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方法文章

利用脱脂牛奶絮凝与超滤法从环境水和废水样品中浓缩病毒颗粒

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DOI：

10.3791/65058

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2023年3月17日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Civil Engineering, Price Faculty of Engineering, University of Manitoba, 2Department of Microbiology, Faculty of Science, University of Manitoba

本文内容

摘要

从环境水和废水样品中浓缩病毒是一项具有挑战性的任务，主要用于病毒的鉴定与定量。尽管已有多种病毒浓缩方法被开发和验证，本文展示了超滤法和脱脂乳絮凝法在不同样品类型中对RNA病毒的有效性。

摘要

基于水和废水的流行病学已成为监测和预测社区疫情发展趋势的替代方法。 从废水和环境水样品中回收微生物组分（包括病毒、细菌和微真核生物） 是这些方法中的关键挑战之一。本研究聚焦于采用装甲RNA作为测试病毒（该物质也被其他一些研究用作对照），评估连续超滤法与脱脂乳絮凝法（SMF）的回收效率。在超滤前，使用0.45 µm和0.2 µm膜圆盘滤器进行预过滤，以去除固体颗粒，防止超滤装置堵塞。采用连续超滤法处理的测试样品在两种不同转速下进行离心。结果表明，转速升高会导致装甲RNA的回收率和检出阳性率降低。 相比之下，SMF方法获得的装甲RNA回收率和阳性率相对稳定。对环境水样品进行的附加实验进一步证明了SMF在浓缩其他微生物组分方面的实用性。考虑到在废水样品超滤前实施的预过滤步骤，病毒向固体颗粒的分配可能会影响总体回收率。由于环境水样品中固体浓度较低，因而向固体的分配率也较低，SMF结合预过滤在处理此类样品时表现更优。 本研究中提出采用连续超滤法的初衷，源于新冠疫情期间需要减少病毒浓缩液的最终体积，当时常用超滤装置供应不足，亟需开发替代性的病毒浓缩方法。

引言

确定地表水和废水样品中用于微生物群落分析 和 流行病学研究的微生物有效浓度，是监测和预测社区疫情发展趋势的重要步骤之一1,2。COVID-19 大流行凸显了改进浓缩方法的重要性。COVID-19 于 2019 年底出现，截至 2023 年 3 月，仍对人类健康、社会生活和经济构成威胁。随着新一波疫情和病毒变异株的不断出现，以及病毒的快速传播、未报告和未诊断的无症状病例的存在，制定有效的监测与防控策略以减轻社区中 COVID-19 疫情的影响已成为重要的研究课题3,4,5。民间社会组织、政府机构以及公共或私营公用事业部门利用基于废水的流行病学方法监测 COVID-19，在提供快速疫情相关信息和减轻疫情冲击方面发挥了积极作用6,7,8,9。然而，从废水中浓缩具有包膜的 RNA 病毒 SARS-CoV-2 仍面临挑战10。例如，其中一个挑战是 SARS-CoV-2 在废水固体中的分布特性，这可能在浓缩过程中因去除固体而导致回收率降低11。若确实如此，则定量/评估的重点应同时放在环境水样的固相和液相上，而不仅仅是液相。此外，浓缩方法的选择可根据后续检测和分析的需求进行调整。随着测序技术和微生物组学领域的发展，从环境样品中浓缩病毒颗粒和病原体已成为一项紧迫的研究课题。

在环境水和废水样本的病毒浓缩领域，已应用多种病毒浓缩方法。一些常用的方法包括过滤法、脱脂乳絮凝法（SMF）、吸附/洗脱法以及聚乙二醇沉淀法12-17。其中，SMF被认为是一种经济且有效的方法，已成功测试并应用于从废水和地表水中回收病毒，包括SARS-CoV-212,15,16,18。SMF是一种相对较新的方法，近年来在许多环境研究中获得了越来越多的认可，被认为是一种适用于从各种类型的水样（包括污泥、原污水、废水和出水样本）中同时回收多种微生物（如病毒、细菌和原生动物）的合适方法19。与其他已知的从环境样本中回收病毒的方法（如超滤法、甘氨酸-碱性洗脱法、基于冻干的方法或超速离心结合甘氨酸-碱性洗脱法）相比，SMF被报道为最高效的方法，具有更高的病毒回收率和检出率18,20。在本研究中，我们使用装甲RNA（Armored RNA）作为测试病毒，评估包括SARS-CoV-2回收效果在内的病毒浓缩方法的回收效率21,22。

