利用离子阱质谱和多级碎裂分析对藏药化合物结构进行标准化鉴定

中药微量成分的定性分析已成为研究中的重要课题。由于中药中的化合物数量众多，很难将其分离出来用于核磁共振波谱仪（NMR）或X射线衍射仪（XRD）分析，这使得只需要低样品量的质谱（MS）方法越来越受欢迎。此外，液相色谱（LC）与MS联用近年来已广泛应用于中药研究中，用于改进复杂样品的分离和化合物的定性分析¹。一种常用的方法是液相色谱-电喷雾电离飞行时间质谱（LC-ESI-TOF-MS），广泛用于藏药的定性研究²。使用这种方法，复杂组分在LC色谱柱中富集和分离，并使用MS检测器观察加合物离子的质荷比（m / z）。搜索串联 MS（MS/MS 或 MS²）数据库是目前使用四极杆飞行时间 （Q-TOF） MS 和 Orbitrap MS³ 进行小分子分析中可靠化合物注释的最快方法。然而，数据库质量差和各种异构体的存在阻碍了未知化合物的鉴定。此外，MS/MS数据库提供的信息仅限于⁴，⁵，^6，7。使用可广泛应用于其他中药的通用方案研究每种中药中的化合物具有重要意义。

IT-MS通过向环形电极施加不同的射频（RF）电压来捕获各种^离子8。IT-MS可以按不同的时间顺序进行时间序列多阶段MS扫描，提供成分多阶段MS（MS n）碎片，其中ⁿ是产物^离子级数9。线性IT-MS被认为是结构识别的最佳选择，因为它可用于顺序MSⁿ 实验¹⁰。目标离子可以分离并积累在线性^{IT-MS 1}中。IT-MS中的MSⁿ （n ≥ 3）比Q-TOF-MS中的MS/MS提供更多的片段信息。由于IT-MS不能锁定目标离子及其碎片离子，因此它是阐明未知化合物（包括异构体¹）结构的有力工具。MSⁿ 技术已广泛应用于未知蛋白、多肽和多糖的结构分析^11，12。MSⁿ 中碎片离子的丰度水平比Q-TOF-MS中的MS/MS提供更多的复杂样品中靶向化合物的分子碎片信息。因此，将MSⁿ 技术应用于中医的结构鉴定至关重要。

藏医药是中医¹³的重要组成部分，这些药物主要来源于高原地区¹⁴发现的动物、植物和矿物质。藏药Abelmoschus manihot种子（AMS）是Abelmoschus manihot（linn.medicus）的种子。AMS 是一种传统草药，用于治疗特应性皮炎、风湿病和麻风病等疾病。它含有查耳酮，具有抗菌，抗真菌，抗癌，抗氧化和抗炎作用¹⁵。本研究改进了MS n程序，并开发了一种使用IT-MS和MSⁿ鉴定藏药AMS化合物结构的详细方法。优化了某些MS参数，包括离子模式、扫描范围和碰撞模式，以克服鉴定痕量化合物的问题。本研究旨在促进中药微量化合物的标准化结构鉴定。

1. 样品制备

1. 准确称取 1 g AMS 样品，并将其放入装有 30 mL 80% 甲醇的锥形烧瓶中。将混合物转移到超声浴超声仪中，在25°C下提取30分钟。 将样品以14，000 x g 离心5分钟。
   注意:超声波浴超声仪的频率为40 KHz。
2. 准备注射器和微孔膜过滤器（0.22μm，仅有机）。将上清液过滤到 2 mL 样品瓶中。

2. 质谱设置

1. 打开真空泵的开关。打开氩气缸的主阀和分压阀，将压力调节到约0.3MPa。打开氮气阀。
   注意:等待至少8小时，以确保实验条件有足够的真空度。分析前检查氩气和氮气的气体压力是否足够高。
2. 启动 MS 控制软件。单击软件面板中的 加热 SEI 源 ，然后输入 MS 参数，包括加热器温度 （350 °C）、护套气体流量 （35 arb）、辅助气体流量 （15 arb）、喷雾电压（正模式为 3.8 KV，负模式为 −2.5 KV）和毛细管温度 （275 °C）。单击 "应用 "按钮以激活离子源。

