从小鼠胎儿骨骼肌制备用于细胞培养的三维脱细胞基质

摘要

本研究优化了一种脱细胞化方案，以获得胎鼠骨骼肌的脱细胞基质。C2C12成肌细胞能够定植于这些基质中，并进行增殖和分化。 体外 该模型可用于研究骨骼肌疾病（如肌营养不良症）背景下的细胞行为。

摘要

细胞外基质（ECM）在为细胞提供结构支持以及传递调控多种细胞过程的信号方面发挥着关键作用。二维（2D）细胞培养模型过度简化了细胞与细胞外基质之间的复杂相互作用，由于缺乏完整的三维（3D）支持环境，细胞行为可能发生改变，因而难以准确反映体内（in vivo）的生理过程。细胞外基质成分异常以及细胞与细胞外基质相互作用的缺陷，是多种不同疾病发生发展的重要因素。

一个例子是LAMA2-先天性肌营养不良症（LAMA2-CMD），由于功能性层粘连蛋白211和221的缺失或减少，可导致严重的肌张力低下，通常在出生时或出生后不久即可检测到。先前利用该疾病小鼠模型的研究表明，其发病始于胎儿期肌发生过程。本研究旨在开发一种三维 体外 一种可用于研究肌细胞与胎儿肌肉细胞外基质（ECM）相互作用的模型，可模拟天然微环境。该方案采用从E18.5小鼠胎儿分离的背部深层肌肉，依次经低渗缓冲液、阴离子去污剂和DNase处理。所得脱细胞基质（dECMs）与天然组织相比，保留了所有检测的ECM蛋白（包括层粘连蛋白α2、总层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白I和胶原蛋白IV）。

当C2C12成肌细胞接种于这些脱细胞细胞外基质（dECMs）表面时，细胞能够侵入并定植于dECMs中，后者支持其增殖与分化。此外，C2C12细胞分泌细胞外基质蛋白，参与其在dECMs内微环境的重塑。该体系的建立 体外 该平台为揭示LAMA2-CMD发病机制提供了新的有前景的方法，并有望拓展应用于其他由细胞外基质与骨骼肌细胞间通讯障碍导致疾病进展的骨骼肌疾病。

引言

细胞外基质（ECM）是组织的主要组成成分，代表其非细胞部分。这种三维（3D）结构不仅为细胞提供物理支持，还在生物体发育过程中参与多种生化过程，发挥关键作用¹。组织特异性ECM的形成发生在发育过程中，是细胞与其微环境之间复杂相互作用的结果，并受到多种细胞内和细胞外刺激的影响。ECM是一种高度动态的结构，会以时空特异性的方式发生化学和机械性重组，并直接影响细胞命运²。ECM最显著的特征之一是其功能多样性，每种组织的ECM都含有独特的分子组合，形成特定的拓扑结构和特性，以适应其所包含的细胞的需求¹。

细胞外基质（ECM）信号传导和支持对于发育和稳态至关重要，一旦受到破坏，可导致多种病理状态^3,4。其中一个例子是LAMA2缺乏性先天性肌营养不良症（LAMA2-CMD），这是最常见的先天性肌营养不良类型。LAMA2基因编码层粘连蛋白α2链，该蛋白存在于层粘连蛋白211和层粘连蛋白221中，当发生突变时可导致LAMA2-CMD⁵。层粘连蛋白211是存在于骨骼肌纤维周围基底膜中的主要异构体。当层粘连蛋白211异常或缺失时，基底膜与肌细胞之间的连接被破坏，从而引发疾病⁶。LAMA2-CMD患者的表型轻重不一，具体取决于LAMA2基因突变的类型。

