方法文章

分离来自癌细胞系的低内毒素含量细胞外囊泡

DOI：

10.3791/65062

⸱

2023年2月17日

 ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Jagiellonian University Medical College, 2Doctoral School of Medical and Health Sciences, Jagiellonian University, 3Institute of Veterinary Sciences, University Center of Veterinary Medicine JU-AU, University of Agriculture in Kraków

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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拟议的方案包括有关如何在从细胞培养上清液中分离细胞外囊泡以及如何正确评估它们期间避免内毒素污染的指南。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞外囊泡（EV）是细胞在 体外 和 体内释放的膜囊泡的异质群。它们作为生物信息载体的无所不在和重要作用使它们成为有趣的研究对象，需要可靠和重复的方案来分离它们。然而，充分发挥他们的潜力是困难的，因为他们的研究仍然存在许多技术障碍（如适当的收购）。本研究提出了一种基于差异离心从肿瘤细胞系培养上清液中分离小型 EV（根据 MISEV 2018 命名法）的方案。该协议包括有关如何在分离电动汽车期间避免内毒素污染以及如何正确评估它们的指南。电动汽车的内毒素污染会严重阻碍后续实验，甚至掩盖其真正的生物效应。另一方面，被忽视的内毒素的存在可能会导致错误的结论。当提到免疫系统细胞（包括单核细胞）时，这一点尤其重要，因为单核细胞构成了对内毒素残基特别敏感的群体。因此，强烈建议筛查 EV 的内毒素污染，尤其是在处理内毒素敏感细胞（如单核细胞、巨噬细胞、髓源性抑制细胞或树突状细胞）时。

引言

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根据MISEV 2018命名法，细胞外囊泡（EV）是一个统称，描述了细胞分泌的膜囊泡的各种亚型，这些囊泡在许多生理和病理过程中起着至关重要的作用1，2。此外，电动汽车有望成为各种疾病的新型生物标志物，以及治疗剂和药物输送载体。然而，充分发挥其潜力是困难的，因为与获取它们相关的技术障碍仍然存在许多3.其中一个挑战是分离无内毒素的电动汽车，这在许多情况下被忽视了。最常见的内毒素之一是脂多糖（LPS），它是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，由于各种细胞释放大量炎性细胞因子，可引起急性炎症反应4，5。LPS通过与LPS结合蛋白结合诱导反应，然后与骨髓细胞上的CD14 / TLR4 / MD2复合物相互作用。这种相互作用导致MyD88和TRIF依赖性信号通路的激活，进而触发核因子κB（NFkB）。NFkB易位到细胞核启动细胞因子的产生6。单核细胞和巨噬细胞对 LPS 高度敏感，暴露于 LPS 会导致炎症细胞因子和趋化因子（例如 IL-6、IL-12、CXCL8 和 TNF-α）的释放7，8。CD14结....

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方案

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1. 超速离心管的制备

  1. 使用无菌一次性试管。如果无法做到这一点，请在使用无菌巴斯德移液管或其他一次性涂抹器用洗涤剂清洗后重复使用超速离心管。请记住，超速离心管应专用于一种类型的离心材料（细胞培养上清液/血清/血浆）和物种（人/小鼠/等）。
  2. 洗涤剂洗涤后，用去离子的无LPS水冲洗超速离心管3次。
    注意:请勿使用劣质水。
  3. 干燥超速离心管，然后用70%乙醇填充它们。将试管与70%乙醇一起放置过夜消毒。取出乙醇并再次干燥试管。
  4. 将管子和盖子放入灭菌包装中并紧紧关闭。采用等离子体或气体（环氧乙烷）灭菌的方法18、19。将灭菌包装中封闭的超速离心管存放在干燥处，并在有效期前使用。
    注意:每月监测磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的LPS水平和用于EV分离的水。监测还应包括试管（例如，通过测试在室温 [RT] 下储存在超速离心管中过夜的水 [洗涤对照]）。

2. EV耗竭低内毒素胎牛血清（EE-FBS）的制备

  1. 确保使用超低内毒素FBS（市售;见 材料表;<0.1 EU/mL）。
  2. 将一瓶超低内毒素FBS放入水浴中，并在56°C下孵育30分钟。....

