本研究优化了一种脱细胞化方案，以获得胎鼠骨骼肌的脱细胞基质。C2C12成肌细胞能够定植于这些基质中，并进行增殖和分化。 体外 该模型可用于研究骨骼肌疾病（如肌营养不良症）背景下的细胞行为。
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摘要
摘要
细胞外基质（ECM）在为细胞提供结构支持以及传递调控多种细胞过程的信号方面发挥着关键作用。二维（2D）细胞培养模型过度简化了细胞与细胞外基质之间的复杂相互作用，由于缺乏完整的三维（3D）支持环境，细胞行为可能发生改变，因而难以准确反映体内（in vivo）的生理过程。细胞外基质成分异常以及细胞与细胞外基质相互作用的缺陷，是多种不同疾病发生发展的重要因素。
一个例子是LAMA2-先天性肌营养不良症（LAMA2-CMD），由于功能性层粘连蛋白211和221的缺失或减少，可导致严重的肌张力低下，通常在出生时或出生后不久即可检测到。先前利用该疾病小鼠模型的研究表明，其发病始于胎儿期肌发生过程。本研究旨在开发一种三维 体外 一种可用于研究肌细胞与胎儿肌肉细胞外基质（ECM）相互作用的模型，可模拟天然微环境。该方案采用从E18.5小鼠胎儿分离的背部深层肌肉，依次经低渗缓冲液、阴离子去污剂和DNase处理。所得脱细胞基质（dECMs）与天然组织相比，保留了所有检测的ECM蛋白（包括层粘连蛋白α2、总层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白I和胶原蛋白IV）。
当C2C12成肌细胞接种于这些脱细胞细胞外基质（dECMs）表面时，细胞能够侵入并定植于dECMs中，后者支持其增殖与分化。此外，C2C12细胞分泌细胞外基质蛋白，参与其在dECMs内微环境的重塑。该体系的建立 体外 该平台为揭示LAMA2-CMD发病机制提供了新的有前景的方法，并有望拓展应用于其他由细胞外基质与骨骼肌细胞间通讯障碍导致疾病进展的骨骼肌疾病。
引言
细胞外基质（ECM）是组织的主要组成成分，代表其非细胞部分。这种三维（3D）结构不仅为细胞提供物理支持，还在生物体发育过程中参与多种生化过程，发挥关键作用1。组织特异性ECM的形成发生在发育过程中，是细胞与其微环境之间复杂相互作用的结果，并受到多种细胞内和细胞外刺激的影响。ECM是一种高度动态的结构，会以时空特异性的方式发生化学和机械性重组，并直接影响细胞命运2。ECM最显著的特征之一是其功能多样性，每种组织的ECM都含有独特的分子组合，形成特定的拓扑结构和特性，以适应其所包含的细胞的需求1。
细胞外基质（ECM）信号传导和支持对于发育和稳态至关重要，一旦受到破坏，可导致多种病理状态3,4。其中一个例子是LAMA2缺乏性先天性肌营养不良症（LAMA2-CMD），这是最常见的先天性肌营养不良类型。LAMA2基因编码层粘连蛋白α2链，该蛋白存在于层粘连蛋白211和层粘连蛋白221中，当发生突变时可导致LAMA2-CMD5。层粘连蛋白211是存在于骨骼肌纤维周围基底膜中的主要异构体。当层粘连蛋白211异常或缺失时，基底膜与肌细胞之间的连接被破坏，从而引发疾病<....
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方案
所述所有方法均经里斯本大学理学院动物福利委员会（ORBEA）和葡萄牙兽医总局（DGAV；编号 0421/000/000/2022）批准，并符合欧盟指令 2010/63/EU 的规定。
1. 脱细胞缓冲液与试剂的制备
注意：脱细胞化方案中使用的所有溶液均应通过高压灭菌法进行灭菌，并可储存长达 3 个月，除非另有说明。
- 通过向去离子水（dH2O）中加入终浓度为 137 mM 的氯化钠（NaCl）、2.68 mM 的氯化钾（KCl）、8.1 mM 的磷酸二氢钾（KH2PO4）和 1.47 mM 的二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4）来配制 10 倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS），调节 pH 至 6.8。取 100 mL 10x PBS 加入 900 mL 去离子 H2O 中，配制成 1x PBS。经高压灭菌后室温（RT）保存。使用前加入无菌青霉素/链霉素储备液（青霉素 10,000 U/mL，链霉素 10 mg/mL [pen/strep]），使其终浓度为 1%。
- 通过将 1.21 g 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris 碱）和 1 g 乙二胺四乙酸（EDTA）溶于 1 L 去离子水（dH2O）中配制....
