低内毒素含量的癌细胞系来源细胞外囊泡的分离

摘要

本方案提供了在从细胞培养上清液中分离细胞外囊泡时如何避免内毒素污染以及如何对其进行正确评估的指导。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是一类由细胞在体外（in vitro）和体内（in vivo）释放的异质性膜性囊泡。由于其普遍存在并作为生物信息载体发挥重要作用，EVs 成为极具吸引力的研究对象，但其分离需要可靠且可重复的实验方案。然而，由于当前研究中仍存在诸多技术障碍（如获取方法不当），EVs 的全部潜力尚难以充分发挥。本研究提供了一种基于差速离心法从小鼠肿瘤细胞系培养上清中分离小细胞外囊泡（依据 MISEV 2018 命名规范）的实验方案。该方案包含在 EVs 分离过程中避免内毒素污染以及如何对其进行正确评估的操作指南。EVs 中的内毒素污染可能显著干扰后续实验，甚至掩盖其真实的生物学效应。另一方面，忽视内毒素的存在可能导致错误结论。这一点在涉及免疫系统细胞（包括单核细胞）的研究中尤为重要，因为单核细胞是特别敏感于内毒素残留的一类细胞群体。因此，强烈建议在使用单核细胞、巨噬细胞、髓源性抑制细胞或树突状细胞等对内毒素敏感的细胞时，对 EVs 进行内毒素污染筛查。

引言

根据MISEV 2018命名法，细胞外囊泡（EVs）是一个统称，用于描述多种由细胞分泌的膜性小泡，这些小泡在众多生理和病理过程中发挥着关键作用^1,2。此外，EVs在多种疾病的新型生物标志物、治疗剂以及药物递送载体方面展现出巨大潜力。然而，由于在EVs获取过程中仍存在诸多技术障碍，其全部潜力的实现仍面临困难³。其中一个挑战是无内毒素EVs的分离，而这一问题在许多研究中常被忽视。最常见的内毒素之一是脂多糖（LPS），它是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，可因多种细胞释放大量炎症性细胞因子而引发急性炎症反应^4,5。LPS通过与LPS结合蛋白结合，进而与髓系细胞表面的CD14/TLR4/MD2复合物相互作用，从而诱导细胞反应。该相互作用激活MyD88和TRIF依赖性信号通路，继而触发核因子κB（NFκB）。NFκB向细胞核的转位启动细胞因子的产生⁶。单核细胞和巨噬细胞对LPS高度敏感，暴露于LPS后会释放炎症性细胞因子和趋化因子（如IL-6、IL-12、CXCL8和TNF-α）^7,8。CD14的结构使....

方案

1. 超速离心管的准备

1. 使用无菌的一次性离心管。如果无法做到，则在使用去污剂清洗超速离心管后，用无菌的巴斯德吸管或其他一次性工具进行清洗。请注意，超速离心管应专用于一种类型的离心样品（如细胞培养上清液/血清/血浆）和一种物种（如人/小鼠等）。
2. 用去污剂清洗后，用去离子、无脂多糖（LPS）的水冲洗超速离心管3次。
   注意：请勿使用低质量的水。
3. 将超速离心管干燥后，加入70%乙醇充满管体。让乙醇在管内静置过夜以进行消毒。随后倒出乙醇，并再次将管子干燥。
4. 将离心管及其管盖放入灭菌包装中并紧密封口。采用等离子或气体（环氧乙烷）灭菌方法^18,19。将装有超速离心管的灭菌包装存放在干燥处，并在有效期内使用。
   ​注意：应每月监测用于细胞外囊泡（EVs）分离的磷酸盐缓冲液（PBS）和水中的LPS水平。监测应包括离心管本身（例如，通过检测在室温（RT）下于超速离心管中静置过夜的水样[洗涤对照]）。

2. 外泌体耗竭型低内毒素胎牛血清（EE-FBS）的制备

1. 务必使用超低内毒素胎牛血清（可商业获取；参见材料表；<0.....

