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低内毒素含量的癌细胞系来源细胞外囊泡的分离

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DOI：

10.3791/65062

⸱

2023年2月17日

 ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Jagiellonian University Medical College, 2Doctoral School of Medical and Health Sciences, Jagiellonian University, 3Institute of Veterinary Sciences, University Center of Veterinary Medicine JU-AU, University of Agriculture in Kraków

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案提供了在从细胞培养上清液中分离细胞外囊泡时如何避免内毒素污染以及如何对其进行正确评估的指导。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是一类由细胞在体外（in vitro）和体内（in vivo）释放的异质性膜性囊泡。由于其普遍存在并作为生物信息载体发挥重要作用，EVs 成为极具吸引力的研究对象，但其分离需要可靠且可重复的实验方案。然而，由于当前研究中仍存在诸多技术障碍（如获取方法不当），EVs 的全部潜力尚难以充分发挥。本研究提供了一种基于差速离心法从小鼠肿瘤细胞系培养上清中分离小细胞外囊泡（依据 MISEV 2018 命名规范）的实验方案。该方案包含在 EVs 分离过程中避免内毒素污染以及如何对其进行正确评估的操作指南。EVs 中的内毒素污染可能显著干扰后续实验，甚至掩盖其真实的生物学效应。另一方面，忽视内毒素的存在可能导致错误结论。这一点在涉及免疫系统细胞（包括单核细胞）的研究中尤为重要，因为单核细胞是特别敏感于内毒素残留的一类细胞群体。因此，强烈建议在使用单核细胞、巨噬细胞、髓源性抑制细胞或树突状细胞等对内毒素敏感的细胞时，对 EVs 进行内毒素污染筛查。

引言

根据MISEV 2018命名法，细胞外囊泡（EVs）是一个统称，用于描述多种由细胞分泌的膜性小泡，这些小泡在众多生理和病理过程中发挥着关键作用1,2。此外，EVs在多种疾病的新型生物标志物、治疗剂以及药物递送载体方面展现出巨大潜力。然而，由于在EVs获取过程中仍存在诸多技术障碍，其全部潜力的实现仍面临困难3。其中一个挑战是无内毒素EVs的分离，而这一问题在许多研究中常被忽视。最常见的内毒素之一是脂多糖（LPS），它是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，可因多种细胞释放大量炎症性细胞因子而引发急性炎症反应4,5。LPS通过与LPS结合蛋白结合，进而与髓系细胞表面的CD14/TLR4/MD2复合物相互作用，从而诱导细胞反应。该相互作用激活MyD88和TRIF依赖性信号通路，继而触发核因子κB（NFκB）。NFκB向细胞核的转位启动细胞因子的产生6。单核细胞和巨噬细胞对LPS高度敏感，暴露于LPS后会释放炎症性细胞因子和趋化因子（如IL-6、IL-12、CXCL8和TNF-α）7,8。CD14的结构使其能够以相似的亲和力结合不同类型的LPS，并作为其他Toll样受体（TLRs）（TLR1、2、3、4、6、7和9）的共受体6。目前关于EVs对单核细胞/巨噬细胞影响的研究数量仍在持续增加9,10,11。特别是从研究单核细胞功能、其亚群及其他免疫细胞的角度来看，EVs中内毒素的存在，甚至其隐蔽存在，具有重要意义12。EVs中被忽视的内毒素污染可能导致误导性结论，并掩盖其真实的生物学活性。换句话说，使用单核细胞进行实验时，必须确保无内毒素污染13。内毒素的潜在来源包括水、商业购得的培养基和血清、培养基组分和添加剂、实验室玻璃器皿以及塑料器皿5,14,15。

