、打喷嚏、咳嗽、唱歌或呼吸时产生的气溶胶中的呼吸道飞沫进行近距离人际传播¹⁷。然而，多项研究开始报告在空气样本中存在SARS-CoV-2 RNA，尤其是在医疗机构和其他封闭空间内^18,19,20,21。当病毒浓度足够高时，在医院和其他封闭室内环境中采集的空气样本中已发现SARS-CoV-2具有活性的证据^22,23,24。室外研究通常未发现SARS-CoV-2存在的证据，仅在人群密集的户外场所例外^{21,25,26,27,28,29}。截至目前，SARS-CoV-2的空气传播已被确认为一种传播途径^30,31。最近的一项综述研究指出了室外与室内的差异：在非人群密集区域，室外空气传播风险极低；而在通风不良的室内环境中，若存在较强的病毒源（即较多感染者），则可能存在较大传播风险。最近一项全面的综述研究强调了室外与室内环境中空气传播风险的显著差异，特别是在通风不良的人群密集区域。该研究表明，在室外环境中，由于有更大的空气体积可供病毒颗粒稀释和扩散，空气传播的风险极低³²。这些发现对与COVID-19相关的公共卫生政策和指南具有重要意义。通过认识室内与室外环境之间传播风险的显著差异，决策者可以制定更有效的策略，以减缓病毒传播并保护公众健康。

针对不同环境样本中SARS-CoV-2的检测、定量和测序，存在多种方法和实验方案。本文旨在介绍一系列成熟可靠的实验流程组合，使具备不同能力水平的实验室均能对废水和空气样本中的病毒进行环境检测、定量分析和测序。

方案

本文所述所有方法此前已在其他地方发表，并对原始方法进行了少量修改。

1. 废水采集与样品预处理

注意：由于环境样本中SARS-CoV-2 RNA的浓度较低，因此实施浓缩步骤对于成功检测至关重要^33,34,35。此处描述的是首个报道的废水中SARS-CoV-2检测方法³⁶。

1. 废水样品的采集与浓缩
   1. 采集1 L的24小时混合废水样品。将样品储存在4 °C条件下，并在24小时内开始进行实验操作。
   2. 通过轻轻摇动瓶子使样品均质化，取70 mL转移至一个100 mL离心管中，或分装至两个50 mL离心管中。
   3. 向每份70 mL样品中加入20 µL的脑心肌炎病毒（mengovirus，3.2 x 10³ 拷贝/µL），作为浓缩过程的内参对照；或者，向每个50 mL离心管中加入10 µL的脑心肌炎病毒（3.2 x 10³ 拷贝/µL）。
   4. 将样品混匀后，在4 °C条件下以700 x g离心10分钟，以去除大颗粒物质和生物体（沉淀）。
   5. 取上清液，使用截留分子量为10 KDa的超滤离心装置，在4 °C条件下以4,000 x g离心40分钟进行浓缩。通过将超滤装置倒置，并在700 x g条件下离心40分钟，收集浓缩液。
   6. 测量所得浓缩液的体积。该体积会因样品中堵塞滤膜的固体物含量不同而变化。本研究中获得的浓缩液体积介于200–1,200 µL之间。
   7. 使用商业试剂盒或实验室自建方法对所得浓缩液进行RNA提取。本研究中所用样品采用特定的商业病毒RNA提取试剂盒，洗脱体积为50 µL。
   8. 使用荧光定量RNA检测试剂盒测定提取RNA的浓度。将提取的RNA分装成若干份，于-80 °C保存，待后续分析使用。
      注：每次RNA提取操作均应设置一个提取阴性对照（NCI），仅包含缓冲液，用于检测提取过程中可能发生的污染。
2. 使用Coriolis紧凑型空气采样器采集空气样品
   1. 根据研究目标确定采样频率和采样地点，制定采样策略。
   2. 设置空气采样器的流速（本实验中为50 L/min，持续30分钟）。请注意，流速超过200 L/min可能导致病毒RNA降解，因此建议使用低于200 L/min的流速。
   3. 启动采样前，在空气采样器中放入无菌锥形收集管。采样结束后，向锥形管中加入5–15 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻涡旋或手动摇晃15秒。样品可在4 °C下保存最多24小时，或分装至冻存管中于-80 °C保存。
   4. 可选择性地进行浓缩步骤。每次实验后，使用次氯酸钠溶液对锥形管进行清洗和去污染处理。
   5. 使用商业试剂盒或实验室自建方法提取RNA。本研究中所用样品采用特定的商业病毒RNA提取试剂盒，洗脱体积为50 µL。
   6. 使用荧光定量RNA检测试剂盒测定提取RNA的浓度。将提取的RNA分装成若干份，于-80 °C保存，待后续分析使用。
      ​注：每次RNA提取操作均应设置一个提取阴性对照（NCI），仅包含缓冲液，用于检测提取过程中可能发生的污染。

