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方法文章

采用离子阱质谱与多级碎片分析对藏药中化合物结构进行标准化鉴定

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DOI：

10.3791/65054

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2023年3月17日

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1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种通用的实验方案与设计方法，可用于鉴定藏药中复杂天然产物制剂（基质）中的痕量成分和次要组分。

摘要

藏药成分复杂，含有大量未知化合物，因此对其分子结构进行深入研究至关重要。液相色谱-电喷雾电离飞行时间质谱法（LC-ESI-TOF-MS）常用于藏药成分的提取分析；然而，在使用谱图数据库后，仍存在许多难以预测的未知化合物。本文建立了一种利用离子阱质谱法（IT-MS）鉴定藏药成分的通用方法。该方法包括样品制备、质谱条件设置、液相预运行、方法建立、质谱采集、多级质谱操作及人工数据分析等标准化和程序化流程。通过多级裂解技术，鉴定了藏药黄蜀葵（Abelmoschus manihot）种子中的两种代表性化合物，并对典型化合物结构进行了详细分析。此外，本文还探讨了离子模式选择、流动相调节、扫描范围优化、碰撞能量控制、碰撞模式切换、裂解影响因素以及该方法的局限性。所建立的标准化分析方法具有普适性，可应用于藏药中未知化合物的鉴定。

引言

中药中痕量成分的定性分析已成为当前研究中的一个重要课题。由于中药所含化合物种类繁多，难以将其分离后用于核磁共振波谱仪（NMR）或X射线衍射仪（XRD）分析，因此仅需微量样品的质谱法（MS）正变得越来越受欢迎。此外，近年来液相色谱（LC）与质谱联用技术已广泛应用于中药研究，以实现对复杂样品的更好分离及对化学成分的定性分析1。其中一种常用方法是液相色谱-电喷雾电离飞行时间质谱法（LC-ESI-TOF-MS），该方法在藏药的定性研究中被广泛应用2。该方法通过液相色谱柱对复杂组分进行富集和分离，并利用质谱检测器检测加合离子的质荷比（m/z）。目前，在使用四极杆飞行时间（Q-TOF）质谱和Orbitrap质谱进行小分子分析时，查询串联质谱（MS/MS或MS2）数据库是实现化合物可靠注释的最快途径3。然而，数据库质量较差以及存在多种异构体，限制了对未知化合物的鉴定。此外，MS/MS数据库所提供的信息仍较为有限4,5,6,7。建立一种可广泛适用于其他中药的通用研究方案，用于系统分析每种中药中的化学成分，具有重要意义。

离子阱质谱（IT-MS）通过向环形电极施加不同的射频（RF）电压来捕获多种离子8。IT-MS 能够以多种时间顺序进行连续的多级质谱扫描，实现成分的多级质谱（MSn）碎裂，其中 n 表示产物离子的级数9。线性离子阱质谱（Linear IT-MS）被认为在结构鉴定方面性能最佳，因其可用于连续的 MSn 实验10。在线性 IT-MS 中，目标离子可被选择性地分离并富集1。IT-MS 中的 MSn（n ≥ 3）比 Q-TOF-MS 中的 MS/MS 提供更丰富的碎片信息。由于 IT-MS 无法固定目标离子及其碎片离子，因此成为解析未知化合物（包括异构体）结构的有力工具1。MSn 技术已广泛应用于未知蛋白质、肽段和多糖的结构分析11,12。在复杂样品中，MSn 中碎片离子的丰度水平比 Q-TOF-MS 中的 MS/MS 提供更多关于目标化合物的分子碎片信息。因此，将 MSn 技术应用于中药成分的结构鉴定至关重要。

藏医药是中医药的重要组成部分13，这些药物主要来源于高原地区的动物、植物和矿物14藏药 黄蜀葵 种子（AMS）是某植物的种子 黄蜀葵（Abelmoschus manihot (Linn.) Medicus）AMS 是一种传统草药，用于治疗特应性皮炎、风湿病和麻风病等疾病。其含有查尔酮，具有抗菌、抗真菌、抗癌、抗氧化和抗炎作用。15在本研究中，MSn 改进了实验流程，并建立了利用离子阱质谱（IT-MS）和质谱（MS）鉴定藏药AMS中化合物结构的详细方法n某些质谱参数，包括离子模式、扫描范围和碰撞模式，经过优化以克服痕量化合物鉴定中的问题。本研究旨在促进中药中痕量化合物结构鉴定的标准化。