因此，本研究旨在建立一种分离低内毒素含量细胞外囊泡（EVs）的方案。该方案提供了在EVs分离过程中避免内毒素污染的简单操作建议，而非从已分离的EVs中去除内毒素。此前已有多种方案报道了如何去除纳米医学中使用的工程纳米颗粒等材料上的内毒素；然而，这些方法均不适用于EVs等生物结构。纳米颗粒的有效去热原可通过乙醇或乙酸冲洗、175 °C加热3小时、γ射线辐照或Triton X-100处理实现；然而，这些处理方法会导致EVs结构被破坏16,17。

本方案是一项开创性研究，旨在避免细胞外囊泡（EVs）中的内毒素杂质，这与以往关于EVs对单核细胞影响的研究不同9。 将所提出的原则应用于实验室实践，可能有助于获得可靠的研究结果，这在考虑将EVs作为临床治疗剂潜在应用时至关重要12。

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方案

1. 超速离心管的准备

  1. 使用无菌的一次性离心管。如果无法做到，则在使用去污剂清洗超速离心管后，用无菌的巴斯德吸管或其他一次性工具进行清洗。请注意，超速离心管应专用于一种类型的离心样品（如细胞培养上清液/血清/血浆）和一种物种（如人/小鼠等）。
  2. 用去污剂清洗后，用去离子、无脂多糖（LPS）的水冲洗超速离心管3次。
    注意：请勿使用低质量的水。
  3. 将超速离心管干燥后，加入70%乙醇充满管体。让乙醇在管内静置过夜以进行消毒。随后倒出乙醇，并再次将管子干燥。
  4. 将离心管及其管盖放入灭菌包装中并紧密封口。采用等离子或气体（环氧乙烷）灭菌方法18,19。将装有超速离心管的灭菌包装存放在干燥处，并在有效期内使用。
    ​注意：应每月监测用于细胞外囊泡（EVs）分离的磷酸盐缓冲液（PBS）和水中的LPS水平。监测应包括离心管本身（例如，通过检测在室温（RT）下于超速离心管中静置过夜的水样[洗涤对照]）。

2. 外泌体耗竭型低内毒素胎牛血清（EE-FBS）的制备

  1. 务必使用超低内毒素胎牛血清（可商业获取；参见材料表；<0.1 EU/mL）。
  2. 将一瓶超低内毒素胎牛血清置于水浴中，56 °C 孵育 30 分钟。此步骤用于灭活补体系统。
  3. 用移液器将灭活后的胎牛血清转移至超速离心管中，在 4 °C 条件下以 100,000 × g 离心 4 小时。将上清液收集至无菌的 50 mL 离心管中，每管液体体积不得超过 45 mL，以避免管盖污染及管壁环状区域润湿。
  4. 将按此方法制备的去内毒素胎牛血清（EE-FBS）于 -20 °C 保存。检测 EE-FBS 中的 LPS 浓度（步骤 6）。LPS 浓度应与超速离心前处于相同水平。

3. 细胞培养

  1. 本研究中，使用无菌技术，在含有 4.5 g/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和庆大霉素（50 µL/mL）并补充 10% EE-FBS 的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于 75 cm2 培养瓶中培养 SW480 和 SW620 细胞系。SW480 每瓶接种约 4.5 x 106 个细胞 ，SW620 每瓶接种 6.5 x 106 个细胞。
  2. 当细胞达到完全汇合状态（SW480 每瓶约 13.5 x 106 个细胞，SW620 每瓶约 20 x 106 个细胞）时，每周收集上清液两次（每瓶约 10 mL），并进行传代。确保细胞活力不低于 99%，且细胞在 37 °C、5% CO2 的环境中培养。
  3. 将细胞培养上清液收集至适当标记的 15 mL 离心管中。在室温下以 500 x g 离心 5 分钟，以去除细胞碎片。
  4. 小心收集上清液，避免吸入沉淀物，转移至标记好的离心管中，并在 4 °C 下以 3,200 x g 再次离心 12 分钟。
  5. 将第二次离心后的上清液收集至无菌、标记好的 50 mL 离心管中。避免润湿管壁边缘。确保上清液体积不超过 45 mL，且离心管保持垂直放置。
  6. 用无菌透明封口膜包裹管盖，并将上清液垂直存放于 -80 °C。
    ​注意：每月应对新鲜培养上清液（步骤 6）进行支原体（Mycoplasma spp.）和脂多糖（LPS）污染的检测。若上清液中内毒素水平超过 0.05 EU/mL，应核查污染可能发生的环节，并从头重新开始实验流程。若检测到细胞培养物被支原体（Mycoplasma spp.）污染，则应停止从此类上清液中分离细胞外囊泡（EVs）。

