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方法文章

高分辨率荧光-呼吸测定法用于马骨骼肌

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DOI：

10.3791/65075

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2023年2月3日

 , 
1Department of Physiological Sciences, Oklahoma State University

本文内容

摘要

马具有卓越的有氧运动能力，因此马的骨骼肌是研究马运动生理学以及哺乳动物线粒体生理学的重要组织。本文介绍了对马骨骼肌线粒体功能进行全面评估的技术方法。

摘要

线粒体功能——氧化磷酸化及活性氧的生成——在健康与疾病中均至关重要。因此，测定线粒体功能是生物医学研究的基础。骨骼肌是线粒体的丰富来源，尤其在有极高有氧能力的动物（如马）中更是如此，使其成为研究线粒体生理学的理想对象。本文介绍如何利用高分辨率呼吸测定法结合同步荧光测定法，对新鲜分离的骨骼肌线粒体进行检测，以量化不同线粒体状态下底物氧化的能力，并确定线粒体呼吸各组成部分的相对能力。采用四甲基罗丹明甲酯（Tetramethylrhodamine methylester）来展示由底物氧化所导致的线粒体膜电位的形成，并通过计算单位耗氧量所产生的相对膜电位，进一步评估线粒体的相对效率。由于腺苷酸类物质对镁离子的亲和力不同，ADP转化为ATP会导致反应体系中镁离子浓度发生变化。因此，可利用镁绿（magnesium green）测定ATP合成速率，从而进一步计算氧化磷酸化效率（磷酸化与氧化之比，P/O）。最后，利用Amplex UltraRed试剂——其与过氧化氢反应后生成荧光产物（resorufin）——可定量测定线粒体呼吸过程中活性氧的产生，并分析活性氧生成与同步呼吸之间的关系。这些技术能够在多种模拟条件下对线粒体生理功能进行可靠定量，从而揭示这一关键细胞结构在健康与疾病中的作用。

引言

真核细胞的线粒体产生细胞进行生命活动和维持所需使用的大部分ATP1。线粒体生成ATP的关键步骤是将氧气转化为水，因此线粒体及其相关细胞的代谢能力通常通过测量耗氧量来量化2。然而，线粒体生理过程比单纯的耗氧过程更为复杂，仅依赖耗氧量这一指标无法全面评估线粒体功能与功能障碍对细胞健康的影响。要完整表征线粒体功能，不仅需要评估耗氧量，还需检测ATP的生成以及活性氧（ROS）的产生。

通过使用特异性荧光探针，可在测定呼吸作用的同时，对线粒体关键功能进行额外评估。四甲基罗丹明甲酯（TMRM）是一种阳离子型荧光染料，可按线粒体跨膜电位的大小成比例地积聚于线粒体基质中，其积聚导致荧光强度降低3。TMRM可用于指示线粒体膜电位的相对变化，也可通过额外实验测定相关常数，将荧光信号转换为毫伏（mV）值，从而量化跨膜电压的精确变化。镁绿（MgG）是一种与Mg2+结合后产生荧光的荧光探针，可用于基于ADP与ATP对镁二价阳离子亲和力差异来测定ATP合成4。研究者必须在特定分析条件下分别测定ADP和ATP的特异性亲和/解离常数（Kd），以便将MgG荧光变化转换为ATP浓度的变化。Amplex UltraRed（AmR）是用于测定线粒体呼吸过程中产生的过氧化氢及其他活性氧（ROS）的荧光探针 5。H2O2与AmR之间的反应（由辣根过氧化物酶催化）生成可检测的试卤灵，在530 nM处通过荧光检测。这些检测方法可分别单独加入实时线粒体呼吸测定体系中，以同时测量线粒体生理学的相应方面，从而建立呼吸作用与线粒体输出之间的直接关联。