当层粘连蛋白α2蛋白功能受到影响时，患者在出生时可能出现严重的肌张力低下，并逐渐发展为慢性炎症、纤维化和肌肉萎缩，导致预期寿命缩短。迄今为止，尚无针对性的治疗方法，治疗手段仅限于缓解疾病的症状。⁷因此，阐明该疾病发生过程中涉及的分子机制对于制定适当的治疗策略至关重要^6,8. 之前使用 dy^W 小鼠⁹，LAMA2-CMD 的模型表明，该疾病的发病始于 在子宫内，特别是在胎儿肌生成期间¹⁰更好地理解胎儿肌生成缺陷的发生机制将为LAMA2-CMD的新型治疗策略开发带来重大突破。

体外系统为研究细胞间以及细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用提供了可控的环境，但二维（2D）培养模型缺乏天然组织的复杂性。组织脱细胞化可产生具有组织特异性和发育阶段特异性的无细胞ECM支架，与2D模型及人工/合成支架相比，能更准确地模拟天然的细胞微环境。脱细胞基质（dECMs）有望保留宿主组织的分子和力学信号，因此是研究体内过程的更优替代模型¹¹。

脱细胞化可采用多种技术、试剂和条件^12,13。本研究借鉴了Silva等人^14,15描述的小鼠胎儿心脏脱细胞化方案，并将其应用于小鼠胎儿骨骼肌，结果发现该方案可保留所有检测的细胞外基质成分（层粘连蛋白α2、总层粘连蛋白、纤连蛋白、I型胶原和IV型胶原）。该方案包括三个步骤：通过渗透冲击（低渗缓冲液）裂解细胞、溶解质膜并解离蛋白质（0.05%十二烷基硫酸钠[SDS]）、以及酶解破坏DNA（DNase处理）。据我们所知，这是首个成功建立的小鼠胎儿骨骼肌脱细胞化方案。

要使用此3D 体外 用于研究LAMA2-CMD的系统中，脱细胞后维持层粘连蛋白α2链至关重要。因此，本研究实施了一项优化方案，测试了不同去垢剂（SDS和Triton X-100）及不同浓度（0.02%、0.05%、0.1%、0.2%和0.5%）（数据未显示）。结果表明，0.05% SDS在去除细胞的同时最有利于层粘连蛋白α2的保留。C2C12细胞是一种广泛使用的成肌细胞系^16,17用于接种脱细胞细胞外基质（dECM）。这些细胞可侵入dECM，在支架内部增殖并分化，合成新的细胞外基质（ECM）蛋白。该三维结构的成功构建 体外 该模型为理解胎儿肌生成过程中涉及的分子与细胞机制以及LAMA2-CMD的发病机制提供了新方法，并可推广至其他因细胞外基质与骨骼肌细胞间通讯受损而导致的肌肉疾病。

方案

所述所有方法均经里斯本大学理学院动物福利委员会（ORBEA）和葡萄牙兽医总局（DGAV；编号 0421/000/000/2022）批准，并符合欧盟指令 2010/63/EU 的规定。