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方案

1. 样品制备

  1. 准确称取1 g AMS样品，置于含有30 mL 80%甲醇的锥形瓶中。将混合物放入超声波清洗器中，在25 °C下超声提取30分钟。将样品在14,000 × g 条件下离心5分钟。
    注：超声波清洗器的频率为40 KHz。
  2. 准备注射器和微孔滤膜（0.22 μm，仅限有机系）。将上清液过滤至2 mL样品瓶中。

2. 质谱设置

  1. 打开真空泵的开关。打开氩气瓶的主阀和分压阀，并将压力调节至约 0.3 MPa。打开氮气阀。
    注意：至少等待 8 小时，以确保达到实验条件所需的足够真空度。在分析前检查氩气和氮气的气体压力是否充足。
  2. 启动质谱控制软件。在软件面板中点击 Heated SEI Source，输入质谱参数，包括加热器温度（350 °C）、鞘气流速（35 arb）、辅助气流速（15 arb）、喷雾电压（正离子模式为 3.8 KV，负离子模式为 −2.5 KV）和毛细管温度（275 °C）。点击 Apply 按钮以激活离子源。

3. 液相色谱预运行、方法建立及质谱采集

  1. 分别使用0.1%甲酸水溶液和纯乙腈配制流动相A和流动相B。将两种溶液在超声波清洗器中脱气至少15分钟。将溶液分别连接至A相和B相的流路（图1A）配制甲醇-水溶液（1:9 v/v），然后手动将其加入泵和进样器的清洗液瓶中。
    注意：超声波清洗仪的超声频率为 40 KHz。
  2. 启动液相色谱-质谱联用仪控制软件。
    1. 点击 直接控制 打开液相色谱控制面板的按钮。逆时针方向打开泵模块上的吹扫阀（图 1B).
    2. 点击 更多选项 打开泵设置按钮，并将冲洗参数设为 5 mL/min−1 3 分钟。单击 清除 点击按钮以开始去除气泡，随后关闭排气阀。
  3. 点击 初灌注射器，洗涤缓冲液环，以及 外部清洗针头 分别按按钮冲洗注射器三个循环、冲洗环路一个循环、冲洗针头一个循环。将样品瓶放入进样器中图1C).
  4. 点击 仪器设置 按钮以打开方法编辑窗口。单击 新 单击按钮以创建新的液相色谱-质谱（LC-MS）仪器方法。
  5. 建立液相色谱方法的总运行时间。接下来，在方法编辑窗口中输入压力限值、总流速、流速梯度、样品温度、柱温以及准备温度差值。
    注意：在未安装色谱柱的情况下，流动相的默认总流速恒定为 0.3 mL/min，A 相和 B 相各占 50%，且不设置柱温。样品温度和准备温度差的默认值分别为 15 °C 和 0.1 °C。其他设置取决于所使用的液相色谱柱类型。
  6. 选择 常规质谱 或 质谱n 质谱方法的实验类型。输入参数以设置采集时间、电离模式、质量范围、分流值编号和分流持续时间。点击 保存 按钮以将设置配置为仪器方法。
    注意：未使用色谱柱时的默认设置如下：采集时间 2 min；电离模式为正离子或负离子；质量扫描范围 100 至 1,200；分流阀开启次数 2 次；每次分流持续时间 1.99 min。

4. 操作多级质谱

  1. 单击 Sequence Setup 按钮以打开序列表格。
    1. 在表格中输入以下信息：样品类型、文件名、路径、样品编号、仪器方法、位置和进样体积。
    2. 单击 Save 按钮保存序列表格，然后单击 Start Analysis 按钮以应用设置并启动质谱采集。
      注意：默认样品类型为“未知”。仪器方法为步骤 3.6 中保存的方法。样品瓶放置在样品室中的唯一位置。例如，RA1 表示样品室红色区域第一行的第一个位置。默认进样体积通常为 2 μL，具体取决于样品浓度。
  2. 在资源管理器中双击原始文件，将质谱数据载入数据处理软件。在基峰离子流图（BPI）中，通过单击并拖动鼠标选择曲线下面积（AUC）最大的区域。相应的质谱图将在同一窗口中显示。
  3. 为下一步的 MS/MS 分析选择目标离子。
    1. 重新打开方法编辑窗口。在 MSn Setting 表格中，将目标离子的 m/z 值保留一位小数，填入 Parent Mass 列。
    2. 选择 Collision 模式，并输入碰撞能量（CE）值。设置 MS/MS 扫描范围。单击 Save 按钮保存质谱方法，并在序列表格中输入新的文件名。单击 Start 按钮以启动 MS/MS 采集。
      注意：MS/MS 扫描范围为目标母离子的 40%–130%。在碰撞诱导解离（CID）模式下，默认 CE 值为 35%。
  4. 在资源管理器中双击原始文件，将 MS/MS 原始文件载入数据处理软件。
    1. 在 MS/MS 谱图中识别最强的碎片离子，并将其 m/z 值输入 MSn 方法列表。在 MSn Setting 表格中设置 MS3 参数，包括碰撞模式、CE 值和扫描范围。
    2. 单击 Save 按钮保存质谱方法，并在序列表格中输入新的文件名。单击 Start 按钮以启动 MS3 采集。
  5. 在资源管理器中双击原始文件，将 MS3 原始文件载入数据处理软件。重复步骤 4.4 以获得 MS4 谱图。
  6. 当谱图中未观察到稳定的碎片离子时，完成 MSn 实验。