马能够达到极高的单位质量耗氧率，部分原因在于其骨骼肌线粒体含量极高，这使得该组织在研究线粒体生理学方面具有高度相关性。随着高分辨率呼吸测定技术的发展，利用这一新技术的研究已帮助阐明了马骨骼肌线粒体在马匹卓越运动能力以及骨骼肌疾病病理生理过程中的作用6,7,8,9,10,11,12,13,14。对马骨骼肌线粒体功能的研究具有特殊优势，因为获取大量此类组织并不需要处死动物。因此，马匹不仅能够提供足量组织用于线粒体功能的全面表征，还可作为高质量、机制性线粒体生理学研究的纵向对照。基于这一原因，研究人员已开发出多种补充性检测方法，用于量化该组织中线粒体膜电位、ATP合成以及活性氧（ROS） 的产生，以更全面地表征马骨骼肌中线粒体的生理状态。

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方案

本研究经俄克拉荷马州立大学机构动物护理与使用委员会批准。研究使用了四匹纯种骟马（17.5 ± 1.3 岁，593 ± 45 kg），以获得代表性结果。

1. 获取骨骼肌活检标本

  1. 在轻度镇静和局部麻醉下，使用12 G 伦敦大学学院医院（UCH）活检针（见材料表），按照先前发表的报告11，采用无菌技术从半腱肌（或其他感兴趣肌肉）的中心部位获取骨骼肌活检样本。
  2. 立即将活检样本转移至含有冰冻活检运输培养液的试管中（2.77 mM CaK2-EGTA、7.23 mM K2-EGTA、20 mM 咪唑、20 mM 牛磺酸、50 mM K-MES、0.5 mM 二硫苏糖醇、6.56 mM MgCl2、5.77 mM ATP 和 15 mM 磷酸肌酸，调节pH至7.1；见材料表），并运送至实验室进行分析。
    注：有关活检运输培养液的配制方法，请参阅Doerrier等人的文献15 。
  3. 根据制造商说明书，使用商用试剂盒从活检样本中分离线粒体（见材料表）。最终储存缓冲液中不应含有呼吸测定实验中使用的底物，如ADP、ATP和琥珀酸。
  4. 每100 mg用于线粒体分离的肌肉组织，使用80 µL悬浮液（225 mM甘露醇、75 mM蔗糖和1 mM EGTA；见材料表）重悬最终获得的线粒体沉淀。
  5. 尽量缩短从活检操作到线粒体分离之间的时间间隔，并在整个处理过程中将样本保持在0–4 °C，直至加入高分辨率呼吸测定仪中。
    ​注：初步研究发现，分离的线粒体悬浮液在0–4 °C条件下维持约2小时后即开始丧失功能活性。

2. 高分辨率呼吸测量仪的设置

  1. 使用高分辨率呼吸测量仪来定量线粒体呼吸及相关过程。使用制造商提供的软件控制程序（参见材料表）控制呼吸测量仪、校准传感器并收集原始数据。每种测试条件下的样品均需进行重复测定。
    注意：在所有情况下，本方案中所述的推荐滴定步骤和最终试剂浓度均基于2 mL呼吸测量室。
  2. 每隔2-4周，按照制造商说明，通过连二亚硫酸盐的序列滴定法测定O2传感器的背景O2通量和零点。在重新校准之前，保留这些校准常数用于后续实验。
    注意：与先前发表的使用透化肌纤维的方法11,12,13,16不同，后者需要高氧环境（250-500 µM）以避免O2向线粒体扩散受限，而分离的线粒体可在50-200 µM O2范围内进行评估。这只需在加入线粒体悬液前让呼吸介质与空气平衡即可实现（即在完成每日单点校准后）。同样，呼吸室的再氧合也可通过简单打开腔室，使足够的环境氧气溶解到呼吸介质中，从而将氧浓度提升至所需水平来完成。
  3. 用无镁培养基填充呼吸测量室（含0.5 mM EGTA、60 mM K-乳酸盐、20 mM 牛磺酸、10 mM KH2PO4、20 mM HEPES、110 mM 蔗糖和1 g/L基本无脂肪酸的牛血清白蛋白[BSA]，调节pH至7.1；参见材料表）。
    注意：有关呼吸介质配制的具体说明，请参阅Komlodi等人的研究17。
    1. 将仪器孵育温度设定为38 °C，以模拟马骨骼肌的基础温度，并使用位于呼吸测量室底部的磁力搅拌器将呼吸介质的搅拌速度设为800 rpm。
    2. 关闭腔室照明，以避免对荧光传感器造成干扰。
    3. 以800 mV的极化电压激活氧电极，并将增益设置为1以放大输出信号。
    4. 每2秒记录一次氧浓度，计算前40秒（20个数据点）氧测量值的负斜率作为氧通量，并以pmol x s-1 x mL孵育液表示。
  4. 通过让培养基与空气平衡来校准氧传感器。根据高分辨率呼吸测量仪测得的大气压和标准大气氧浓度，计算参考氧分压。

