基于网络药理学预测与代谢组学验证的叶下珠子治疗高脂血症作用机制研究

Baihan Zeng; Luming Qi; Sha Wu; Nannan Liu; Jie Wang; Kaidi Nie; Lina Xia; Shuguang Yu

doi:10.3791/65071

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方法文章

基于网络药理学预测与代谢组学验证的叶下珠子治疗高脂血症作用机制研究

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DOI：

10.3791/65071

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2023年4月7日

Baihan Zeng^*¹^,²^,³ , Luming Qi^*¹^,²^,³ , Sha Wu^*¹^,²^,³ , Nannan Liu¹^,²^,³ , Jie Wang¹^,²^,³ , Kaidi Nie¹^,²^,³ , Lina Xia¹^,²^,³ , Shuguang Yu²^,³

¹School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, ²State Administration of Traditional Chinese Medicine Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine, Regimen and Health, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, ³Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Regimen and Health of Sichuan Province

^* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案描述了一种整合策略，旨在基于网络药理学预测和代谢组学验证，探索余甘子对抗高脂血症的关键靶点和作用机制。

摘要

高脂血症已成为全球心血管疾病和肝损伤的主要危险因素。余甘子（Fructus Phyllanthi, FP）在中医和印度医学理论中是一种治疗高脂血症的有效药物，但其潜在作用机制仍需进一步探索。本研究旨在通过整合网络药理学预测与代谢组学验证的策略，揭示余甘子抗高脂血症的作用机制。通过评估血浆脂质水平（包括总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）），建立高脂饮食（HFD）诱导的小鼠模型。采用网络药理学方法筛选余甘子的活性成分及其抗高脂血症的潜在作用靶点。通过血浆和肝脏的代谢组学分析，鉴定正常组、模型组和干预组之间的差异代谢物及其相关通路。进一步构建网络药理学与代谢组学之间的关联，以全面解析余甘子对抗高脂血症的作用过程。通过分子对接验证所获得的关键靶蛋白。结果表明，余甘子可改善高脂饮食诱导的高脂血症小鼠的血浆脂质水平及肝损伤。余甘子中的没食子酸、槲皮素和β-谷固醇被确定为关键活性成分。代谢组学分析发现，血浆中有16种、肝脏中有6种潜在的差异代谢物参与了余甘子对抗高脂血症的治疗作用。进一步的整合分析表明，其干预作用与CYP1A1、AChE和MGAM相关，并涉及L-犬尿氨酸、皮质酮、乙酰胆碱和棉子糖的调节，主要富集于色氨酸代谢通路。分子对接结果证实，上述成分作用于高脂血症相关蛋白靶点，在降脂过程中发挥关键作用。综上所述，本研究为预防和治疗高脂血症提供了新的可能性。

引言

高脂血症是一种对人类健康具有严重影响的常见代谢性疾病，也是心血管疾病的主要危险因素¹。近年来，该疾病的发病年龄呈下降趋势，由于长期不规律的生活方式和不健康的饮食习惯，年轻人的患病风险日益增加²。临床上已采用多种药物治疗高脂血症，例如，他汀类药物是治疗高脂血症及相关动脉粥样硬化性疾病患者最常用的药物之一。然而，长期使用他汀类药物会产生不可忽视的副作用，可能导致预后不良，如不耐受、治疗抵抗和不良事件³^,⁴。这些缺陷已成为高脂血症患者的额外负担。因此，亟需提出具有稳定降脂效果且副作用更少的新型治疗方法。

由于传统中药（TCM）疗效良好且副作用较少，已被广泛用于疾病治疗⁵。余甘子（Fructus Phyllanthi，FP）是大戟科植物余甘子 Phyllanthus emblica Linn. 的干燥果实，俗称余甘果或印度 gooseberry（印度醋栗），是传统中医和印度医学中著名的药食同源物质⁶^,⁷。根据中医理论，该药材具有清热、凉血、助消化的功效⁸

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方案

所有涉及动物操作的实验程序均按照成都中医药大学《实验动物护理与使用指南》进行，并经成都中医药大学机构伦理委员会批准（方案编号 2020-36）。本研究采用雄性 C57BL/6 小鼠（20 ± 2 g）。小鼠购自商业来源（见材料表）。

1. 基于网络药理学的预测

注意：网络药理学用于预测复方药物FP治疗高脂血症的活性成分及其关键靶点。

活性成分与关键靶点的筛选
1. 搜索关键词 "叶下珠果实" 在传统中医系统药理学数据库（TCMSP； http://tcmspw.com/tcmsp.php）以获取FP候选活性成分及其作用靶点的列表。
  注意：通常仅将数据库中口服生物利用度（OB）≥30% 且类药性（DL）值≥0.18 的成分作为活性成分纳入。
2. 搜索关键词 "高脂血症" 在 GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM；https://omim.org/）和治疗靶点数据库（TTD；http://db.idrblab.net/ttd/）中，获取高脂血症的相关候选靶点。下载疾病靶点的电子表格，删除重复靶点，得到高脂血症靶点列表。
3. 将步骤 1.1.1 ....