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结果
脱细胞化方案的目标是制备出在组成上与天然组织高度相似的脱细胞细胞外基质（dECM）。为了评估脱细胞化过程的有效性，采用了多种方法，包括组织形态学观察、DNA含量测定、F-肌动蛋白染色，以及利用免疫组织化学和蛋白质印迹技术对关键细胞外基质成分进行分析。具体而言，对骨骼肌组织中的五种主要细胞外基质成分进行了分析。
在整个实验过程中，样品的外观会发生变化（图1B1-4）。分离后，肌肉组织因含有肌红蛋白而呈红色（图1B1）。在低渗缓冲液中孵育后，细胞被裂解，大部分胞质蛋白被去除，样品变为白色（图1B2）。SDS是一种常用于组织脱细胞的阴离子去污剂12，可有效去除胞质和核成分以及细胞膜。因此，经SDS.......
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讨论
细胞外基质（ECM）是一种存在于所有组织中的大分子复杂网络，在调控细胞行为和功能方面发挥着关键作用2。ECM 作为细胞附着的物理支架，提供能够主动调节细胞增殖、迁移、分化和凋亡等过程的信号。因此，ECM 的正确形成与维持对于发育和稳态均至关重要1。
尽管二维细胞培养模型已被广泛使用，但它们正逐渐被更先进的三维平台所取代。这是因为二维培养缺乏影响细胞行为的化学和物理信号，而三维培养则被认为是研究天然组织中分子与细胞动态更为真实的替代方案11。对组织进行脱细胞处理可制备出更接近生物组织微环境的支架结构，这一点已在多个针对不同组织或器官系统的研究中得到证实14,15,23,24,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由法国肌病协会（AFM-Téléthon；合同编号 23049）、MATRIHEALTH 项目以及 cE3c 单位资助项目（UIDB/00329/2020）提供资金支持。我们衷心感谢捐赠人 Henrique Meirelles 选择支持 MATRIHEALTH 项目。本研究受益于里斯本大学理学院显微技术平台的基础设施，该平台是葡萄牙生物成像平台（PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122）的一个节点；我们感谢 Luís Marques 在图像采集与处理方面的协助。最后，我们感谢 Marta Palma 提供的技术支持，以及研究团队成员的慷慨贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12孔细胞培养板，平底，组织培养处理，无菌 | Abdos 实验耗材 | P21021 | |
| 4′6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 | 默克 | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX 预制胶 | 伯乐（Bio-Rad） | 4561093 | |
| 48孔细胞培养板，平底，TC处理，无菌 | Abdos 实验耗材 | P21023 | |
| 96孔细胞培养板，平底，组织培养处理，无菌 | Abdos实验器材 | P21024 | |
| 牛血清白蛋白，第五组分 | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 荧光显微镜 | Olympus | ||
| 冷冻切片机 CM1860 UV | 徕卡 | ||
| 二硫苏糖醇 | 赛默飞世尔科技 | R0862 | |
| 含稳定型谷氨酰胺和丙酮酸钠的高糖DMEM | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy 血液 & 组织试剂盒 | Qiagen | 69506 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | 默克 | 108418 | |
| 胎牛血清 | Biowest | S1560-500 | |
| 细尖移液管 | ThermoFisher | 15387823 | |
| 山羊血清 | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard 气流柜 | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | ||
| HiMark预染蛋白质标准品 | Invitrogen | ||
| 新西兰来源马血清 | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- 兔IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- 大鼠IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α小鼠 IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| 甲基绿 | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 组织研磨仪 | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 多聚甲醛，16% w/v 水溶液，无甲醇 | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| 青霉素-链霉素（100倍浓缩液） | GRiSP | GTC05.0100 | |
| 鬼笔环肽 Alexa 488 | 赛默飞世尔科技 | A12379 | |
| 带通气孔的聚苯乙烯培养皿（60×15 mm，无菌） | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS 试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | Q32851 | |
| Qubit™ 3 氟素计 | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom体视显微镜 | Leica | ||
| 十二烷基硫酸钠 | 默克 | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus黏附载玻片 | 赛默飞世尔科技 | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物 | 赛默飞世尔科技 | 15626144 | |
| TCS SPE 共聚焦显微镜 | Leica | ||
| 三(羟甲基)氨基甲烷（Tris碱） ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Gibco | 15250061 | |
| DPBS (1X) 中的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20（50% 溶液） | 赛默飞世尔科技 | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL 膜卷（0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| αI型胶原蛋白 | abcam | ab21286 | |
| αIV型胶原蛋白 | Millipore | AB756P | |
| α-IV型胶原蛋白 | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α纤连蛋白 | Sigma | F-3648 | |
| α层粘连蛋白 α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-主要组织相容性复合体 | D.S.H.B. | MF20 | |
| α小鼠 Alexa 488 | 分子探针 | A11017 | |
| α小鼠 Alexa 568 | 分子探针 | A11019 | |
| α-泛层粘连蛋白 | Sigma | L-9393 | |
| α-磷酸化组蛋白3 | 默克密理博 | 06-570 | |
| α兔源 Alexa 568 | 分子探针 | A21069 | |
| α-兔源 Alexa 488 | 分子探针 | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | 分子探针 | A11006 |
参考文献
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F.
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重印与许可