1. 脱细胞缓冲液与试剂的制备

注意：脱细胞化方案中使用的所有溶液均应通过高压灭菌法进行灭菌，并可储存长达 3 个月，除非另有说明。

1. 通过向去离子水（dH₂O）中加入终浓度为 137 mM 的氯化钠（NaCl）、2.68 mM 的氯化钾（KCl）、8.1 mM 的磷酸二氢钾（KH₂PO₄）和 1.47 mM 的二水合磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）来配制 10 倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS），调节 pH 至 6.8。取 100 mL 10x PBS 加入 900 mL 去离子 H₂O 中，配制成 1x PBS。经高压灭菌后室温（RT）保存。使用前加入无菌青霉素/链霉素储备液（青霉素 10,000 U/mL，链霉素 10 mg/mL [pen/strep]），使其终浓度为 1%。
2. 通过将 1.21 g 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris 碱）和 1 g 乙二胺四乙酸（EDTA）溶于 1 L 去离子水（dH₂O）中配制低渗缓冲液（10 mM Tris 碱，0.1% EDTA）。使用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，并用 NaOH/HCl 调节 pH 至 7.8。经高压灭菌后室温保存。使用前加入青霉素/链霉素至终浓度 1%。
3. 通过将 1.21 g Tris 碱溶于 1 L 去离子水（dH₂O）中配制低渗洗涤缓冲液（10 mM Tris 碱）。使用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，并用 NaOH/HCl 调节 pH 至 7.8。经高压灭菌后室温保存。使用前加入青霉素/链霉素至终浓度 1%。
4. 通过将 0.05 g 十二烷基硫酸钠（SDS）加入 100 mL 低渗洗涤缓冲液中，配制阴离子去垢剂处理液（0.05% SDS 溶液）。使用 0.22 µm 微孔滤膜过滤。室温保存，有效期最长 1 个月。
   注意：SDS 溶液不应进行高压灭菌，因为 SDS 在高压灭菌过程中会发生沉淀和降解。
5. 通过将 1.21 g Tris 碱溶于 0.5 mL 去离子水（dH₂O）中，并加入 1 mL 1 M 氯化镁（MgCl₂）来配制 DNase 处理液。用 NaOH/HCl 调节 pH 至 7.8。经高压灭菌后室温保存。使用前加入 DNase I 至终浓度 50 U/mL。

2. 样品采集

注意：本研究使用了野生型 C57/BL6 小鼠。所有技术操作均在层流罩内的无菌条件下进行。

1. 在妊娠第18.5天（E18.5），使用异氟烷吸入法对成年妊娠雌性小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。对小鼠进行终末解剖以取出胚胎。
   1. 用70%乙醇喷洒小鼠腹部。
   2. 使用手术镊和剪刀提起下腹部的一层皮肤褶皱，做U形切口以暴露腹腔¹⁸。
   3. 通过切断输卵管和宫颈，采集含有E18.5胚胎的子宫角，并立即转移至含有冰浴1×PBS（含1%青霉素-链霉素）的培养皿中¹⁸。
   4. 迅速将胚胎从子宫及胚外组织中取出，并用剪刀进行断头法安乐死¹⁸。
2. 将每个胚胎依次转移至含有冰浴1×PBS的培养皿中。在体视显微镜下，去除皮肤并剪除四肢。从腹侧切开肋骨 cage，移除胸骨及下方器官。
3. 将胚胎躯干翻转为背侧朝上。去除脊柱的颈部部分、背部脂肪沉积物以及深层背部肌肉上方的结缔组织。
4. 使用手术镊固定肋骨 cage，用显微手术刀小心刮除并分离深层背部肌肉与其周围组织¹⁰。该操作可从每个胚胎中分离出两块肌肉组织（左侧和右侧），主要由longissimus和iliocostalis肌肉组成，同时包含部分transversospinalis和levator costarum肌肉。
5. 将肌肉样本短期储存（<1周）于含1%青霉素-链霉素的1×PBS中，4 °C保存；长期储存则置于-80 °C。
   ​注意：建议使用新鲜采集的样本以获得最佳效果。长期冷冻保存的样本（>3个月）脱细胞效率较低，且蛋白质降解更明显。本实验采用背侧肌群进行脱细胞处理，但其他肌肉（如四肢肌肉）也可采用相同方案进行脱细胞处理。

3. 胎儿骨骼肌脱细胞

注意：所有操作均在层流罩内无菌条件下进行。详细示意图参见图1A。除非另有说明，所有步骤均在直径为120 mm的轨道摇床（165 rpm）中振荡进行，温度为25 °C。使用前向溶液中添加1%青霉素-链霉素（pen/strep）。移除溶液时应小心吸取，避免样品被截留在移液管中。