2. 通过实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）定量检测SARS-CoV-2 RNA

注意：以下方案依据美国疾病控制与预防中心（CDC）2019年新型冠状病毒（2019-nCoV）RT-PCR诊断试剂盒³⁷制定。将引物/探针混合液分装成多份，以避免反复冻融。

1. 在试剂准备室的洁净罩内，按照 表1 为每个靶标（脑心肌炎病毒；SARS-CoV-2 [N1 和 N2 基因]）配制反应主混合液。通过轻轻翻转5次混合引物/探针混合液与酶。或者，短暂脉冲涡旋引物/探针混合液和酶5次。
   注意：配制和使用过程中应始终保持所有试剂处于低温状态。为尽量减少冻融循环次数，强烈建议将试剂分装后冷冻保存。
2. 离心（1,000 × g，15–30 秒）收集管壁液体至管底，并将离心管置于预冷的试管架或冰上。
3. 为每个靶标标记1.5 mL 微量离心管。向每管中加入所需量的各试剂（每反应体积 × 反应数，包括所需的对照）。通过移液吹打混匀，并短暂离心5秒以收集管底液体。
4. 将微量离心管置于预冷试管架中，并在冷却架上将15 µL 主混合液分装至PCR条管或96孔板中。盖好板盖，转移至核酸操作区（始终保持在冷却架中）。
5. 解冻一份提取的RNA样本，轻柔涡旋5秒。向每个含有预先配制主混合液的反应孔或管中加入5 µL RNA（另设无模板对照 [NTC]、提取阴性对照 [NCI] 和阳性对照 [PC] 各5 µL）。根据需要频繁更换手套，避免交叉污染。
6. 盖好整块反应板或各管，轻柔涡旋混匀。离心（1,000 × g，15–30 秒）反应板或PCR管。
7. 启动25 µL 逆转录定量PCR（RT-qPCR），循环条件如下：45 °C 反转录10分钟；95 °C 聚合酶激活10分钟；随后进行45个循环，每个循环包括95 °C 变性15秒，60 °C 退火/延伸45秒。
8. 按照Conte等³⁸报道的方法计算脑心肌炎病毒对照的回收效率：
   × 100

3. 污水中的测序变异体及数据分析

注意：所述方案是由 Quick 等人修改建立的方案^39,40。该方案采用两组引物，通过 PCR 镶嵌法对 SARS-CoV-2 基因组进行扩增，分别为 ARTIC 引物和 VarSkip 引物。联合使用这两组引物可确保最佳的基因组覆盖度，并最大限度降低因新发突变导致某类引物失效的可能性。总体而言，该方案分为三个部分：逆转录（RT）与扩增子生成、测序文库制备，以及测序与数据分析。