使用TMRM测量线粒体膜电位

  1. 使用"Green"荧光传感器（主波长530 nm）定量呼吸室中的荧光信号。以400–500 mV激发传感器；所得信号经1:1,000增益放大。
    注意：必须针对不同仪器优化具体设置，以确保在传感器的线性范围内捕获预期信号。
  2. 在线粒体加入前，加入TMRM（4 µL的1 mM溶液，终浓度为2 µM；参见材料表）。
  3. 在线粒体加入前，使用简单的两点校准法对荧光信号（电压）相对于所添加荧光染料（mM）的量进行校准。
    注意：使用仪器控制软件中的荧光信号校准功能进行此校准。荧光探针的原始信号可能需要30分钟或更长时间才能稳定，以便记录校准的第二个点。
  4. 在完成呼吸测定滴定程序后，通过多次加入解偶联剂（羰基氰化物间氯苯腙；每次滴加2 µL）进行TMRM信号的最终校准，直至TMRM荧光信号不再进一步增加，表明线粒体膜电位完全崩溃（图1）。
    ​注意：此荧光信号值被视为对应0 mV跨膜电位，并作为呼吸测定滴定过程中记录的相对膜电位值的参考点。

4. 使用镁绿（MgG）检测ATP生成量

  1. 使用"Blue"荧光传感器（主波长465 nm）定量呼吸室中的荧光信号。针对各仪器激活这些传感器，以捕获处于传感器线性范围内的预期信号。
  2. 在线粒体加入后、但任何底物加入前，进行MgG荧光信号的化学设置和校准。向呼吸测定室中加入8 µL的2 mM乙二胺四乙酸（EDTA），以螯合会与Mg2+竞争结合MgG的阳离子（特别是Ca2+），然后向呼吸室中加入4 µL的1 mM MgG（终浓度1.1 µM）。
  3. 使用10次连续添加2 µL的100 mM MgCl2对原始荧光信号进行滴定校准，每次滴定之间间隔1分钟，以使荧光信号稳定（图2）。
    注意：该过程在实验完成后离线进行，使用仪器制造商及其配套软件提供的模板，生成镁离子浓度与荧光信号之间的二阶曲线（预期r2 > 0.98），结合已知量的ADP加入呼吸室以及先前确定的Kd值，用于计算相应的ATP浓度11。
  4. 确定ATP合成速率，即在整个实验过程中ATP浓度随时间变化的斜率（图3）。