1. 第1天 - 从轴上肌组织中制备约2 mm × 1 mm × 1 mm（约3.5 mg）的组织碎片。向12孔板的每孔中加入3 mL含1%青霉素/链霉素的低渗缓冲液，并向每孔加入一个完整的肌肉组织碎片。
   1. 将组织碎片在低渗缓冲液中振荡孵育18小时（过夜）（O/N）。
2. 第2天 - 使用细尖移液器吸除低渗缓冲液，每次用3 mL 1×PBS振荡洗涤样品，每次1小时，共洗涤3次。
   1. 将样品在3 mL含0.05% SDS的洗涤剂溶液中振荡孵育24小时。
      注意：（检查点）SDS孵育后，样品应呈现透明状。样品具有类似明胶的一致性，因此在移除液体时更容易粘附于移液器尖端。
3. 第3天 - 使用细尖移液器移除SDS洗涤剂溶液，每次用3 mL低渗洗涤缓冲液振荡洗涤组织碎片，每次20分钟，共洗涤3次。
   注意：（暂停点）样品可在4 °C的低渗洗涤缓冲液中保存18小时（过夜）。确保在洗涤步骤中充分去除SDS，因为残留的SDS具有细胞毒性。
   1. 将组织碎片在2 mL DNase溶液中于37 °C振荡孵育3小时。
   2. 使用细尖移液器移除DNase溶液，每次用3 mL 1×PBS振荡洗涤组织碎片20分钟，共洗涤3次。最后，在1×PBS中振荡过夜洗涤（60 rpm）。
      注意：DNase处理后，由于存在DNA残留，脱细胞细胞外基质（dECMs）会变得粘稠，因此需要仔细洗涤。
   3. 将dECMs保存在含1%青霉素/链霉素的1×PBS中，置于4 °C，直至重新接种细胞（<1周）。如需长期保存，应置于-80 °C。

4. 脱细胞质量评估

注意：通过DNA定量、DAPI/甲基绿染色和鬼笔环肽染色来评估脱细胞后残留细胞成分的存在情况。通过免疫组织化学和蛋白质印迹分析评估脱细胞后关键细胞外基质蛋白的保留情况。

