从环境水和废水样品中浓缩病毒是一项具有挑战性的任务，主要用于病毒的鉴定与定量。尽管已有多种病毒浓缩方法被开发和验证，本文展示了超滤法和脱脂乳絮凝法在不同样品类型中对RNA病毒的有效性。
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本文内容
摘要
摘要
基于水和废水的流行病学已成为监测和预测社区疫情发展趋势的替代方法。 从废水和环境水样品中回收微生物组分（包括病毒、细菌和微真核生物） 是这些方法中的关键挑战之一。本研究聚焦于采用装甲RNA作为测试病毒（该物质也被其他一些研究用作对照），评估连续超滤法与脱脂乳絮凝法（SMF）的回收效率。在超滤前，使用0.45 µm和0.2 µm膜圆盘滤器进行预过滤，以去除固体颗粒，防止超滤装置堵塞。采用连续超滤法处理的测试样品在两种不同转速下进行离心。结果表明，转速升高会导致装甲RNA的回收率和检出阳性率降低。 相比之下，SMF方法获得的装甲RNA回收率和阳性率相对稳定。对环境水样品进行的附加实验进一步证明了SMF在浓缩其他微生物组分方面的实用性。考虑到在废水样品超滤前实施的预过滤步骤，病毒向固体颗粒的分配可能会影响总体回收率。由于环境水样品中固体浓度较低，因而向固体的分配率也较低，SMF结合预过滤在处理此类样品时表现更优。 本研究中提出采用连续超滤法的初衷，源于新冠疫情期间需要减少病毒浓缩液的最终体积，当时常用超滤装置供应不足，亟需开发替代性的病毒浓缩方法。
引言
确定地表水和废水样品中用于微生物群落分析 和 流行病学研究的微生物有效浓度，是监测和预测社区疫情发展趋势的重要步骤之一1,2。COVID-19 大流行凸显了改进浓缩方法的重要性。COVID-19 于 2019 年底出现，截至 2023 年 3 月，仍对人类健康、社会生活和经济构成威胁。随着新一波疫情和病毒变异株的不断出现，以及病毒的快速传播、未报告和未诊断的无症状病例的存在，制定有效的监测与防控策略以减轻社区中 COVID-19 疫情的影响已成为重要的研究课题3,4,5。民间社会组织、政府机构以及公共或私营公用事业部门利用基于废水的流行病学方法监测 COVID-19，在提供快速疫情相关信息和减轻疫情冲击方面发挥了积极作用6,7,8,9。然而，从废水中浓缩具有包膜的 RNA 病毒 SARS-CoV-2 仍面临挑战10
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方案
1. 废水样本中病毒浓缩的两种方法比较：连续超滤法与脱脂牛奶絮凝法
- 样品制备
- 采集2升24小时流量比例复合原污水（进水）样品。样品于2020年夏季和秋季采集自加拿大温尼伯市的三家主要污水处理厂（WWTPs）。表1).
- 将样品置于避光瓶中，放入冰盒内运送到实验室，并在24小时内完成处理。收集废水的理化和生物特性数据。
- 病毒浓度测定实验
注意：采用连续超滤法和有机絮凝法（即脱脂乳絮凝法，SMF），并以装甲RNA作为测试病毒，评估每种方法的总回收效率23其他研究人员也使用装甲RNA作为对照病毒，以评估包膜病毒浓缩方法的回收率，例如科 冠状病毒科22,24,25,26.- 对于装甲RNA的添加，将超滤法和SMF法的废水检测体积分别设置为140 mL和500 mL。使用移液器加入5 × 104 将Armored RNA分别加入两种不同采集日期的六份新鲜废水样本中，每种超滤方法各使用六....
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结果
病毒RNA浓缩方法的评估
所有使用UF-3k × g处理的六个样品均为阳性，回收率为13.38% ± 8.14%（图1）。当样品使用UF-7.5k × g处理时，仅有一个样品呈阳性。所有使用SMF处理的样品均为阳性，回收率为15.27% ± 2.65%（图1）。UF-3K × g和SMF的平均回收率显著且一致地（p < 0.0001）高于UF-7.5K × g。另一方面，UF-3K × g与SMF之间的回收率无显著差异（p = 0.6240）。将B品牌离心装置的离心速度从3,000 × g提高至7,500 × g导致回收率降低，这可能是由于装甲RNA通过滤膜的速率增加，以及在更高离心力下装甲RNA颗粒更易结合到滤膜上所致。采用超滤法去除固体颗粒可能导致超滤法相对于SMF的回收率较低，这可能与装甲RNA向废水中固体.......