5. 线粒体活性氧（ROS）生成的测定 使用Amplex UltraRed（AmR）

  1. 使用"Green"荧光传感器（主波长530 nm）定量呼吸室中的荧光信号。以300-400 mV激发传感器；所得信号经1:1,000增益放大。针对不同仪器优化特定设置，以确保捕获的信号处于传感器的线性范围内。
    注意：若使用的呼吸介质不含MgCl2，则应在添加AmR检测试剂前加入MgCl2（加入20-60 µL的100 mM MgCl2溶液，使终浓度达到1-3 µM）。
  2. 在线粒体加入前完成AmR检测的化学体系配置及初始校准。加入30 µmol DTPA（6 µL的5 mM溶液）以螯合可能干扰反应的阳离子，随后加入超氧化物歧化酶（2 µL的5,000 U/mL储备液，将超氧阴离子转化为H2O2，从而更全面地检测活性氧生成）、辣根过氧化物酶（5 µL的500 U/mL储备液）和Amplex UltraRed（2 µL的10 mM储备液）（见材料表），使呼吸室中终浓度分别为5 U/mL、1 U/mL和10 µM。
  3. 待荧光信号稳定后，分两次加入0.2 µmol过氧化氢（每次5 µL新鲜配制的40 µM溶液），两次间隔约5分钟。
    注意：两次H2O2滴定前后所测得的荧光信号可构建系统的三点线性校准曲线（预期r2 > 0.95），其斜率反映系统对荧光信号与H2O2生成（或添加）之间关系的整体响应能力。使用仪器控制软件中的荧光信号校准功能完成此校准。
  4. 在整个检测过程中，根据需要进行额外的两点校准（每次加入5 µL新鲜配制的40 µM溶液），以校正因呼吸体系化学环境变化导致的检测响应性偏移，具体校准时间点由研究人员自行决定（图4）。

6. 线粒体呼吸的测定

  1. 向每个2 mL孵育室中加入15 µL分离的线粒体悬液（步骤1.4），使结果代表18.75 mg肌肉组织的线粒体产量。密封孵育室。每次滴定之间 vortex 混匀样品，以维持样品悬液的均匀性。
  2. 在添加任何底物之前，测定残余氧消耗（ROX）。从后续测量值中减去该数值（通常小于0.2 pmol O₂）2 x s-1 x mL-1) 根据底物/解偶联剂/抑制剂滴定（SUIT）实验方案中每一步的耗氧量数值11 方案完成后。
    注意：在滴定过程中，为了获得可靠结果，需改变整体呼吸状态，因此必须让氧传感器和荧光传感器的信号均稳定至少1分钟（以主传感器信号计算斜率稳定为判断依据）。此要求适用于所有滴定步骤。
  3. 使用一种通用型SUIT体系，用于对马骨骼肌线粒体功能进行初步表征。依次加入丙酮酸（5 µL，2 M水溶液）、谷氨酸（10 µL，2 M水溶液）和苹果酸（10 µL，0.4 M水溶液）进行滴定（参见 材料表) 加入各反应室，以生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），并促进由复合体 I 氧化 NADH 所支持的非磷酸化（漏）呼吸（LN) (图1, 图3，以及 图4).
  4. 加入ADP（20 µL，500 mM水溶液；参见 材料表) 以通过复合体 I（P）刺激磷酸化呼吸作用N).
  5. 加入琥珀酸（20 µL 的 1 M 水溶液；参见 材料表) 通过复合体 I 和复合体 II 的联合作用产生磷酸化呼吸（PN+S).
    注意：由于同时通过复合体 I 和复合体 II 进行呼吸作用，耗氧量可能较高，足以消耗孵育介质中大部分溶解的氧气。如果 O₂2 当浓度降至 50 µM 以下时，通过打开培养室重新暴露于空气，使培养液重新氧合，直至测得的 O2 浓度已超过 150 µM。根据需要重复此步骤以维持足够的 O2 用于线粒体呼吸。
  6. 加入鱼藤酮（2 µL 的 0.1 mM 乙醇溶液；参见 材料表)以阻断复合物I。由此产生的氧通量代表复合物II支持线粒体耗氧的能力 通过 仅琥珀酸的氧化（PS).
    警告：鱼藤酮为有毒物质。使用时应遵循标准实验室安全规范，避免摄入或吸入。
  7. 计算包含单个活检样本等分试样的各个呼吸室中，给定实验条件下测量值的平均值。
    注意：衍生计算值（如通量控制比率（FCRs））在识别不同代谢途径中的相对变化方面具有重要价值，其中包括FCR泄漏 (LN/PN），FCRN (PN/PN+S）和 FCRS (PS/PN+S). 计算的氧化磷酸化效率（1-LN/PN+S) 提供了根据总呼吸能力校正后的泄漏呼吸整体影响的估算值。