1. 测定 dECM 中的 DNA 含量
   注意：应将 dECM 与天然组织进行比较，以检测 DNA 的存在。
   1. 脱细胞前，使用高精度电子天平称量一个 1.5 mL 微量离心管的重量。在将肌肉样本转移至该管之前，用纸巾彻底去除所有残留的 1× PBS。称量装有样本的管子重量。使用公式（1）计算样本的湿重：
      ​样本_湿重 = 重量_含样本管 - 重量_空管      （1）
   2. 按照第 3 节所述方案对样本进行脱细胞处理。
   3. 将样本放入 2 mL 微量离心管中。
      注意：样本可在 -20 °C 下保存，直至进行 DNA 提取和定量。
   4. 使用基于离心柱的试剂盒对 dECM 和天然组织样本进行 DNA 提取。根据制造商说明书加入消化缓冲液。
   5. 在珠磨机中，每次 2.5 分钟，共两次（翻转固定座），使用每管一个碳化钨珠对样本进行均质化处理（使用预冷的管座）。
   6. 加入蛋白酶 K，并在 56 °C 下缓慢振荡孵育过夜（O/N）。
   7. 按照制造商说明书继续操作。
   8. 使用制造商提供的洗脱缓冲液进行洗脱，并在 4 °C 下以 ≥6,000 × g 离心 2 次，每次 1 分钟，以提高 DNA 产率。
      注意：DNA 可在 -20 °C 下保存，直至进行定量。
   9. 使用荧光 dsDNA 检测试剂盒，按照制造商说明书对样本中的 DNA 进行定量。
   10. 将 DNA 含量标准化为每毫克原始湿重样本中所含的 DNA 纳克数（ng DNA/mg 湿重）。
   11. 使用双尾 Student's t-检验分析数据，并以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。
2. 免疫组织化学
   注意：溶液 1、2、3 及固定液应在使用前配制，可冷冻保存长达 6 个月。所用所有抗体和染料及其相应稀释比例均列于表 1中。
   1. 溶液配制
      1. 通过将 2 g 多聚甲醛（PFA）、8 g 蔗糖和 24 µL 1 M CaCl₂ 加入 77 mL 0.2 M Na₂HPO₄ 和 23 mL 0.2 M NaH₂PO₄ 中，再用 dH₂O 定容至 200 mL，配制固定液。调节 pH 至 7.4。
      2. 通过将 13.5 g Na₂HPO₄ 和 3.2 g NaH₂PO₄ 加入 1 L dH₂O 中，配制 0.12 M 磷酸盐缓冲液。调节 pH 至 7.4。
      3. 通过将 4 g 蔗糖加入 100 mL 0.12 M 磷酸盐缓冲液中，配制溶液 1。
      4. 通过将 15 g 蔗糖加入 100 mL 0.12 M 磷酸盐缓冲液中，配制溶液 2。
      5. 通过将 15 g 蔗糖和 7.5 g 明胶加入 100 mL 0.12 M 磷酸盐缓冲液中，配制溶液 3。加热至 37 °C，直至明胶完全溶解。
      6. 配制甲基绿储备液（2% 甲基绿粉末溶于 dH₂O）¹⁹。
   2. 免疫检测
      1. 使用固定液在 4 °C 下固定样本至少 4 小时。
      2. 用 1× PBS 洗涤样本 2 次，每次 10 分钟。
      3. 在 4 °C 下用溶液 1 孵育过夜（O/N）或超过 1 天。
      4. 洗涤后，在 4 °C 下用溶液 2 孵育过夜或超过 1 天。让样本恢复至室温（RT）。
      5. 在 37 °C 下用溶液 3 孵育 3 小时。额外保留一份预热至 37 °C 的溶液 3 以备后续使用。
      6. 用铝箔制作小型（2 cm × 1 cm × 1 cm）模具。在模具中铺一层薄薄的溶液 3 并使其凝固。将样本置于已凝固的溶液 3 上，再覆盖温热的溶液 3。调整样本方向并让其再次凝固。用彩色笔在凝固的溶液 3 上标记样本位置。
      7. 将模具置于干冰冷却或液氮冷却的异戊烷表面进行冷冻。
      8. 使用最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂，将含有样本的冷冻明胶块固定在冷冻切片机载物台上。
      9. 对冷冻明胶块进行切片，并将组织切片转移至载玻片上。使其干燥 60 分钟。
      10. 使用疏水性标记笔在切片周围画线。
      11. 用 1× PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 10 分钟。
      12. 用含 1% 牛血清白蛋白（BSA）、1% 山羊血清和 0.05% Triton X-100 的 1× PBS（封闭液）覆盖切片，室温孵育 30 分钟（封闭步骤）。
      13. 将一抗用封闭液稀释后覆盖切片。在密闭盒中，于 4 °C 孵育过夜（O/N），并使用湿纸维持湿度，防止切片干燥。
      14. 用 1× PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 10 分钟。
      15. 将二抗用封闭液稀释后覆盖切片。在避光条件下室温孵育 1.5 小时。
          注意：避免光照，以防荧光团降解。
      16. 用 4× PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 10 分钟。
          注意：当背景较强时，可使用更高浓度的 PBS。
      17. 将载玻片浸入 DAPI 溶液（0.1% Triton X-100/1× PBS 中含 5 µg/mL 1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷）中，每张 30 秒。