本研究中，我们检测了废水和环境水样本，以验证使用SMF及连续超滤方法浓缩微生物组分的实用性，可用于定量聚合酶链式反应（qPCR）、基于测序的宏基因组学以及深度扩增子测序。与超滤方法相比，SMF是一种成本相对较低且适用于较大样本量的方法。连续超滤方法的提出源于在COVID-19大流行期间降低病毒浓缩物终体积的需要，当时常用超滤装置的供应有限，亟需开发替代性的病毒浓缩方法。

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方案

1. 废水样本中病毒浓缩的两种方法比较：连续超滤法与脱脂牛奶絮凝法

  1. 样品制备
    1. 采集2升24小时流量比例复合原污水（进水）样品。样品于2020年夏季和秋季采集自加拿大温尼伯市的三家主要污水处理厂（WWTPs）。表1).
    2. 将样品置于避光瓶中，放入冰盒内运送到实验室，并在24小时内完成处理。收集废水的理化和生物特性数据。
  2. 病毒浓度测定实验
    注意：采用连续超滤法和有机絮凝法（即脱脂乳絮凝法，SMF），并以装甲RNA作为测试病毒，评估每种方法的总回收效率23其他研究人员也使用装甲RNA作为对照病毒，以评估包膜病毒浓缩方法的回收率，例如科 冠状病毒科22,24,25,26.
    1. 对于装甲RNA的添加，将超滤法和SMF法的废水检测体积分别设置为140 mL和500 mL。使用移液器加入5 × 104 将Armored RNA分别加入两种不同采集日期的六份新鲜废水样本中，每种超滤方法各使用六份；此外，另取第三日（较晚日期）采集并储存于4 °C的六份废水样本，在数日后进行SMF处理。
      注意：在不同日期采集的六组样本中，每组均包含来自三个污水处理厂（WWTPs）的各两个样本。在本研究中，第一组新鲜废水样本采集于7月8日th，2020年，第二次于9月30日th，2020年，废水样本于10月14日储存用于SMFth, 2020.
    2. 在4 °C下使用磁力搅拌器搅拌30分钟，以将装甲RNA接种并均匀分散于样品中。
    3. 去除所有大于 0.2 μm 的颗粒或细胞，并进行超滤。
      1. 通过纱布和低蛋白结合的 0.45 µm 与 0.2 µm、47 mm 膜圆盘滤器，分别过滤加标废水样品（从每个 140 mL 加标样品中取 120 mL），以去除大颗粒、沉淀物、真核生物和细菌27使用下述超滤方法处理过滤后的样品。
        注意：7月8日采集的废水样本th 9月30日th 用于超滤方法，3,000 x g 和 7,500 × g分别。
      2. 对于在3,000 x条件下进行的顺序超滤 g (UF-3k x g)，将首次采集的共120 mL测试样品在3,000 x g 使用品牌A的30 kDa离心装置，将60 mL样品分两次浓缩至约5 mL，持续30分钟。然后，在3,000 x g条件下将5 mL体积进一步浓缩 g 使用品牌B的30 kDa离心装置，离心30分钟，浓缩至500–1,200 µL。
      3. 对于7,500 × g下的顺序超滤 g (UF-7.5k x g），将品牌B离心装置的离心速度从3,000 x g 至 7,500 x g 为获得更小的终体积，按照制造商的建议操作，并保持A品牌离心装置的离心速度不变。
        注意：检测使用的是9月30日采集的样本th.
    4. 对于SMF，执行以下步骤。
    5. 将废水样品（每份500 mL）加标后，直接采用SMF法进行浓缩16,18，无需使用纱布和低蛋白结合膜圆片滤器进行预过滤，如下所述。
    6. 将0.5 g脱脂奶粉溶于50 mL人工海水，配制成1%（w/v）的脱脂牛奶溶液，并用1 N HCl小心调节溶液pH至3.5。
      注意：由于病毒的等电点发生变化，酸化会导致病毒在水中聚集并沉淀16 并提高奶粉的溶解度28.
    7. 向500 mL原始废水样品中加入5 mL脱脂牛奶溶液，使脱脂牛奶的终浓度为0.01%（w/v）。
    8. 将样品以中等速度搅拌8小时，然后在室温下静置8小时，使形成的絮状物沉降。
    9. 使用血清移液管小心移除上清液，避免扰动已沉淀的絮状物。将含有絮状物的终体积50 mL转移至离心管中，在8,000 x g 在 8 °C 下孵育 30 分钟。
    10. 使用无菌刮勺小心刮取沉淀，弃去上清液后，将管中剩余的沉淀用 250 µL 0.2 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.5）重悬。将刮下并重悬的沉淀转移至相同的 1.5 mL 微型离心管中。
  3. 使用RNA提取试剂盒，按照制造商说明书，采用25:24:1的苯:氯仿:异戊醇混合液及β-巯基乙醇，从废水样本的病毒浓缩液中提取病毒RNA，并进行回收效率检测，以提高提取效率。最后，用50 µL洗脱缓冲液洗脱RNA。
  4. 实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析
    1. 使用十倍系列稀释法对装甲RNA进行定量（7.8 × 10）4 至7.8个基因拷贝的合成单链DNA或gBlock构建体。参见 表2 用于检测和定量装甲RNA的引物和探针组
    2. 使用引物设计工具设计引物和探针序列29 靶向装甲RNA基因组内的一个95 bp区域（gBlock构建体）。
    3. 每次RT-qPCR实验均需获得标准曲线。每个qPCR反应中均需包含阴性对照。标准品、样品和无模板对照均需设置三个重复。
    4. 配制每份10 µL的RT-qPCR反应体系，顺序如下：2.5 µL 4x预混液、每种引物400 nM、探针200 nM、2.5 µL模板，以及无DNA酶/RNA酶的超纯去离子水。
    5. 在实时荧光定量PCR系统中进行热循环反应，50 °C孵育5 min，随后进行45个循环：95 °C变性10 s，60 °C退火延伸30 s。若CT值 <40，视为样本装甲RNA阳性。
    6. 使用牛血清白蛋白对原始污水样本进行qPCR和RT-qPCR检测，以评估是否存在抑制物或污染物（如腐殖酸）的可能性24未观察到含酶与不含酶样品之间存在显著差异。
  5. 根据标准曲线计算浓度。通过将回收浓度除以加标浓度来计算回收率百分比。
  6. 对基因拷贝数进行对数转换10 用于分析。使用统计分析工具对qPCR数据进行一般线性模型分析。采用Tukey检验来检测不同方法和处理之间的差异。进行 p将0.05的值作为检验的最低显著性水平。