结果

本方案的前提条件或必要步骤是排除试剂中可能存在的内毒素污染。所有使用的试剂，如FBS、DMEM、RPMI、PBS，甚至超速离心管，都必须为无内毒素（<0.005 EU/mL）。保持无内毒素污染的条件并不容易，例如，常规/标准细胞培养血清就可能是内毒素的丰富来源（0.364 EU/mL；见表1）。

尽管本实验方案旨在分离低内毒素含量的细胞外囊泡（EVs），但仍需对分离得到的EVs进行表征。在本研究中，EVs来源于两种结直肠癌细胞系SW480和SW620。通过蛋白质印迹法（western blot）确认了EVs标志物CD9和Alix的表达（图1A）。从SW480和SW620细胞中分离的EVs平均粒径无显著差异（分别为134 nm和128.2 nm；图1B）。此外，这两种细胞系所获得的EVs浓度也无显著差异（图1C）。纳米颗粒跟踪分析（NTA）测得的EVs粒径分布示例见于.......

讨论

近年来，外泌体（EVs）的正确分离方法变得日益重要，这些方法能够实现对其进一步的可靠分析，例如在获取可靠的组学和功能数据方面²⁴。根据以往的研究经验，不仅分离方法的类型可能至关重要，该过程中其他条件也可能具有重要影响。使用去除外泌体的胎牛血清（EV-depleted FBS）已被广泛认为是必需的^25,26；然而，对外泌体中内毒素污染的监测却常常被忽视。

然而，所有用于分离EVs的方法都应在操作的每个阶段建立严格的无菌操作和质量控制标准。这一点尤为重要，因为EVs将用于后续实验。本方案是基于以往使用对内毒素敏感细胞（如单核细胞和巨噬细胞）的经验而制定的，这些细胞对内毒素高度敏感。单核细胞标志物CD14能够在皮摩尔浓度下结合LPS。已有研究结果表明，单核细胞在受到50 pg/mL（0.5 EU/mL）LPS刺激后，会分泌TNF和IL-10。然而，Yang等人报道，即使0.1 EU/mL（10 pg/mL）的内毒素也可能引发.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alix (3A9) 小鼠单克隆抗体	Cell Signaling Technology	2171
1250 µL 滤芯通用移液器吸头，透明，聚丙烯，无热原	GoogLab Scientific	GBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II 流式细胞仪	BD Biosciences
CBA 人 Th1/Th2 细胞因子检测试剂盒 II	BD Biosciences	551809
CD9 (D8O1A) 兔单克隆抗体	Cell Signaling Technology	13174
ChemiDoc 成像系统	Bio-Rad Laboratories, Inc.	17001401
DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）’’	Corning	10-013-CV
ELX800NB 通用微孔板读板仪	BIO-TEK INSTRUMENTS, INC
胎牛血清	Gibco	16000044
南美来源超低内毒素胎牛血清	Biowest	S1860-500
庆大霉素，50 mg/mL	PAN – Biotech	P06-13100
山羊抗小鼠 IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
山羊抗兔 IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005
Immun-Blot PVDF 膜	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1620177
来自 Salmonella abortus equi S 型的 LPS（TLRGRADE）	Enzo Life Sciences, Inc.	ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot 电泳转印槽	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1703930
纳米颗粒追踪分析	Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4X)	Invitrogen	NP0007
NuPAGE 样品还原剂 (10X)	Invitrogen	NP0004
Parafilm	Sigma Aldrich	P7793	透明封膜
Perfect 100-1000 bp DNA Marker	EURx	E3141-01
PierceTM 显色法内毒素定量试剂盒	Thermo Scientific	A39552
带密封盖的 PP 橡树岭管	Thermo Scientific	3929, 03613
RPMI 1640	RPMI-1640 (Gibco)	11875093
SimpliAmp 热循环仪	Applied Biosystem	A24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES 离心机，配备 T-1270 转子	Thermo Scientific	75000100
Sub-Cell GT 水平电泳系统	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1704401
SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物	Thermo Scientific	34577
SW480 细胞系	美国模式培养物集存库 (ATCC)
SW480 细胞系	美国模式培养物集存库 (ATCC)
0.22 µm 注射器滤器	TPP	99722
Trans-Blot SD 半干式转印仪	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1703940	转印仪
移液管，3.5 mL	SARSTEDT	86.1171.001