      18. 用 1× PBS 冲洗。
      19. 用抗荧光淬灭封片剂（1× PBS:甘油 [1:9] 中含 50 mg/mL 没食子酸丙酯）封片，并加盖盖玻片。4 °C 保存，直至在荧光显微镜下观察和采集图像²⁰。
          注意：对于整体免疫组织化学（in toto）实验，采用相同方案（见步骤 4.2.2.12–4.2.2.18），但样本需先在室温下用 1× PBS 稀释的 4% PFA 固定 3 小时。DNA 染色通过将甲基绿加入二抗溶液中实现。所用所有抗体和染料及其稀释比例均列于表 1中。随后将样本夹在两个由钢环隔开的盖玻片之间，用蜂蜡密封，并使用共聚焦显微镜采集 100 µm 的图像堆栈²¹。
3. Western 印迹分析
   注意：所用所有抗体及其相应稀释比例均列于表 1中。
   1. 溶液配制
      1. 通过将 20 mL 甘油、4 g SDS 和 0.2 mL 溴酚蓝加入 80 mL 100 mM Tris 碱溶液中，配制 2× SDS-PAGE 上样缓冲液。调节 pH 至 6.8。使用前新鲜加入二硫苏糖醇（DTT）。
      2. 通过将 2.4 g Tris 碱、8.8 g NaCl 和 1 mL Tween-20 加入 dH₂O 中定容至 1 L，配制含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水洗涤缓冲液（TBST）。用 HCl 调节 pH 至 7.4–7.6。
      3. 通过将 30.2 g Tris 碱、144.2 g 甘氨酸和 10 g SDS 加入 1 L dH₂O 中，配制 10× 电泳缓冲液（RB）。使用前，将 100 mL 10× RB 加入 900 mL dH₂O 中，配制 1× RB（工作液）。
         注意：10× RB 可在室温下保存数月，而 1× RB 可在不同电泳运行中重复使用。
      4. 通过将 5.82 g Tris 碱、2.93 g 甘氨酸和 0.5 g SDS 加入 800 mL dH₂O 中，待成分溶解后加入 200 mL 甲醇，配制转膜缓冲液（TB）。4 °C 冷却。
         注意：TB 应在每次使用前新鲜配制。
   2. 蛋白质提取
      1. 采集 E18.5 小鼠的背最长肌，并立即放入含有 2× SDS-PAGE 上样缓冲液（含新鲜添加的 DTT，终浓度 100 mM）的微量离心管（2 mL）中。以相同方式处理 E18.5 dECM。
      2. 每管加入一个碳化钨珠。在珠磨机中均质化 2 次，每次 2.5 分钟（翻转固定座）。
      3. 在超声水浴中对样本超声处理 5 分钟。
      4. 在 50 °C 下加热样本 10 分钟。
      5. 在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。
      6. 将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。
      7. 使用微量分光光度计对蛋白进行定量。
      8. 于 -20 °C 保存，以备后续使用。
   3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
      1. 使用预制梯度丙烯酰胺凝胶（4%–20%）
      2. 将凝胶安装至电泳槽中。小心移除梳子。加入 1× RB 至电泳槽标示线处。确保加样孔中充满 RB。
      3. 每孔上样 100 µg 蛋白。加入 12 µL 高分子量蛋白标准品。
      4. 以恒定电压电泳 100 分钟（前 10 分钟 150 V，后 90 分钟 185 V）。
   4. 转膜
      1. 在凝胶电泳进行时，用预冷的转膜缓冲液（TB，4 °C）浸泡滤纸和海绵。
      2. 将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜裁剪至与凝胶相同大小。用甲醇活化，再用 dH₂O 洗涤，最后浸泡于 TB 中。
      3. 根据制造商说明书，将海绵、滤纸、凝胶和活化后的膜组装至转膜夹心中。
      4. 将夹心放入含有预冷 TB（置于冰床上）的电泳槽中。插入冷却装置。在 100 V 下运行 90 分钟。
      5. 转膜完成后，使用考马斯亮蓝替代染料染色，以评估转膜质量。
   5. 免疫检测
      1. 配制封闭液（含 5% 脱脂奶粉的 TBST）。将膜在室温下振荡孵育 1 小时。
      2. 用 TBST 冲洗 3 次，每次 5 秒。
      3. 将膜与用含 2% BSA 和 0.02% 叠氮化钠的 TBST 稀释的一抗（每张膜 3 mL）在 4 °C 冷室中振荡孵育过夜（O/N）。
      4. 次日，用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
      5. 将膜与用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（每张膜 5 mL）在室温下孵育 1 小时。
      6. 用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。之后保持在 TBST 中，直至进行检测。
      7. 使用市售显影试剂盒检测蛋白。根据制造商说明书加入检测试剂。采集条带图像。
      8. 若需在同一张膜上检测多个抗体，在检测完成后，使用 TBST 洗涤 3 次（每次 5 分钟）去除原有抗体，然后重复步骤 4.3.5.2–4.3.5.7。