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结果

所提出的参考状态为健康且久坐的纯种马（未因强制运动而增加体能）的肌肉样本，从姿势肌中心采集的新鲜肌肉组织，其中含有高比例的富含线粒体的I型骨骼肌纤维，并在接近静息代谢的条件下孵育（即38 °C，pH 7.0）。在此条件下，研究者可预期LN值为2.71 ± 0.90，PN值为62.40 ± 26.22，PN+S值为93.67 ± 34.76，PS值为46.93 ± 14.58 pmol O2 x s-1 x mL-1（图3 和 图4）。由于TMRM荧光探针具有抑制作用，加入TMRM孵育的线粒体呼吸值较低（图1）。FCRLeak、FCRN 和 FCRS 分别为0.05 ± 0.01、0.66 ± 0.07 和 0.51 ± 0.07。计算得到的氧化...

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讨论

在高分辨率呼吸测定仪的标准输出中加入荧光信号，可提供有关线粒体生理学的宝贵信息，但荧光信号的细致校准对于获得高质量数据至关重要。最初关于MgG使用的实验方案建议，在计算镁-腺苷酸解离常数时所生成的校准曲线可应用于后续的测定4；然而，MgG的荧光信号在不同测定之间的重现性可能不足以支持这种方法。因此，每次测定均需通过自动化的MgCl2滴定进行校准，并据此为该次独立测定建立相应的校准曲线，用于计算ATP合成量。此外，为了准确推导ATP合成速率，必须根据测定的具体条件（包括特定组织、孵育条件以及产生磷酸化呼吸的底物）分别计算镁与ADP及ATP的Kd（解离常数）。AmR测定法的变异性已被更广泛地认识15,17，因此通常由研究人员根据需要在实验过程中插入多个独立的重新校准点。基于使用马骨骼肌的历史数据表明，该测定法在首次校准点（加入样品前）的典型响应性约为0.646 V/mM H2O2，并在整个测...

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披露

作者与本文稿无任何利益冲突。

致谢

作者谨此感谢约翰和黛比·奥克斯利马术运动医学捐赠讲席以及格雷森赛马俱乐部研究基金会的慷慨支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ADPSigma-Aldrich (MilliporeSigma)A5285
Amplex UltraRedLife TechnologiesA36006
ATPSigma-Aldrich (MilliporeSigma)A2383
BSASigma-Aldrich (MilliporeSigma)A6003
碳酸钙Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)C4830
CCCPSigma-Aldrich (MilliporeSigma)C2759
DatLab 7.0Oroboros Inc用于操作O2K荧光呼吸测定仪的软件
二硫苏糖醇Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)D0632
DTPASigma-Aldrich (MilliporeSigma)D1133
EGTASigma-Aldrich (MilliporeSigma)E4378
谷氨酸Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)G1626
HEPESSigma-Aldrich (MilliporeSigma)H7523
辣根过氧化物酶Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)P8250
过氧化氢Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)516813必须在每次检测前每日新鲜配制
咪唑Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)I2399
K-MESSigma-Aldrich (MilliporeSigma)M8250
六水合氯化镁Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)M9272
镁绿荧光染料Thermo Fisher ScientificM3733
苹果酸Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)M1000
甘露醇Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)M9647
线粒体分离试剂盒Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)MITOISO1
O2K荧光呼吸测定仪Oroboros Inc需配备多台设备以同时运行全套检测项目。
磷酸肌酸Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)P7936
氢氧化钾Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)P1767
乳酸钾Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)L2398
磷酸钾Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)P0662
丙酮酸Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)P2256必须在每次检测前每日新鲜配制
鱼藤酮Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)R8875
琥珀酸Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)S2378
蔗糖Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)84097
超氧化物歧化酶Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)S8160
牛磺酸Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)T0625
滴定泵Oroboros Inc
滴定注射器Oroboros Inc
TMRMSigma-Aldrich (MilliporeSigma)T5428
UCH活检针Millenium Surgical Corp72-238067提供多种规格

参考文献

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