1. 逆转录与扩增子生成
   1. 确保输入样本具有已知的qPCR循环阈值（Ct）值，以便在PCR级水中进行正确稀释。Ct值在qPCR定量过程中获得。稀释方案如下：若Ct值为12–15，将样本稀释1:100；若Ct值为15–18，稀释1:10；若Ct值为18–35，则不稀释样本。Ct值高于35的样本极有可能无法成功扩增。
   2. 在PCR板中，将每种样本16 µL移液至板上的对应位置。加入4 µL逆转录（RT）主混合液（5x）。盖好板后，按以下条件启动PCR反应：25 °C孵育2 min，55 °C孵育20 min，95 °C孵育1 min。
   3. 分别制备每对引物组（ARTIC pool A和pool B，以及VarSkip pool A和pool B）的10 µM稀释液。按照表2所示，为每组引物（ARTIC set A和B，以及VarSkip set A和B）配制主混合液。共将得到四种主混合液。
   4. 在新的PCR板中，向每个对应孔中加入20 µL主混合液。向每种混合液中加入5 µL RT反应产物。
      注：每个样本将包含四个反应体系——ARTIC pool A和B，以及VarSkip pool A和B。
   5. 盖好PCR板，按以下程序启动PCR反应：98 °C预变性30 s；进行35个循环（98 °C变性15 s，65 °C退火/延伸4 min）。短暂离心（1,000 x g，15–30 s）。分别合并ARTIC反应产物池和VarSkip反应产物池。每个样本将获得两个50 µL的扩增子反应产物。
   6. 向每个孔中加入50 µL基于磁珠的PCR纯化试剂，并通过移液充分混匀。室温孵育5 min。
      注：每次使用前需剧烈震荡PCR纯化试剂，以充分重悬磁珠。
   7. 将PCR板置于磁力分离架上，静置至磁珠形成沉淀且上清液澄清（约5 min）。小心移除并弃去上清液。保持PCR板始终置于磁力架上。
   8. 保持PCR板在磁力架上，向每个样本中加入200 µL 80%乙醇，避免触碰磁珠沉淀。随后移除乙醇。
   9. 重复上一步操作。将PCR板在磁力架上敞口放置30 s，使残留乙醇充分挥发。
   10. 将PCR板从磁力架上取下，向每个样本中加入15 µL PCR级水。通过移液重悬磁珠沉淀。室温孵育2 min。
   11. 将PCR板重新放回磁力架上，静置使磁珠沉淀（2 min）。小心吸取每个样本15 µL上清液转移至新的PCR板中。
   12. 使用荧光定量RNA检测试剂盒测定各样本浓度。取约50 ng（12.5 µL）样本进入下一步。如需稀释，使用PCR级水进行调整。
2. 文库构建
   1. 向每个样本中加入1.75 µL Illumina DNA文库构建试剂盒中的反应缓冲液和0.75 µL酶混合液。盖好PCR板，短暂涡旋混匀，离心（1,000 x g，15–30 s）。在21 °C孵育5 min，随后65 °C孵育5 min。
   2. 在新的PCR板中，为每个样本加入3 µL PCR级水。再加入0.75 µL已处理样本、1.25 µL用于测序文库构建的条形码（barcode）以及5 µL T4 DNA连接酶主混合液。通过移液充分混匀，短暂离心（1,000 x g，15–30 s），21 °C孵育20 min，65 °C孵育10 min。
      注：若样本数少于25个，本步骤中所有体积需加倍。
   3. 将所有样本等量（各10 µL）合并至同一低吸附管中。取480 µL进入下一步。
   4. 向混合样本中加入192 µL基于磁珠的PCR纯化试剂，通过移液充分混匀。室温孵育10 min。
   5. 将离心管置于磁力架上，静置至上清液澄清且磁珠形成沉淀。移除上清液后，将离心管从磁力架上取下。
   6. 加入700 µL短片段缓冲液（SFB），通过移液混匀。重新放回磁力架，静置至磁珠沉淀且液体澄清（约5 min）。吸出并弃去上清液。
   7. 重复上一步操作。将离心管保留在磁力架上，加入100 µL 80%乙醇，避免触碰磁珠。吸出乙醇后，让磁珠干燥30 s。
      注：切勿使磁珠过度干燥。
   8. 将离心管从磁力架上取下，加入35 µL PCR级水。通过移液混匀，室温孵育2 min。将离心管放回磁力架，静置使磁珠沉淀且液体澄清。吸取35 µL上清液转移至新管中。