2. 用于基于水的流行病学研究的DNA和RNA病毒的过滤与浓缩

  1. 采集环境地表水时，收集 10 L 环境地表水样品，并使用 10 L 去离子水样品作为空白对照。所有样品采集后需在 24 小时内处理，期间储存于 4 °C 环境中。
  2. 采用 SMF 方法对环境样品中的病毒进行浓缩，具体步骤如下：
    1. 使用 高容量地下水采样胶囊和孔径分别为 0.45 µm、0.2 µm 和 0.1 µm 的膜圆盘滤器进行胶囊过滤和真空过滤，以减少宏基因组测序过程中的背景噪声，实现从较大的微真核生物和细菌到较小的病毒等不同组分的逐步分离。
    2. 在 1.32 L 合成海水中加入 13.2 g 脱脂奶粉，配制 1%（质量/体积）的预絮凝脱脂牛奶溶液。使用 1 N HCl 将该悬浮液的 pH 值调节至 3.5。
  3. 使用 1 N HCl 将环境地表水样品的 pH 值调节至 3.5。
  4. 将 100 mL 预絮凝并酸化的脱脂牛奶溶液加入 10 L 已酸化（pH 3.5）的环境水样品中（最终脱脂牛奶浓度为 0.01% [w/v]）。
  5. 使用磁力搅拌器和磁力搅拌子，在室温下搅拌样品 8 小时，随后静置 8 小时使絮状物通过重力自然沉降。在不扰动絮状物的前提下，使用真空泵小心移除上清液。
  6. 将剩余的絮状物按重量分装至 50 mL 离心管中并平衡后，在 4 °C 条件下以 8,000 × g 离心 30 分钟。
  7. 弃去上清液，将所得沉淀（理论上含有目标病毒）溶解于 200 µL 0.2 M 磷酸钠缓冲液中。
  8. 按照试剂生产商的说明，使用 DNase I 和 RNase A 处理溶解后的沉淀，以去除因核酸提取试剂盒共沉淀而存在的游离 DNA 和 RNA。随后按照生产商说明灭活 DNase I 和 RNase A。
  9. 按照生产商说明，使用 DNA/RNA 提取试剂盒从溶解的沉淀中提取总核酸。
  10. 使用荧光计测定出水样品中提取的 DNA 和 RNA 总量。浓度高于>1 ng/µL 的样品被认为适合进行 DNA 定量和测序。
  11. 进行 qPCR 分析以靶向目标肠道病毒，并通过高通量测序分析病毒群落结构。