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讨论
本研究中的一个关键步骤是通过使用孔径为0.2 µm和0.45 µm的膜滤器进行预过滤，以去除固体颗粒。考虑到病毒（尤其是包膜病毒）可能与固体颗粒结合，预过滤可能导致病毒回收率显著降低30。尽管在环境样品和废水样品中，超滤方法几乎总是需要预过滤步骤，以防止超滤装置堵塞，但对于SMF方法是否需要预过滤则取决于后续分析的类型。对于靶向PCR研究，可能无需进行预过滤。然而，预过滤可能显著改善病毒宏基因组学分析效果，因为它可减少来自微真核生物和细菌等较大组分的背景噪声。该步骤对测序至关重要，可避免较大的基因组淹没病毒信号。
通过连续超滤可处理的样品体积限于140 mL。对于病毒含量较低的样品，这是一个重要的限制。相比之下，SMF能够处理更大的样品体积，从而提高病毒回收的概率。
SMF 的回收率与其他关注废水中病毒颗粒浓缩的研究结果一致。先前发表的论文报道了使用多种测试病毒获得的类似回收率，所述平均回收率 在这些研究中范围为 介于 3.4% 和 14% 之间
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披露
作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）联盟新冠专项资助（资助编号：431401363，2020-2021年，Yuan博士与Uyaguari-Díaz博士）。MUD感谢曼尼托巴大学研究资助计划（资助编号：325201）的支持。JF和JZA均获得视觉与自动化疾病分析（VADA）研究生培训项目的支持。KY和JF均获得了Mitacs Accelerate项目的博士后奖学金。MUD及其实验室成员（KY、JF、JZA）得到了NSERC-发现基金（RGPIN-2022-04508）以及曼尼托巴研究会新研究者运营资助（编号5385）的支持。特别感谢加拿大曼尼托巴省温尼伯市政府。本研究在曼尼托巴大学开展。我们谨此申明，曼尼托巴大学的校园位于Anishinaabeg、Cree、Oji-Cree、Dakota和Dene民族的传统领地，以及梅蒂斯民族的家园之上。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.5） | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific，美国新泽西州费尔劳恩 |
| 0.2 μm 47毫米 Supor-200 膜圆盘滤器 | VWR | 66234 | Pall 公司，密歇根州安娜堡 |
| 0.45 μm 47毫米 Supor-200 膜圆盘滤器 | VWR | 60043 | Pall Corporation，美国密歇根州安娜堡 |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | 赛默飞世尔科技 | 4444432 | 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，Life Technologies |
| 装甲RNA定量IPC-1处理对照 | Asuragen | 49650 | Asuragen，美国德克萨斯州奥斯汀 |
| Brand A，Jumbosep 离心浓缩管，30-kDa | 帕尔 | OD030C65 | Pall Corporation，密歇根州安娜堡 |
| 品牌 B，Microsep Advance 离心装置，30-kDa | 帕尔 | MCP010C46 | Pall公司，密歇根州安娜堡 |
| 离心管（50 ml） | Nalgene | 3119-0050PK | 赛默飞世尔科技 |
| DNA酶I | Invitrogen | 18047019 | 赛默飞世尔科技 |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | 赛默飞世尔科技 |
| GWV 高容量地下水采样胶囊 - 0.45 µm | 帕尔 | 12179 | Pall Corporation，美国密歇根州安娜堡 |
| 盐酸，1N 标准溶液 | 赛默飞世尔科技 | AC124210025 | Fisher Scientific，美国新泽西州费尔劳恩 |
| MagMAX 微生物组超核酸分离试剂盒 | 应用生物系统公司 | A42358 | 赛默飞世尔科技 |
| 无核酸酶水 | Promega | P1197 | Promega Corporation，Fitchburg，WI，美国 |
| 蠕动泵 | Masterflex，Cole-Parmer 仪器 | 7553-20 | 赛默飞世尔科技 |
| pH计 | 丹佛仪器 | RK-59503-25 | Cole-Parmer。该产品已停产 |
| 苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | 美国新泽西州费尔劳恩，Fisher Scientific |
| 引物和探针组合 | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc.，美国爱荷华州科拉尔维尔 | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome 试剂盒 | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc.，美国马里兰州日耳曼敦 | |
| QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统 | 赛默飞世尔科技 | A34322 | 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，Life Technologies |
| Qubit 1X dsDNA 高敏（HS）检测试剂盒 | Invitrogen | Q33231 | 赛默飞世尔科技 |
| Qubit 4 荧光仪（带 WiFi） | Invitrogen | Q33238 | 赛默飞世尔科技 |
| Qubit RNA 高灵敏度（HS）检测试剂盒 | Invitrogen | Q32855 | 赛默飞世尔科技 |
| RNA酶A | Invitrogen | EN0531 | 赛默飞世尔科技 |
| RNeasy PowerMicrobiome 试剂盒 | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc.，美国马里兰州日耳曼敦 |
| 脱脂奶粉 | Difco（BD生命科学） | DF0032173 | Fisher Scientific，美国新泽西州费尔劳恩 |
| 磷酸钠缓冲液 | Alfa Aesar | Alfa Aesar，加拿大安大略省渥太华 | |
| 合成海水 | VWR | RC8363-1 | RICCA 化学公司 |
| 合成单链DNA gBlock | IDT | 美国艾德斯科技公司，爱荷华州科拉尔维尔 | |
| VacuCap 90 真空过滤装置 - 0.1 µm，90 毫米，γ-辐照 | 帕尔 | 4621 | Pall公司，密歇根州安娜堡 |
| VacuCap 90 真空过滤装置 - 0.2 µm，90 毫米，γ-射线照射 | 帕尔 | 4622 | Pall公司，密歇根州安娜堡 |
| β-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific，美国新泽西州费尔劳恩 |
参考文献
- Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
- Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S.
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