   9. 测定混合文库的RNA浓度。移取足够体积以获得30–50 ng RNA，并用PCR级水补足至终体积30 µL。
   10. 配制接头连接反应体系：30 µL混合文库、5 µL接头混合液II（Adapter Mix II）、10 µL连接反应缓冲液（5x）和5 µL T4 DNA连接酶。通过移液混匀，短暂离心（1,000 x g，15–30 s）。室温孵育10 min。
   11. 加入20 µL基于磁珠的PCR纯化试剂，通过移液混匀。室温孵育10 min。
   12. 将离心管置于磁力架上，静置至磁珠沉淀且上清液变为无色。小心吸出并弃去上清液。
   13. 从磁力架上取下离心管，加入125 µL SFB。通过移液混匀后，重新放回磁力架以分离磁珠。待液体澄清后，吸出并弃去上清液。
   14. 重复上一步操作。将离心管在磁力架上敞口放置30 s，使残留液体进一步挥发。
   15. 将离心管从磁力架上取下，加入15 µL洗脱缓冲液。充分移液混匀，短暂离心（1,000 x g，15–30 s）。室温孵育5 min。置于磁力架上静置2 min。
   16. 吸取15 µL上清液转移至新的低吸附管中。此即最终文库。使用荧光定量DNA检测试剂盒测定其浓度。
       注：下一步需使用12 µL。若文库浓度过高，所需体积小于12 µL，则用洗脱缓冲液补足至12 µL。
3. 流动池加载与测序
   1. 将流动池（R9.4.1）插入实时DNA与RNA测序设备中。
   2. 在离心管中加入30 µL冲洗锚定试剂（flush tether, FLT）至冲洗缓冲液（flush buffer, FB）试剂中，配制成引物混合液。涡旋混匀后短暂离心（1,000 x g，15–30 s）。
   3. 打开引物口盖。使用1,000 µL移液器，设定体积为200 µL，将吸头插入引物口。缓慢旋转体积调节旋钮，直至观察到吸头内出现液体。弃去该吸头。
      注：仅需旋转至吸头内出现少量液体即可。吸入过多液体可能损坏流动池。
   4. 缓慢向引物口加入800 µL引物混合液，注意避免产生气泡。静置5 min。
   5. 在此期间，准备用于加载的文库。将37.5 µL测序缓冲液、25.5 µL加载缓冲液和12 µL文库混合。
      ​注：移液前需充分混匀加载缓冲液，该试剂中的磁珠沉降速度极快。
   6. 打开端口盖。向引物口缓慢加入200 µL引物混合液。
      注：在端口盖打开状态下向引物口移液时，会观察到样本口有小液滴渗出。移液速度应足够缓慢，使样本口能够吸入液滴而不溢出。
   7. 在加载文库前，通过移液充分混匀。使用设定为75 µL的100 µL移液器，吸取文库后逐滴加入样本口。切勿触碰端口，且每滴需等待完全吸收后再加入下一滴，以避免液体溢出。
   8. 关闭端口盖和引物口盖。打开测序软件并启动测序实验。选择开启碱基识别（basecalling On）。对于包含96个多重样本的文库，通常10–12小时的测序时间即可获得足够数据。
      注：可通过软件导入.csv格式的样本信息表。该表需包含以下字段：flow_cell_id、position_id、sample_id、experiment_id、flow_cell_product_code和kit。需填写流动池ID（位于流动池侧面）及所用试剂盒信息。本推荐方案应选择LSK109试剂盒。
4. 测序数据分析
   1. 将压缩的fastq测序读段导入wf-artic分析流程⁴¹。分别使用两种不同的引物方案（ARTIC/V4.1和NEB-VarSkip/v1a）独立运行流程。每个样本将生成两个“.primertrimmed.rg.sorted.bam”文件。
   2. 使用“samtools merge”命令将BAM文件合并为单个文件⁴²。将合并后的BAM文件输入Freyja工具，保留默认参数，以获得各谱系的相对丰度⁴³。
   3. 为生成FASTA文件，将合并后的BAM文件依次输入“samtools mpileup”和“ivar”工具，使用默认参数^44,45。进行突变检测时，将FASTA文件导入Nextclade工具^46,47。