3. 用于基于水的流行病学研究的微生物组分直接沉淀与浓缩

  1. 从受保护和受干扰的水道中采集 2 L 水样。如果样品中含有大量碎屑，请使用纱布将其去除。
    注意：强烈建议为每个样品采集一个生物学重复样。
  2. 通过将 4.4 g 脱脂奶粉溶解于 440 mL 人工海水，配制 1% (w/v) 的脱脂牛奶溶液。用 1 N HCl 将该悬浮液的 pH 值调节至 3.5。
  3. 使用 1 N HCl 将淡水样品的 pH 值调节至 3.5。
  4. 向先前已调节 pH 的 2 L 淡水样品中加入 20 mL 脱脂牛奶溶液（最终脱脂牛奶浓度为 0.01% [w/v]）。在室温下搅拌样品 8 小时。
  5. 让絮状物通过重力沉降 8 小时。使用蠕动泵小心移除上清液。将沉降的絮状物转移至 50 mL 离心管中，并在 8,000 x g 下离心 30 分钟。
  6. 弃去上清液，并用 200 µL 0.2 M 磷酸钠缓冲液重悬沉淀物。将样品在 -20 °C 下保存，或选择约 0.5 g 絮状物，使用合适的核酸提取试剂盒按照制造商说明进行微生物 DNA 提取。
  7. 使用高灵敏度荧光计测定 DNA 核酸浓度和纯度。浓度 >1 ng/µL 的样品适用于 DNA 定量和测序。

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结果

病毒RNA浓缩方法的评估
所有使用UF-3k × g处理的六个样品均为阳性，回收率为13.38% ± 8.14%（图1）。当样品使用UF-7.5k × g处理时，仅有一个样品呈阳性。所有使用SMF处理的样品均为阳性，回收率为15.27% ± 2.65%（图1）。UF-3K × g和SMF的平均回收率显著且一致地（p < 0.0001）高于UF-7.5K × g。另一方面，UF-3K × g与SMF之间的回收率无显著差异（p = 0.6240）。将B品牌离心装置的离心速度从3,000 × g提高至7,500 × g导致回收率降低，这可能是由于装甲RNA通过滤膜的速率增加，以及在更高离心力下装甲RNA颗粒更易结合到滤膜上所致。采用超滤法去除固体颗粒可能导致超滤法相对于SMF的回收率较低，这可能与装甲RNA向废水中固体...

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讨论

本研究中的一个关键步骤是通过使用孔径为0.2 µm和0.45 µm的膜滤器进行预过滤，以去除固体颗粒。考虑到病毒（尤其是包膜病毒）可能与固体颗粒结合，预过滤可能导致病毒回收率显著降低30。尽管在环境样品和废水样品中，超滤方法几乎总是需要预过滤步骤，以防止超滤装置堵塞，但对于SMF方法是否需要预过滤则取决于后续分析的类型。对于靶向PCR研究，可能无需进行预过滤。然而，预过滤可能显著改善病毒宏基因组学分析效果，因为它可减少来自微真核生物和细菌等较大组分的背景噪声。该步骤对测序至关重要，可避免较大的基因组淹没病毒信号。

通过连续超滤可处理的样品体积限于140 mL。对于病毒含量较低的样品，这是一个重要的限制。相比之下，SMF能够处理更大的样品体积，从而提高病毒回收的概率。

SMF 的回收率与其他关注废水中病毒颗粒浓缩的研究结果一致。先前发表的论文报道了使用多种测试病毒获得的类似回收率，所述平均回收率 在这些研究中范围为 介于 3.4% 和 14% 之间

