本文介绍了一种通用的实验方案与设计方法，可用于鉴定藏药中复杂天然产物制剂（基质）中的痕量成分和次要组分。
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本文内容
摘要
摘要
藏药成分复杂，含有大量未知化合物，因此对其分子结构进行深入研究至关重要。液相色谱-电喷雾电离飞行时间质谱法（LC-ESI-TOF-MS）常用于藏药成分的提取分析；然而，在使用谱图数据库后，仍存在许多难以预测的未知化合物。本文建立了一种利用离子阱质谱法（IT-MS）鉴定藏药成分的通用方法。该方法包括样品制备、质谱条件设置、液相预运行、方法建立、质谱采集、多级质谱操作及人工数据分析等标准化和程序化流程。通过多级裂解技术，鉴定了藏药黄蜀葵（Abelmoschus manihot）种子中的两种代表性化合物，并对典型化合物结构进行了详细分析。此外，本文还探讨了离子模式选择、流动相调节、扫描范围优化、碰撞能量控制、碰撞模式切换、裂解影响因素以及该方法的局限性。所建立的标准化分析方法具有普适性，可应用于藏药中未知化合物的鉴定。
引言
中药中痕量成分的定性分析已成为当前研究中的一个重要课题。由于中药所含化合物种类繁多，难以将其分离后用于核磁共振波谱仪（NMR）或X射线衍射仪（XRD）分析，因此仅需微量样品的质谱法（MS）正变得越来越受欢迎。此外，近年来液相色谱（LC）与质谱联用技术已广泛应用于中药研究，以实现对复杂样品的更好分离及对化学成分的定性分析1。其中一种常用方法是液相色谱-电喷雾电离飞行时间质谱法（LC-ESI-TOF-MS），该方法在藏药的定性研究中被广泛应用2。该方法通过液相色谱柱对复杂组分进行富集和分离，并利用质谱检测器检测加合离子的质荷比（m/z）。目前，在使用四极杆飞行时间（Q-TOF）质谱和Orbitrap质谱进行小分子分析时，查询串联质谱（MS/MS或MS2）数据库是实现化合物可靠注释的最快途径3。然而，数据库质量较差以及存在多种异构体，限制了对未知化合物的鉴定。此外，MS/MS数据库所提供的信息仍较为有限4,5,6,7。建立一种可广泛适用于其他中药的通用研究方案，用于系统分析每种中药中的化学成分，具有重要意义。
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方案
1. 样品制备
- 准确称取1 g AMS样品，置于含有30 mL 80%甲醇的锥形瓶中。将混合物放入超声波清洗器中，在25 °C下超声提取30分钟。将样品在14,000 × g 条件下离心5分钟。
注：超声波清洗器的频率为40 KHz。 - 准备注射器和微孔滤膜（0.22 μm，仅限有机系）。将上清液过滤至2 mL样品瓶中。
2. 质谱设置
- 打开真空泵的开关。打开氩气瓶的主阀和分压阀，并将压力调节至约 0.3 MPa。打开氮气阀。
注意：至少等待 8 小时，以确保达到实验条件所需的足够真空度。在分析前检查氩气和氮气的气体压力是否充足。 - 启动质谱控制软件。在软件面板中点击 Heated SEI Source，输入质谱参数，包括加热器温度（350 °C）、鞘气流速（35 arb）、辅助气流速（15 arb）、喷雾电压（正离子模式为 3.8 KV，负离子模式为 −2.5 KV）和毛细管温度（275 °C）。点击 Apply 按钮以激活离子源。
3. 液相色谱预运行、方法建立及质谱采集
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结果
以纤维二糖作为模型，验证正离子模式下MSn技术的可行性。如图2A所示，纤维二糖[C12H22O11]+的ESI-MS（正离子模式）产生了质子化分子离子[M+H]+，其m/z为365。对m/z 365处的[M+H]+进行产物离子扫描（CID-MS/MS），得到m/z 305处的第二个碎片离子（图2B），该碎片离子进一步通过MS3和MS4分析进行研究（图2C、D）。MS3分析产生m/z 254处的第三个碎片离子，而MS4分析则产生m/z 185处的第四个碎片离子。MS/MS分析（图2E）显示，丢失的m/z 60碎片离子表明m/z 36.......
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讨论
离子阱质谱（IT-MS）及其MSn技术为鉴定痕量中药化合物结构提供了新方法。与无法深入鉴定碎片离子的Q-TOF-MS相比，IT-MS结合MSn技术因其具备离子分离与富集能力而表现优异。本文介绍了一种利用IT-MS和MSn技术鉴定藏药中痕量化合物的方法。该方法通过MSn中的n值来确定所提供的碎片离子信息量。关键步骤包括选择合适的扫描范围以及调整碰撞能量（CE）值，从而实现对有价值碎片的鉴定。
通常情况下，MSn 糖类的分析最好在正离子模式下进行16，而酚酸类和生物碱类化合物在负离子模式下分析效果最佳。通过在流动相中添加甲酸、乙酸和乙酸铵等添加剂，可提高化合物在电喷雾离子源（ESI）中的响应。17可考虑使用大气压化学电离源检测极性较弱的化合物。选择合适的扫描范围可增强碎片离子的强度，有利于后续的质谱分析阶段。n 由于每次MS中不可避免的能量衰减n
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作由成都中医药大学杏林人才计划（编号：030058191）、四川省自然科学基金（2022NSFSC1470）和国家自然科学基金（82204765）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | Thermo Scientific | CAS 75-05-8 | LC-MS 级 |
| 甲酸 | Knowles | CAS 64-18-6 | HPLC 级 |
| 线性离子阱质谱仪 | Thermo Scientific | LTQ XL | |
| 液相色谱仪 | Thermo Scientific | U3000 | |
| LTQ Tune | Thermo Scientific | version 2.8.0 | 质谱控制软件 |
| 甲醇 | Thermo Scientific | CAS 67-56-1 | LC-MS 级 |
| 纯水 | Thermo Scientific | CAS 7732-18-5 | LC-MS 级 |
| Xcalibur | Thermo Scientific | version 2.0 | LC-IT-MS 操作软件 |
参考文献
- Chen, X. -F., Wu, H. -T., Tan, G. -G., Zhu, Z. -Y., Chai, Y. -F. Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines. Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).
- Ou, C., et al.
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