结果

上述结果总结于 表3 展示使用本文所述方法检测和定量废水中及空气样本中SARS-CoV-2 RNA的示例。废水样本采集自西班牙和斯洛文尼亚的污水处理厂，若三个重复样本中至少有两个的Ct值低于40，则视为阳性；若Ct值变异小于5%，则认为定量结果有效。在西班牙和葡萄牙，采集了室内和室外空气样本，并采用相同的判定标准。空气样本使用双重复而非三重复，因为本研究的目标是检测SARS-CoV-2 RNA的存在，而非对其进行精确定量。此外，只有当所有使用的对照（如本方案所述）结果符合预期，且mengovirus RNA对照未出现显著偏差时，RT-qPCR运行才被视为有效。在这些样本中，mengovirus的回收效率介于13.7%至19.7%之间。通过将提取的RNA稀释10倍和100倍后比较RT-qPCR结果，并结合使用商业抑制检测试剂盒，评估了PCR抑制效应。每种抑制对照试剂盒的使用应严格按照制造商提供的说明进行。

废水样品在三个重复样本之间的标准偏差为1.91%至13.98%，基因拷贝数范围为3.05 × 10³ 至 2.83 × 10...

讨论

利用（逆转录-）定量聚合酶链式反应（(RT-)qPCR）方法进行微生物和病毒的检测与定量因其极高的灵敏度而得到广泛认可。然而，在分析环境样品时，这些技术面临诸多挑战。废水样品中含有大量抑制性物质，可能扭曲检测结果并产生误导性数据。为克服这些局限性并提高检测精度，研究人员设计并实施了一套复杂的实验流程。该流程通过整合科学文献中的多种方案，并针对qPCR方法固有的限制，特别在每个操作步骤中引入了一系列严格的质控措施。通过整合这些严谨的质量控制手段，本方案为基于qPCR的检测与定量技术在复杂环境样品中的应用提供了可靠的解决方案^51,52。核酸提取阴性对照（NCI）和无模板对照（NTC）是评估RNA提取及逆转录-定量PCR（RT-qPCR）反应过程中是否存在污染的关键工具。此外，引入孟加拉病毒（mengovirus）控制RNA可有效评估样品间的变异程度，以及浓缩步骤的效率和复杂环境样品中抑制性物质的影响。在每一次RT-qPCR反应中，必须设置阳性对照，以确认扩增过程的有效性。严格监控实验流程的每一个步骤至关重要，包括样品的储存与...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
接头+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19	Oxford Nanopore	EXP-AMII001	测序
AllPrep PowerViral DNA/RNA 试剂盒	Qiagen	28000-50	RNA提取试剂盒
AMPure XP	贝克曼库尔特	A63880	PCR 纯化，NGS 纯化，PCR 产物纯化
ARTIC SARS-CoV-2 扩增子面板	IDT	10011442	SARS-CoV-2 基因组扩增
Blunt/TA连接酶预混液	NEB	M0367S	文库构建
CENTRICON PLUS­70 10KDA	Fisher Scientific	10296062	浓缩过滤器
CORIOLIS COMPACT 空气采样器	Bertin Technologies	083-DU001	空气采样器
杜兰 实验室瓶	默克	Z305200-10EA	采样瓶
流动池（R9.4.1）	Oxford Nanopore	FLO-MIN106D	测序
常规实验室耗材（离心管、qPCR 板等）
连接测序试剂盒	Oxford Nanopore	SQK-LSK109	测序
LunaScript RT SuperMix试剂盒	NEB	E3010	cDNA合成
Mengovirus 提取对照试剂盒	生物分子érieux	KMG	浓度控制
Nalgene 通用长期储存冻存管	赛默飞世尔科技	5011-0012	样品储存
原生条形码扩展 1-12（无需 PCR）	Oxford Nanopore	EXP-NBD104	条形码技术
NEBNext Ultra II 末端修复/dA加尾模块	NEB	E7595	DNA修复
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 引物混合物	NEB	E7658	SARS-CoV-2 基因组扩增
NEBNext 快速连接反应缓冲液	NEB	B6058S	测序
磷酸盐缓冲液	默克	P4474	收集缓冲液
磷酸盐缓冲液（PBS，1×），经无菌过滤	赛默飞世尔科技	J61196.AP	空气样品的洗脱
Q5 热启动高保真2X预混液	NEB	M0494S	热启动DNA聚合酶
Qubit RNA HS 检测试剂盒	赛默飞世尔科技	Q32852	RNA定量
SARS-CoV-2 RUO qPCR 引物 & 探针试剂盒	IDT	10006713	引物-探针混合液与qPCR阳性对照
TaqPath 1-Step RT-qPCR 预混液	赛默飞世尔科技	A15299	RT-qPCR试剂盒