表1：免疫组织化学和蛋白质印迹分析中使用的抗体和染料及其相应的稀释比例。 请点击此处下载该表格。^10,22

5. 脱细胞基质中的细胞培养

注意：所有操作均在超净工作台内无菌条件下进行。所有孵育步骤均在37 °C、5% CO₂条件下进行。

1. 准备细胞培养基：高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），含稳定型谷氨酰胺和丙酮酸钠，添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素（pen/strep）（即完全培养基）。
2. 在超净台中，将 dECM 置于含 1% pen/strep 的 1× PBS 中的培养皿内，使用显微手术刀和镊子将其分割成约 500 µm × 500 µm × 250 µm 的小块。
   注意：dECM 质地较软，通常使用镊子将其分离为大小相近的片段比用显微手术刀切割更为方便。
3. 将组织片段转移至 96 孔板中（每孔三至四个片段），每孔加入 200 µL 预先预热至 37 °C 的完全培养基，在培养箱中孵育 2 小时。
4. 向接种了亚融合状态（约 70%）C2C12 细胞的 T25 培养瓶中加入 500 µL 胰蛋白酶，随后用 1 mL 完全培养基重悬细胞。
5. 取 10 µL 细胞重悬液与 10 µL 台盼蓝染液混合，加载至血细胞计数板，计数并计算细胞数量，确认细胞活力。
6. 吸除含 dECM 的 96 孔板中的培养基，每孔加入含 50,000 个活 C2C12 细胞的 200 µL 完全培养基。
7. 孵育 2 天后，用镊子将 dECM（连同细胞）转移至含 400 µL 完全培养基的 48 孔板中。此后每隔 2 天，用微量移液器小心吸除旧培养基以避免 dECM 从孔底脱落，并更换新鲜培养基，持续至第 8 天。
   注意：将基质在 96 孔板中维持 2 天以促进 C2C12 细胞在 dECM 上的黏附，之后转移至 48 孔板以提供更大体积的营养培养基。dECM 应牢固黏附于孔底。
8. 进行分化实验时，在第 8 天将完全培养基更换为分化培养基（含 2% 马血清和 1% pen/strep 的 DMEM），随后继续在分化培养基中孵育 4 天，至第 12 天为止。

结果

脱细胞化方案的目标是制备出在组成上与天然组织高度相似的脱细胞细胞外基质（dECM）。为了评估脱细胞化过程的有效性，采用了多种方法，包括组织形态学观察、DNA含量测定、F-肌动蛋白染色，以及利用免疫组织化学和蛋白质印迹技术对关键细胞外基质成分进行分析。具体而言，对骨骼肌组织中的五种主要细胞外基质成分进行了分析。

在整个实验过程中，样品的外观会发生变化（图1B1-4）。分离后，由于肌红蛋白的存在，肌肉组织呈红色（图1B1）。在低渗缓冲液中孵育后，细胞被裂解并去除了大部分胞质蛋白，样品变为白色（图1B2）。十二烷基硫酸钠（SDS）是一种常用于组织脱细胞的阴离子去污剂¹²，可有效去除胞质和核成分以及...

