马具有卓越的有氧运动能力，因此马的骨骼肌是研究马运动生理学以及哺乳动物线粒体生理学的重要组织。本文介绍了对马骨骼肌线粒体功能进行全面评估的技术方法。
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本文内容
摘要
摘要
线粒体功能——氧化磷酸化及活性氧的生成——在健康与疾病中均至关重要。因此，测定线粒体功能是生物医学研究的基础。骨骼肌是线粒体的丰富来源，尤其在有极高有氧能力的动物（如马）中更是如此，使其成为研究线粒体生理学的理想对象。本文介绍如何利用高分辨率呼吸测定法结合同步荧光测定法，对新鲜分离的骨骼肌线粒体进行检测，以量化不同线粒体状态下底物氧化的能力，并确定线粒体呼吸各组成部分的相对能力。采用四甲基罗丹明甲酯（Tetramethylrhodamine methylester）来展示由底物氧化所导致的线粒体膜电位的形成，并通过计算单位耗氧量所产生的相对膜电位，进一步评估线粒体的相对效率。由于腺苷酸类物质对镁离子的亲和力不同，ADP转化为ATP会导致反应体系中镁离子浓度发生变化。因此，可利用镁绿（magnesium green）测定ATP合成速率，从而进一步计算氧化磷酸化效率（磷酸化与氧化之比，P/O）。最后，利用Amplex UltraRed试剂——其与过氧化氢反应后生成荧光产物（resorufin）——可定量测定线粒体呼吸过程中活性氧的产生，并分析活性氧生成与同步呼吸之间的关系。这些技术能够在多种模拟条件下对线粒体生理功能进行可靠定量，从而揭示这一关键细胞结构在健康与疾病中的作用。
引言
真核细胞的线粒体产生细胞进行生命活动和维持所需使用的大部分ATP1。线粒体生成ATP的关键步骤是将氧气转化为水，因此线粒体及其相关细胞的代谢能力通常通过测量耗氧量来量化2。然而，线粒体生理过程比单纯的耗氧过程更为复杂，仅依赖耗氧量这一指标无法全面评估线粒体功能与功能障碍对细胞健康的影响。要完整表征线粒体功能，不仅需要评估耗氧量，还需检测ATP的生成以及活性氧（ROS）的产生。
通过使用特异性荧光探针，可在测定呼吸作用的同时，对线粒体关键功能进行额外评估。四甲基罗丹明甲酯（TMRM）是一种阳离子型荧光染料，可按线粒体跨膜电位的大小成比例地积聚于线粒体基质中，其积聚导致荧光强度降低3。TMRM可用于指示线粒体膜电位的相对变化，也可通过额外实验测定相关常数，将荧光信号转换为毫伏（mV）值，从而量化跨膜电压的精确变化。镁绿（MgG）是一种与Mg2+结合后产生荧光的荧光探针，可用于基于ADP与ATP对镁二价阳离子亲和力差异来测定ATP合成4。研究者必须在特定分析条件下分别测定ADP和ATP的特异性亲和/解离常数（Kd），以便将MgG荧光变化转换为ATP浓度的变化。Amplex UltraRed（AmR）是用于测定线粒体呼吸过程中产生的过氧化氢及其他活性氧（ROS）的荧光探针&....
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方案
本研究经俄克拉荷马州立大学机构动物护理与使用委员会批准。研究使用了四匹纯种骟马（17.5 ± 1.3 岁，593 ± 45 kg），以获得代表性结果。
1. 获取骨骼肌活检标本
- 在轻度镇静和局部麻醉下，使用12 G 伦敦大学学院医院（UCH）活检针（见材料表），按照先前发表的报告11，采用无菌技术从半腱肌（或其他感兴趣肌肉）的中心部位获取骨骼肌活检样本。
- 立即将活检样本转移至含有冰冻活检运输培养液的试管中（2.77 mM CaK2-EGTA、7.23 mM K2-EGTA、20 mM 咪唑、20 mM 牛磺酸、50 mM K-MES、0.5 mM 二硫苏糖醇、6.56 mM MgCl2、5.77 mM ATP 和 15 mM 磷酸肌酸，调节pH至7.1；见材料表），并运送至实验室进行分析。
注：有关活检运输培养液的配制方法，请参阅Doerrier等人的文献15 。 - 根据制造商说明书，使用商用试剂盒从活检样本中分离线粒体（见材料表）。最终储存缓冲液中不应含有呼吸测定实验中使用的底物，如ADP、ATP....
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结果
所提出的参考状态为健康且久坐的纯种马（未因强制运动而增加体能）的肌肉样本，从姿势肌中心采集的新鲜肌肉组织，其中含有高比例的富含线粒体的I型骨骼肌纤维，并在接近静息代谢的条件下孵育（即38 °C，pH 7.0）。在此条件下，研究者可预期LN值为2.71 ± 0.90，PN值为62.40 ± 26.22，PN+S值为93.67 ± 34.76，PS值为46.93 ± 14.58 pmol O2 x s-1 x mL-1（图3 和 图4）。由于TMRM荧光探针具有抑制作用，加入TMRM孵育的线粒体呼吸值较低（图1）。FCRLeak、FCRN 和 FCRS 分别为0.05 ± 0.01、0.66 ± 0.07 和 0.51 ± 0.07。计算得到的氧化.......
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讨论
在高分辨率呼吸测定仪的标准输出中加入荧光信号，可提供有关线粒体生理学的宝贵信息，但荧光信号的细致校准对于获得高质量数据至关重要。最初关于MgG使用的实验方案建议，在计算镁-腺苷酸解离常数时所生成的校准曲线可应用于后续的测定4；然而，MgG的荧光信号在不同测定之间的重现性可能不足以支持这种方法。因此，每次测定均需通过自动化的MgCl2滴定进行校准，并据此为该次独立测定建立相应的校准曲线，用于计算ATP合成量。此外，为了准确推导ATP合成速率，必须根据测定的具体条件（包括特定组织、孵育条件以及产生磷酸化呼吸的底物）分别计算镁与ADP及ATP的Kd（解离常数）。AmR测定法的变异性已被更广泛地认识15,17，因此通常由研究人员根据需要在实验过程中插入多个独立的重新校准点。基于使用马骨骼肌的历史数据表明，该测定法在首次校准点（加入样品前）的典型响应性约为0.646 V/mM H2O2，并在整个测.......
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披露
作者与本文稿无任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢约翰和黛比·奥克斯利马术运动医学捐赠讲席以及格雷森赛马俱乐部研究基金会的慷慨支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| 碳酸钙 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | 用于操作O2K荧光呼吸测定仪的软件 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| 谷氨酸 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| 辣根过氧化物酶 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| 过氧化氢 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | 必须在每次检测前每日新鲜配制 |
| 咪唑 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| 六水合氯化镁 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| 镁绿荧光染料 | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| 苹果酸 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| 甘露醇 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9647 | |
| 线粒体分离试剂盒 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K荧光呼吸测定仪 | Oroboros Inc | 需配备多台设备以同时运行全套检测项目。 | |
| 磷酸肌酸 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| 氢氧化钾 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| 乳酸钾 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| 磷酸钾 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| 丙酮酸 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | 必须在每次检测前每日新鲜配制 |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| 琥珀酸 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| 超氧化物歧化酶 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| 牛磺酸 | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| 滴定泵 | Oroboros Inc | ||
| 滴定注射器 | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH活检针 | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | 提供多种规格 |
参考文献
- Wilson, D. F. Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization. Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introdu....
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