3. 液相色谱预运行、方法建立和MS采集

1. 分别使用0.1%甲酸水溶液和纯乙腈制备流动相A和流动相B。在超声波浴超声仪中对它们脱气至少15分钟。将溶液分别连接到 A 和 B 流体通道（图 1A）。准备甲醇-水（1:9 v/v）溶液，然后用手将其填充到泵和注射器的清洁液瓶中。
   注意:超声波浴超声仪的频率为40 KHz。
2. 启动 LC-MS 控制软件。
   1. 单击 直接控制 按钮以打开 LC 控制面板。在泵模块上以逆时针方向打开吹扫阀（图1B）。
   2. 单击 "更多选项 "按钮打开泵设置，并将吹扫参数设置为 5 mLmin⁻¹ ，持续 3 分钟。单击 "清除" 按钮开始去除气泡。随后，关闭吹扫阀。
3. 单击主注射 器、洗涤缓冲环和 外部清洗 针按钮，分别冲洗注射器三个周期、一个循环和针头一个周期。将样品瓶放入采样器中（图1C）。
4. 单击 仪器设置 按钮以打开方法编辑窗口。单击 "新建 "按钮以创建新的LC-MS仪器方法。
5. 为 LC 方法建立总运行时间。接下来，输入值以在方法编辑窗口中设置压力限值、总流速、流量梯度、样品温度、柱温和就绪温度增量。
   注意:流动相的默认总流速恒定为0.3 mL/min，使用50% A和50% B，在没有色谱柱的情况下无柱温。样品温度和就绪温度增量的默认值分别为15°C和0.1°C。其他设置取决于所用液相色谱柱的类型。
6. 为 MS 方法选择 常规 MS 或 MSⁿ 实验类型。输入值以配置采集时间、极性、质量范围、分流值数和分流值持续时间。单击 "保存 "按钮将设置配置为仪器方法。
   注意:没有色谱柱的默认设置如下:采集时间，2分钟;极性，正极或负极;质量范围，100 至 1，200;转移值数，2;和转移值持续时间，1.99 分钟。

4. 操作多级质谱

1. 单击序列设置按钮以打开 序列 表。
   1. 在表中，输入以下信息:样品类型、文件名、路径、样品 ID、仪器方法、位置和进样体积。
   2. 单击" 保存 "按钮记录序列表，然后单击 "开始分析 "按钮实现设置并启动MS采集。
      注意:默认样本类型被选为未知。仪器方法是步骤 3.6 中保存的方法。样品瓶放置在样品室中的独特位置。例如， RA1 是样品室中红色区域第一行中的第一个位置。默认进样体积通常为2 μL，这取决于样品的浓度。
2. 双击资源管理器中的原始文件，将MS数据加载到数据处理软件中。在基峰色谱图（BPI）中，通过单击并拖动鼠标选择曲线下最大面积（AUC）的区域。相应的MS谱图将显示在同一窗口中。
3. 选择目标离子进行下一次MS/MS分析。
   1. 重新打开方法编辑窗口。在 MSⁿ 设置 表中，将目标离子的m/z设置为 母质量 数列中的小数点后一位。
   2. 选择碰撞模式，然后输入 碰撞 能量 （CE） 值。设置 MS/MS 扫描范围。单击" 保存 "按钮记录 MS 方法，然后在序列表中输入新的文件名。单击 "开始 "按钮以启动 MS/MS 采集。
      注意:MS/MS扫描范围为目标母离子的40%-130%。碰撞诱导解离 （CID） 模式下的默认 CE 值为 35%。
4. 双击资源管理器中的原始文件，将 MS/MS 原始文件加载到数据处理软件中。
   1. 鉴定MS/MS谱图中最强的碎片离子，并将其m/z值输入MSⁿ方法列表中。在 MSⁿ 设置表中，设置 MS³ 参数，包括碰撞模式、CE 值和扫描范围。
   2. 单击" 保存 "按钮记录 MS 方法，然后在序列表中输入新的文件名。单击 "开始 "按钮以启动 MS³ 采集。
5. 双击资源管理器中的原始文件，将 MS³ 原始文件加载到数据处理软件中。重复步骤4.4以获得MS⁴ 频谱。
6. 当光谱中未观察到稳定的碎片离子时，完成MSⁿ 实验。

5. 手动MSⁿ 数据分析

1. 双击原始文件以打开从MS到MSⁿ的所有质谱。手动计算离子和相应碎片离子之间的m / z差异值。
   注:例如，离子（m/z 617.25）与相应碎片离子（m/z 571.28）之间的m/z差值在MS/MS中为45.97，在MS³中离子（m/z 571.28）和相应的碎片离子（m/z 525.38）之间的m/z差值为45.90，离子（m/z 525.38）与相应的碎片离子（m/z 344.93和273.16）之间的m/z差值为180.45和MS⁴ 中的 252.22 分。
2. 根据MS⁴ 结果（MSⁿ的最后一级）手动绘制"核心"结构。根据m / z差异值使用官能团或分子片段手动推导出原始结构。根据MSⁿ中的每个分子结构手动绘制分子切割路径。手动分子推导的示例详见代表性结果部分。