4. 从细胞培养上清液中分离EVs

  1. 准备 0.22 µm 注射器滤器和适当体积的注射器。准备两管培养上清液（90 mL）。
  2. 用上清液填充注射器，并将滤器连接到针头适配器上。将装有滤器的注射器置于 50 mL 离心管上方。推动活塞柄，收集约 90 mL 滤液。
  3. 将滤液（7 mL）移入超速离心管中（确保每管加入相同体积以保持平衡），在 4 °C 条件下以 100,000 × g 离心 2 小时。
    注意：细胞外囊泡（EVs）沉淀的效率取决于多种因素（例如转子类型、k 值、沉降路径长度、培养基黏度等），需优化这些参数以提高 EVs 的回收率20。
  4. 使用无菌巴斯德吸管弃去上清液。用长型带滤芯吸头收集剩余沉淀，并将其合并至两个超速离心管中。用过滤后的无内毒素 PBS 补充至 7 mL，以洗涤 EVs。
  5. 将用 PBS 重悬的沉淀在 4 °C 条件下以 100,000 × g 离心 2 小时。使用无菌巴斯德吸管完全去除上清液，向两管中各加入 200 µL 过滤后的无内毒素 PBS 以重悬 EVs。轻柔吹打 EVs 沉淀，充分收集所有 EVs。
  6. 将 EVs 悬液转移至无菌的 1.5 mL 离心管中（如可能，使用低蛋白吸附管）。保留 10 µL EVs 悬液用于制备纳米颗粒追踪分析（NTA）的稀释样品及其他用途（例如蛋白浓度测定）。
  7. 根据制造商说明书，用过滤后的 PBS 将 EVs 稀释 1:1,000 后进行 NTA 检测。用无菌透明封口膜包裹管盖固定 EVs 样品管，并将 EVs 储存于 -80 °C。

5. 通过蛋白质印迹法检测特异性标记物

  1. 测定样品中的蛋白质浓度（例如，通过 Bradford 法），并用上样缓冲液制备样品（20 µg）。通过将 5 µL 样品缓冲液（4x）与 2 µL 样品还原剂（10x）混合至总体积为 20 µL 来制备上样缓冲液。将样品在 70 °C 下孵育 10 分钟。
  2. 制备含 SDS 的聚丙烯酰胺凝胶（10%–14%），并将 20 µg 的 EVs 加入每个加样孔中。
  3. 使用电泳运行缓冲液（每升含 30 g Tris、144 g 甘氨酸、10% SDS）在 150 V 条件下电泳运行 45 分钟。
  4. 使用转移装置，以 Towbin 缓冲液（每 0.5 L 含 1.51 g Tris、7.2 g 甘氨酸、10% 甲醇）将蛋白质从凝胶半干转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，25 V 转印 1 小时。
  5. 将膜置于 TBST 缓冲液（每升含 1 mL Tween、100 mL Tris 缓冲盐水（TBS 10x））中，用含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 TBST 缓冲液封闭，于室温在摇床上孵育 1 小时。
  6. 在 1% BSA 中加入稀释后的抗体（1:1,000），即抗-CD91（克隆号 D8O1A）或抗-Alix1（克隆号 3A9），在摇床上 4 °C 孵育过夜。 回收抗体，并用 10 mL 1x TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。
  7. 根据膜上的一抗种类，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗（稀释比例：1:2,000），在摇床上室温孵育 1 小时。 回收抗体，并用 10 mL 1x TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。
  8. 将底物与鲁米诺按 1:1 比例混合，配制成 1 mL 溶液。将该溶液倒在膜上，立即将膜放入成像系统的检测室中，选择化学发光模式，在屏幕上观察蛋白条带。