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结果

网络药理学
根据数据库和液相色谱-质谱（LC-MS）分析所获得的药代动力学和药效学特性，共筛选出18种FP中的潜在成分（总离子流色谱图见补充图1）。通过相关文献发现，没食子酸的含量远高于其他成分，且具有显著的降脂作用⁹^,¹¹。因此，该成分也被视为一种潜在的有效成分。最终共确定19种成分及134个与成分相关的靶点。全部19种成分列于表1中。为筛选出最具代表性的成分用于后续分析，将这些成分导入中医药分子机制生物信息学分析工具数据库（BATMAN-TCM；http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）。根据“成分-靶点-通路-疾病”网络，鉴定出若干生物活性成分，如没食子酸、槲皮素和β-谷甾醇，被认为是FP中与高胆固醇血症和冠状动脉粥样硬化相关的关键成分（补充图2）。其中，没食子酸是研究最为广泛的酚酸之一，也是FP中主要的生物活性成分

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讨论

近年来，高脂血症的发病率不断上升，主要归因于长期不健康的饮食习惯。中药及其化学成分具有多种药理活性，近年来已得到广泛研究³⁷^,³⁸。覆盆子（FP）是一种药食两用的果实资源，在治疗高脂血症方面具有重要的潜在价值。然而，FP抗高脂血症的潜在治疗机制仍需进一步研究。

网络药理学在分子水平上评估药物的多靶点药理作用，并预测天然产物与蛋白质之间的相互作用，以确定其主要作用机制³⁹。第一步是筛选药物的活性成分和关键靶点。本研究共发现9种活性成分和62个核心基因。为进一步阐明茯苓（FP）对高脂血症的分子作用机制，基于网络药理学分析构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和成分-靶点网络。为缩小关键成分和靶点的范围，通过BATMAN-TCM方法筛选出三种与高胆固醇血症及冠状动脉粥样硬化相关的关键活性成分（没食子酸、槲皮素和β-谷固醇）。这些成分均具有降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平或升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平的.......

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披露

所有作者声明均无利益冲突。

致谢

本研究得到中医药养生康复产品开发与创新团队（2022C005）以及新业态跨界融合研究项目的资助 "健康维护与康复+".

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
101-3B 烘箱	Luyue 仪器设备厂	\
80312/80302 玻璃载片	江苏四泰实验设备有限公司	\
80340-1630 盖玻片	江苏四海实验设备有限公司	\
AccucoreTM C18（3 mm × 100 毫米，2.6 μm)	赛默飞世尔科技	\
乙腈	Fisher Chemical	A998	版本 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm)	赛默飞世尔科技	\
Aethanol	Fisher Chemical	A995	版本 3.0
氨溶液	成都科隆化学品有限公司	1336-21-6	版本 3.9.1
AutoDockTools	斯克里普斯海洋研究所	\
BS-240VT 全自动动物生化检测系统	深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司	\
Compound Discoverer	赛默飞世尔科技	\
Cytoscape	Cytoscape 联盟	\
DM500 光学显微镜	Leica	\
DV215CD 电子天平	奥豪斯公司	T15A63
乙醇	成都科隆化学品有限公司	64-17-5
甲酸	Fisher Chemical	A118
高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A112-1-1
苏木精染色液	Biosharp	BL700B
高脂饮食	ENSIWEIER	202211091031
日立 CT15E/CT15RE 离心机	日立有限公司	\
匀浆器	奥来宝科技有限公司	\
盐酸	成都科隆化学品有限公司	7647-01-0
成像系统	LIOO	\
JB-L5 冷冻机	武汉俊杰电子有限公司	\
JB-L5 组织包埋机	武汉俊杰电子有限公司	\
JK-5/6 切片机	武汉俊杰电子有限公司	\
JT-12S 水提离心机	武汉俊杰电子有限公司	\
KQ3200E 超声波清洗器	昆山超声仪器有限公司	\
LDL-C 测定试剂盒	南京建成生物工程研究所	A113-1-1
雄性C57BL/6小鼠	SBF Biotechnology Co., Ltd.	\	版本 2.3.2
中性树胶	上海轶洋仪器有限公司	10021190865934
纯水	广州华生食品 & 饮料有限公司	GB19298
PyMOL	DeLano Scientific LLC	\	版本 14.1
RE-3000 旋转蒸发仪	亚荣生化仪器厂有限公司	\
RM2016 病理切片机	上海徕卡仪器有限公司	\	版本 26.0
SIMCA-P	Umetrics AB	\
辛伐他汀	默克雪兰 & Dohme有限公司	14202220051
SPSS	国际商业机器公司	\
TC 检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A111-1-1
TG 检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A110-1-1
超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱-肼类高分辨质谱法	赛默飞世尔科技	\
涡旋振荡器	北京宝力斯特科技有限公司	LC-Vortex-P1
二甲苯	成都科隆化学品有限公司	1330-20-7

参考文献

Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
Mach, F., et al.

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