以玻璃二糖为模型，验证了MSn在正离子模式下的可行性。如图2A所示，纤维二糖[C 12 H22O11]+的ESI-MS（正离子模式）在m / z 365处产生质子化分子[M + H]+。[M+H]+ 在 m/z 365 处的产物离子扫描 （CID-MS/MS） 在 m/z 305 处产生第二个碎片离子（图 2B），并使用 MS3 和 MS4 分析对其进行进一步分析（图 2C，D）。MS3 分析在 m/z 254 处产生第三个碎片离子，MS4 分析在 m/z 185 处产生第四个碎片离子。MS/MS分析（图2E）显示，m/z 60处丢失的碎片离子表明m/z 365处的离子碎裂序列，即开环水解（蓝色标记）、C-C键裂解（红色标记）和脱水（绿色标记）。同样，MS3分析显示，m/z 60处丢失的碎片离子表明m/z 305处离子的C-C键裂解（标记为红色）。MS4分析表明，在m/z 60处丢失的碎片离子意味着水解（蓝色标记）和脱水（绿色标记），导致离子与m / z 245裂解为具有m / z 185的离子。MSn分析中的阶梯断裂表明该方法可用于研究碳水化合物的结构。

使用LC-Q-TOF-MS对AMS进行的初步定性分析揭示了许多未知化合物的存在。其中一种是m/z 617处的离子，被选中在负模式下进行MSn分析。在AMS中m/z 617处的[M-H]−的产物离子扫描（CID-MS/MS）在m/z 571处产生了第二个碎片离子。该碎片离子的MS3分析在m / z 525处产生第三个碎片离子，MS4分析在m / z 345和273处产生第四个碎片离子（图3A-D）。m/z 571的MS3在m/z 525处通过CH2OH部分作为甲醇（-32 Da）和OH部分（-18 Da）作为水的损失而产生碎片离子。这些MS4结果用于手动鉴定化合物的"核心"结构，并通过比较离子及其碎片离子的m / z值来确定其原始结构。化合物在m / z 617处的分子结构及其在MSn中的裂解路径如图3E所示。使用MSn在阳性模式下分析m / z 365处的另一种未知化合物。在AMS中m/z 365处的[M+H]+离子的产物离子扫描（CID-MS/MS）在m/z 299、m/z 329和m/z 347处产生第二个碎片离子。对这些碎片离子的MS3分析在m / z 231处产生了第三个碎片离子（图4A-C）。化合物在m/z 365处的分子结构和裂解机理如图4E所示。

图1:使用IT-MS和多级质谱分析鉴定藏药中的未知化合物结构 。 （A）液相色谱用流动相。（二）液相色谱泵。（三）样板室。（D） MS 的离子源。 （E） MS 中离子阱模块的内部结构。 （F） MS4 光谱。（G）来自MS4 结果的分子结构信息。 请点击此处查看此图的大图。

图 2:正离子模式下 通过 IT-MS 对纤维二糖进行多级碎裂 。 （A）纤维二糖的原始质谱。（B） MS/MS光谱中的碎片离子。（C） MS3 光谱中的碎片离子。（D） MS4 光谱中的碎片离子。（五）纤维二糖的裂解机理和分子结构。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:在负离子模式下 通过 IT-MS 对 m/z 617 处未知 AMS 化合物离子的多级碎裂和结构分析 。 （A） AMS的部分质谱。（B） MS/MS光谱中的碎片离子。（C） MS3 光谱中的碎片离子。（D） MS4 光谱中的碎片离子。（E）ams化合物离子在m/z 617处的切割机理和分子结构。 请点击此处查看此图的大图。

图 4:在正离子模式下 通过 IT-MS 在 m/z 365 处对未知 AMS 化合物离子进行多级碎裂结构分析 。 （A） AMS的部分质谱。（B） MS/MS光谱中的碎片离子。（C） MS3 光谱中的碎片离子。（D）ams化合物离子在m/z 365处的裂解机理和分子结构。 请点击此处查看此图的大图。

作者声明没有相互竞争的经济利益。