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结果

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该方案的先决条件或强制性步骤是从试剂中排除可能的内毒素污染。所有使用的试剂，如FBS、DMEM、RPMI、PBS，甚至超速离心管，都必须不含内毒素（<0.005 EU/mL）。维持无内毒素污染并不容易，因为例如，用于细胞培养的常规/标准血清可能是其丰富的来源（0.364 EU/mL;见 表1）。

尽管该协议旨在分离内毒素含量低的EV，但表征分离的EV非常重要。在这项研究中，从两种结直肠癌细胞系SW480和SW620中分离出EV。EVs标志物CD9和Alix的表达通过蛋白质印迹证实（图1A）。从SW480和SW620电池（分别为134 nm和128.2 nm;图 1B）。此外，这些细胞系之间分离的EV浓度没有差异（图1C）。通过NTA测量的EV尺寸的示例分布如图1D所示。根据Cvjetkovic等人的结果优化.......

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讨论

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在过去几年中，正确分离电动汽车的方法变得越来越重要，使其能够进一步进行可靠的分析，例如，在获得可靠的组学和功能数据的背景下24。根据以前的研究经验，似乎不仅隔离方法的类型，而且该过程期间的其他条件都可能很重要。使用耗尽电动汽车的FBS被广泛认为是必需品25，26;然而，对电动汽车内毒素污染的监测往往被忽视。

尽管如此，所有用于分离电动汽车的方法都应该在程序的每个阶段制定严格的无菌处理和质量控制标准。由于电动汽车的进一步下游应用，这一点尤其重要。所提出的方案是以前对内毒素敏感细胞（例如单核细胞和巨噬细胞）的经验的结果，这些细胞对内毒素敏感。CD14是单核细胞的标志物，能够以皮摩尔浓度结合LPS。获得的结果表明，单核细胞在用50 pg/mL（0.5 EU/mL）LPS刺激后分泌TNF和IL-10。然而，Yang等人报告说，即使是0.1 EU/mL（10 pg/mL）的内毒素也可能诱发强效反应（炎症 性IL1B

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披露

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作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可以构建为潜在的利益冲突。

致谢

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这项工作得到了波兰国家科学中心的支持，批准号为2019/33/B/NZ5/00647。我们要感谢雅盖隆大学医学院分子医学微生物学系的Tomasz Gosiewski教授和Agnieszka Krawczyk教授在检测电动汽车中细菌DNA方面的宝贵帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
 Alix （3A9） 小鼠单克隆抗体 Cell Signaling Technology2171
1250ul 带滤芯通用移液器吸头，透明，聚丙烯，无热原GoogLab ScientificGBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II 流式细胞仪BD Biosciences
CBA 人 Th1/Th2 细胞因子试剂盒 IIBD Biosciences551809
CD9 （D8O1A） 兔单克隆抗体Cell Signaling Technology13174
ChemiDoc 成像系统Bio-Rad Laboratories， Inc. 
DMEM （Dulbecco's 改良鹰's 培养基） 康宁10-013-CV
ELX800NB，通用微孔板检测仪BIO-TEK INSTRUMENTS， INC
胎牛血清Gibco16000044
胎牛血清南美洲超低内毒素 生物西部 S1860-500
庆大霉素，50 毫克/毫升 泛 –生物技术P06-13100
山羊抗小鼠 IgG- HRP圣克鲁斯生物技术sc-2004
山羊抗兔 IgG- HRP圣克鲁斯生物技术sc-2005
免疫印迹 PVDF 膜Bio-Rad Laboratories， Inc. 
来自马流产沙门氏菌 S 型 （TLRGRADE） 的 1620177 LPS 恩佐生命科学公司ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot 电泳转移槽Bio-Rad Laboratories， Inc. 
纳米粒子跟踪分析 Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS 样品缓冲液 （4X） Invitrogen NP0007
NuPAGE 样品还原剂 （10x） InvitrogenNP0004
封口膜Sigma AldrichP7793透明膜
完美 100-1000 bp DNA 分子量标准EURxE3141-01 
PierceTM 显色内毒素定量试剂盒Thermo ScientificA39552
PP 带密封盖的 Oak Ridge 管Thermo Scientific3929、03613
RPMI 1640RPMI-1640 （Gibco）11875093
SimpliAmp 热循环仪Applied BiosystemA24811
Sorvall wX+ ULTRA 系列离心机，带 T-1270 转头Thermo Scientific75000100
Sub-Cell GT 水平电泳系统Bio-Rad Laboratories， Inc. 
SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物Thermo Scientific34577
SW480 细胞系美国典型培养物保藏中心 （ATCC）
SW480 细胞系美国典型培养物保藏中心 （ATCC）
针式过滤器 0.22 umTPP99722
反式印迹 SD 半干式转移槽Bio-Rad Laboratories， Inc. 1703940移
液管 移液管，3.5 mLSARSTEDT86.1171.001
1700140117039301704401

参考文献

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  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Yáñez-Mó, M., et al.

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CD9 Alix

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