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披露

作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）联盟新冠专项资助（资助编号：431401363，2020-2021年，Yuan博士与Uyaguari-Díaz博士）。MUD感谢曼尼托巴大学研究资助计划（资助编号：325201）的支持。JF和JZA均获得视觉与自动化疾病分析（VADA）研究生培训项目的支持。KY和JF均获得了Mitacs Accelerate项目的博士后奖学金。MUD及其实验室成员（KY、JF、JZA）得到了NSERC-发现基金（RGPIN-2022-04508）以及曼尼托巴研究会新研究者运营资助（编号5385）的支持。特别感谢加拿大曼尼托巴省温尼伯市政府。本研究在曼尼托巴大学开展。我们谨此申明，曼尼托巴大学的校园位于Anishinaabeg、Cree、Oji-Cree、Dakota和Dene民族的传统领地，以及梅蒂斯民族的家园之上。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.5）Alfa AesarJ62041APFisher Scientific，美国新泽西州费尔劳恩
0.2 μm 47毫米 Supor-200 膜圆盘滤器VWR66234Pall 公司，密歇根州安娜堡
0.45 μm 47毫米 Supor-200 膜圆盘滤器VWR60043Pall Corporation，美国密歇根州安娜堡
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix赛默飞世尔科技4444432美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，Life Technologies
装甲RNA定量IPC-1处理对照Asuragen49650Asuragen，美国德克萨斯州奥斯汀
Brand A，Jumbosep 离心浓缩管，30-kDa帕尔 OD030C65Pall Corporation，密歇根州安娜堡
品牌 B，Microsep Advance 离心装置，30-kDa帕尔MCP010C46Pall公司，密歇根州安娜堡
离心管（50 ml） Nalgene3119-0050PK赛默飞世尔科技
DNA酶IInvitrogen18047019赛默飞世尔科技
Dyna Mag-2Invitrogen12027赛默飞世尔科技
GWV 高容量地下水采样胶囊 - 0.45 µm帕尔12179Pall Corporation，美国密歇根州安娜堡
盐酸，1N 标准溶液赛默飞世尔科技AC124210025Fisher Scientific，美国新泽西州费尔劳恩
MagMAX 微生物组超核酸分离试剂盒应用生物系统公司A42358赛默飞世尔科技
无核酸酶水PromegaP1197Promega Corporation，Fitchburg，WI，美国
蠕动泵Masterflex，Cole-Parmer 仪器7553-20赛默飞世尔科技
pH计 丹佛仪器RK-59503-25Cole-Parmer。该产品已停产
苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1Invitrogen15593031美国新泽西州费尔劳恩，Fisher Scientific
引物和探针组合IDTIntegrated DNA Technologies, Inc.，美国爱荷华州科拉尔维尔
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome 试剂盒QiagenQiagen Sciences, Inc.，美国马里兰州日耳曼敦
QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统赛默飞世尔科技A34322美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，Life Technologies
Qubit 1X dsDNA 高敏（HS）检测试剂盒InvitrogenQ33231赛默飞世尔科技
Qubit 4 荧光仪（带 WiFi）InvitrogenQ33238赛默飞世尔科技
Qubit RNA 高灵敏度（HS）检测试剂盒InvitrogenQ32855赛默飞世尔科技
RNA酶AInvitrogenEN0531赛默飞世尔科技
RNeasy PowerMicrobiome 试剂盒Qiagen26000-50Qiagen Sciences, Inc.，美国马里兰州日耳曼敦
脱脂奶粉Difco（BD生命科学）DF0032173Fisher Scientific，美国新泽西州费尔劳恩
磷酸钠缓冲液Alfa AesarAlfa Aesar，加拿大安大略省渥太华
合成海水VWR RC8363-1RICCA 化学公司
合成单链DNA gBlockIDT美国艾德斯科技公司，爱荷华州科拉尔维尔
VacuCap 90 真空过滤装置 - 0.1 µm，90 毫米，γ-辐照帕尔4621Pall公司，密歇根州安娜堡
VacuCap 90 真空过滤装置 - 0.2 µm，90 毫米，γ-射线照射帕尔4622Pall公司，密歇根州安娜堡
β-巯基乙醇Gibco21985023Fisher Scientific，美国新泽西州费尔劳恩

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RNA RNA RT qPCR
利用脱脂牛奶絮凝与超滤法从环境水和废水样品中浓缩病毒颗粒
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