5. 手动进行 MSn 数据分析

  1. 双击原始文件以打开从 MS 到 MSn 的所有质谱数据。手动计算母离子与其相应碎片离子之间的 m/z 差值。
    注意：例如，在 MS/MS 中，母离子（m/z 617.25）与其相应碎片离子（m/z 571.28）之间的 m/z 差值为 45.97；在 MS3 中，母离子（m/z 571.28）与其相应碎片离子（m/z 525.38）之间的 m/z 差值为 45.90；在 MS4 中，母离子（m/z 525.38）与其相应碎片离子（m/z 344.93 和 273.16）之间的 m/z 差值分别为 180.45 和 252.22。
  2. 根据 MS4 结果（即 MSn 的最高级谱图）手动绘制"核心"结构。基于 m/z 差值，利用官能团或分子片段手动推导出原始分子结构。根据每级 MSn 中的分子结构，手动绘制分子裂解路径。代表性结果部分详细展示了分子结构人工推导的示例。

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结果

以纤维二糖作为模型，验证正离子模式下MSn技术的可行性。如图2A所示，纤维二糖[C12H22O11]+的ESI-MS（正离子模式）产生了质子化分子离子[M+H]+，其m/z为365。对m/z 365处的[M+H]+进行产物离子扫描（CID-MS/MS），得到m/z 305处的第二个碎片离子（图2B），该碎片离子进一步通过MS3和MS4分析进行研究（图2C、D）。MS3分析产生m/z 254处的第三个碎片离子，而MS4分析则产生m/z 185处的第四个碎片离子。MS/MS分析（图2E）显示，丢失的m/z 60碎片离子表明m/z 36...

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讨论

离子阱质谱（IT-MS）及其MSn技术为鉴定痕量中药化合物结构提供了新方法。与无法深入鉴定碎片离子的Q-TOF-MS相比，IT-MS结合MSn技术因其具备离子分离与富集能力而表现优异。本文介绍了一种利用IT-MS和MSn技术鉴定藏药中痕量化合物的方法。该方法通过MSn中的n值来确定所提供的碎片离子信息量。关键步骤包括选择合适的扫描范围以及调整碰撞能量（CE）值，从而实现对有价值碎片的鉴定。

通常情况下，MSn 糖类的分析最好在正离子模式下进行16，而酚酸类和生物碱类化合物在负离子模式下分析效果最佳。通过在流动相中添加甲酸、乙酸和乙酸铵等添加剂，可提高化合物在电喷雾离子源（ESI）中的响应。17可考虑使用大气压化学电离源检测极性较弱的化合物。选择合适的扫描范围可增强碎片离子的强度，有利于后续的质谱分析阶段。n 由于每次MS中不可避免的能量衰减n

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作由成都中医药大学杏林人才计划（编号：030058191）、四川省自然科学基金（2022NSFSC1470）和国家自然科学基金（82204765）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈Thermo ScientificCAS 75-05-8LC-MS 级
甲酸KnowlesCAS 64-18-6HPLC 级
线性离子阱质谱仪Thermo ScientificLTQ XL
液相色谱仪Thermo ScientificU3000
LTQ TuneThermo Scientificversion 2.8.0质谱控制软件
甲醇Thermo ScientificCAS 67-56-1LC-MS 级
纯水Thermo ScientificCAS 7732-18-5LC-MS 级
XcaliburThermo Scientificversion 2.0LC-IT-MS 操作软件

参考文献

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