6. 使用鲎试剂检测法（LAL）测定内毒素水平

  1. 根据制造商的建议，采用显色法鲎试剂（LAL）检测内毒素水平。简而言之，该方法基于内毒素与鲎变形细胞裂解物（limulus amebocyte lysate, LAL）之间的相互作用。该方法的检测限为 0.005 EU/mL。
    注意：尽管鲎试验（LAL assay）存在一定的局限性，目前仍是检测和定量科学或医学中所用各类溶液及其他产品中内毒素污染的标准方法8。本试剂盒的限制因素在于重组后的变形细胞裂解物溶液的稳定性，若在重组后立即于 -20 °C 冻存，仅可稳定保存 1 周。
  2. 使用外泌体（EVs）及其他样品的十倍稀释液，以及血清的五十倍稀释液。后续实验中仅使用低内毒素试剂，例如去内毒素胎牛血清（EE-FBS）、DMEM、PBS、RPMI（<0.005 EU/mL）以及无脂多糖（LPS-free）的培养上清液。

7. 检测EV样本中的原核生物16S rRNA基因

  1. 从EV样本中提取DNA。尽量保持试剂和提取环境的无菌状态。测定DNA的浓度和质量（例如，使用分光光度计）。
  2. 按照先前描述的方法进行聚合酶链式反应（PCR）21。制备含溴化乙锭或SYBR Green的1.5%琼脂糖凝胶，用于在紫外光（UV）下观察PCR产物。
  3. 使用TRIS-乙酸-EDTA缓冲液，在75 V电压下电泳45分钟，同时运行样品和分子量标记物。利用成像系统观察DNA条带。

8. 确定脂多糖在人单核细胞模型中刺激作用的有效浓度

  1. 在添加了L-谷氨酰胺、葡萄糖和2% EE-FBS的RPMI 1640培养基中制备浓度为2 × 106 个单核细胞/mL的单核细胞悬液。每孔加入50 µL该悬液至96孔组织培养板中22。
  2. 加入适量体积的LPS或培养基，使细胞悬液总体积为100 µL，并达到以下终浓度：0 pg/mL（对照）、10 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、1 ng/mL和100 ng/mL。每个LPS浓度设置三个重复孔。
  3. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养18小时，收集上清液。
  4. 以2,000 × g离心上清液5分钟，将上清液转移至新管中。按照制造商的操作说明，使用流式细胞仪结合细胞因子微球阵列（CBA）人细胞因子检测试剂盒检测所收集上清液中TNF8,23和IL-1023的浓度。

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结果

本方案的前提条件或必要步骤是排除试剂中可能存在的内毒素污染。所有使用的试剂，如FBS、DMEM、RPMI、PBS，甚至超速离心管，都必须为无内毒素（<0.005 EU/mL）。保持无内毒素污染的条件并不容易，例如，常规/标准细胞培养血清就可能是内毒素的丰富来源（0.364 EU/mL；见表1）。

尽管本实验方案旨在分离低内毒素含量的细胞外囊泡（EVs），但仍需对分离得到的EVs进行表征。在本研究中，EVs来源于两种结直肠癌细胞系SW480和SW620。通过蛋白质印迹法（western blot）确认了EVs标志物CD9和Alix的表达（图1A）。从SW480和SW620细胞中分离的EVs平均粒径无显著差异（分别为134 nm和128.2 nm；图1B）。此外，这两种细胞系所获得的EVs浓度也无显著差异（图1C）。纳米颗粒跟踪分析（NTA）测得的EVs粒径分布示例见于...