讨论

细胞外基质（ECM）是一种存在于所有组织中的大分子复杂网络，在调控细胞行为和功能方面发挥着关键作用²。ECM 作为细胞附着的物理支架，提供能够主动调节细胞增殖、迁移、分化和凋亡等过程的信号。因此，ECM 的正确形成与维持对于发育和稳态均至关重要¹。

尽管二维细胞培养模型已被广泛使用，但它们正逐渐被更先进的三维平台所取代。这是因为二维培养缺乏影响细胞行为的化学和物理信号，而三维培养则被认为是研究天然组织中分子与细胞动态更为真实的替代方案¹¹。对组织进行脱细胞处理可制备出更接近生物组织微环境的支架结构，这一点已在多个针对不同组织或器官系统的研究中得到证实^14,15,23,24,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12孔细胞培养板，平底，组织培养处理，无菌	Abdos 实验耗材	P21021
4′6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐	默克	D8417
4–20% Mini-PROTEAN TGX 预制胶	伯乐（Bio-Rad）	4561093
48孔细胞培养板，平底，TC处理，无菌	Abdos 实验耗材	P21023
96孔细胞培养板，平底，组织培养处理，无菌	Abdos实验器材	P21024
牛血清白蛋白，第五组分	NZYtech	MB04601
BX60 荧光显微镜	Olympus
冷冻切片机 CM1860 UV	徕卡
二硫苏糖醇	赛默飞世尔科技	R0862
含稳定型谷氨酰胺和丙酮酸钠的高糖DMEM	Biowest	L0103-500
DNase I	PanReac AppliChem	A3778
DNeasy 血液 & 组织试剂盒	Qiagen	69506
乙二胺四乙酸（EDTA）	默克	108418
胎牛血清	Biowest	S1560-500
细尖移液管	ThermoFisher	15387823
山羊血清	Biowest	S2000-100
Hera Guard 气流柜	Heraeus
Heracell 150 CO2 培养箱	赛默飞世尔科技
HiMark预染蛋白质标准品	Invitrogen
新西兰来源马血清	Gibco	16050122
HRP-α- 兔IgG	abcam	ab205718
HRP-α- 大鼠IgG	abcam	ab205720
HRP-α小鼠 IgG	abcam	ab205719
ImageJ v. 1.53t
甲基绿	Sigma-Aldrich	67060
MM400 组织研磨仪	Retsch
NanoDrop ND-1000 分光光度计	赛默飞世尔科技
多聚甲醛，16% w/v 水溶液，无甲醇	Alfa Aesar	043368-9M
青霉素-链霉素（100倍浓缩液）	GRiSP	GTC05.0100
鬼笔环肽 Alexa 488	赛默飞世尔科技	A12379
带通气孔的聚苯乙烯培养皿（60×15 mm，无菌）	Greiner Bio-One	628161
Qubit dsDNA HS 试剂盒	赛默飞世尔科技	Q32851
Qubit™ 3 氟素计	Invitrogen	15387293
S6E Zoom体视显微镜	Leica
十二烷基硫酸钠	默克	11667289001
SuperFrost® Plus黏附载玻片	赛默飞世尔科技	631-9483
SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物	赛默飞世尔科技	15626144
TCS SPE 共聚焦显微镜	Leica
三(羟甲基)氨基甲烷（Tris碱） ≥99%	VWR Chemicals	28811.295
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
0.4% 台盼蓝溶液	Gibco	15250061
DPBS (1X) 中的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA	GRiSP	GTC02.0100
TWEEN 20（50% 溶液）	赛默飞世尔科技	3005
WesternBright PVDF-CL 膜卷（0.22µm)	Advansta	L-08024-001
αI型胶原蛋白	abcam	ab21286
αIV型胶原蛋白	Millipore	AB756P
α-IV型胶原蛋白	Santa Cruz Biotechnology	sc-398655
α纤连蛋白	Sigma	F-3648
α层粘连蛋白 α2	Sigma	L-0663
α-主要组织相容性复合体	D.S.H.B.	MF20
α小鼠 Alexa 488	分子探针	A11017
α小鼠 Alexa 568	分子探针	A11019
α-泛层粘连蛋白	Sigma	L-9393
α-磷酸化组蛋白3	默克密理博	06-570
α兔源 Alexa 568	分子探针	A21069
α-兔源 Alexa 488	分子探针	A11070
α-Rat Alexa 488	分子探针	A11006