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讨论

近年来，外泌体（EVs）的正确分离方法变得日益重要，这些方法能够实现对其进一步的可靠分析，例如在获取可靠的组学和功能数据方面24。根据以往的研究经验，不仅分离方法的类型可能至关重要，该过程中其他条件也可能具有重要影响。使用去除外泌体的胎牛血清（EV-depleted FBS）已被广泛认为是必需的25,26；然而，对外泌体中内毒素污染的监测却常常被忽视。

然而，所有用于分离EVs的方法都应在操作的每个阶段建立严格的无菌操作和质量控制标准。这一点尤为重要，因为EVs将用于后续实验。本方案是基于以往使用对内毒素敏感细胞（如单核细胞和巨噬细胞）的经验而制定的，这些细胞对内毒素高度敏感。单核细胞标志物CD14能够在皮摩尔浓度下结合LPS。已有研究结果表明，单核细胞在受到50 pg/mL（0.5 EU/mL）LPS刺激后，会分泌TNF和IL-10。然而，Yang等人报道，即使0.1 EU/mL（10 pg/mL）的内毒素也可能引发...

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披露

作者声明，本研究是在不存在任何可能被视作潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

本研究工作得到了波兰国家科学中心（项目编号：2019/33/B/NZ5/00647）的资助。我们衷心感谢雅盖隆大学医学院分子医学微生物学系的 Tomasz Gosiewski 教授和 Agnieszka Krawczyk 在细胞外囊泡中细菌 DNA 检测方面提供的宝贵帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
 Alix (3A9) 小鼠单克隆抗体 Cell Signaling Technology2171
1250 µL 滤芯通用移液器吸头，透明，聚丙烯，无热原GoogLab ScientificGBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II 流式细胞仪BD Biosciences
CBA 人 Th1/Th2 细胞因子检测试剂盒 IIBD Biosciences551809
CD9 (D8O1A) 兔单克隆抗体Cell Signaling Technology13174
ChemiDoc 成像系统Bio-Rad Laboratories, Inc. 17001401
DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）’’ Corning10-013-CV
ELX800NB 通用微孔板读板仪BIO-TEK INSTRUMENTS, INC
胎牛血清Gibco16000044
南美来源超低内毒素胎牛血清 Biowest S1860-500
庆大霉素，50 mg/mL PAN – BiotechP06-13100
山羊抗小鼠 IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2004
山羊抗兔 IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2005
Immun-Blot PVDF 膜Bio-Rad Laboratories, Inc. 1620177
来自 Salmonella abortus equi S 型的 LPS（TLRGRADE） Enzo Life Sciences, Inc.ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot 电泳转印槽Bio-Rad Laboratories, Inc. 1703930
纳米颗粒追踪分析 Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4X) Invitrogen NP0007
NuPAGE 样品还原剂 (10X) InvitrogenNP0004
ParafilmSigma AldrichP7793透明封膜
Perfect 100-1000 bp DNA MarkerEURxE3141-01 
PierceTM 显色法内毒素定量试剂盒Thermo ScientificA39552
带密封盖的 PP 橡树岭管Thermo Scientific3929, 03613
RPMI 1640RPMI-1640 (Gibco)11875093
SimpliAmp 热循环仪Applied BiosystemA24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES 离心机，配备 T-1270 转子Thermo Scientific75000100
Sub-Cell GT 水平电泳系统Bio-Rad Laboratories, Inc. 1704401
SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物Thermo Scientific34577
SW480 细胞系美国模式培养物集存库 (ATCC)
SW480 细胞系美国模式培养物集存库 (ATCC)
0.22 µm 注射器滤器TPP99722
Trans-Blot SD 半干式转印仪Bio-Rad Laboratories, Inc. 1703940转印仪
移液管，3.5 mLSARSTEDT86.1171.001

参考文献

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