马骨骼肌的高分辨率氟呼吸测定法

真核细胞的线粒体产生细胞用于工作^{和维持的大部分}ATP1。ATP线粒体产生的关键步骤是将氧气转化为水，因此线粒体和相关细胞的代谢能力经常通过测量^{氧气消耗量}来量化2。然而，线粒体生理学比简单的耗氧过程更复杂，并且仅依赖该终点提供了对线粒体功能和功能障碍对细胞健康影响的不完整评估。线粒体功能的全面表征不仅需要评估耗氧量，还需要评估ATP的产生以及活性氧（ROS）。

关键线粒体功能的额外测量可以与通过使用特定荧光团测量呼吸同时完成。四甲基罗丹明甲酯（TMRM）是一种阳离子荧光团，其在线粒体基质中与线粒体跨膜电压电位成比例地积累，导致由于这种积累而降低荧光强度^3。TMRM可用作线粒体膜电位相对变化的指标，或可用于量化跨膜电压的精确变化，并进行额外的实验以确定允许将荧光信号转换为mV的常数。镁绿（MgG）是一种荧光团，与Mg²⁺结合时会发出荧光，用于根据ADP和ATP对镁二价阳离子⁴的差异亲和力测量ATP合成。研究人员必须确定在特定分析条件下ADP和ATP的特定亲和力/解离常数（Kd），以将MgG荧光的变化转化为ATP浓度的变化。Amplex UltraRed （AmR） 是用于测量线粒体呼吸过程中过氧化氢和其他 ROS 产生的荧光团⁵。H₂O₂ 和AmR（由辣根过氧化物酶催化）之间的反应产生试卤灵，可通过530nM的荧光检测到。这些测定中的每一个都可以单独添加到实时线粒体呼吸测定中，以同时测量线粒体生理学的各个方面，从而提供呼吸和线粒体输出之间的直接联系。

马能够产生非常高的质量比氧消耗率，部分原因是马骨骼肌的线粒体含量非常高，这使得这种组织与研究线粒体生理学高度相关。随着高分辨率呼吸测量法的发展，使用这种新技术的研究有助于确定马骨骼肌线粒体对马显着运动能力和骨骼^{肌疾病的病理}生理学的贡献6，⁷，⁸，⁹，¹⁰，¹¹，¹²，^13，14.对马骨骼肌线粒体功能的研究特别有利，因为获得大量的这种组织是非终末性的。因此，马受试者不仅可以为线粒体功能的完整表征提供足够的组织，还可以作为线粒体生理学高质量机械研究的纵向对照。出于这个原因，已经开发了额外的测定来量化线粒体膜电位，ATP合成和ROS的产生，以补充该组织中氧气消耗量的测量，以便提供更可靠的线粒体生理学表征马骨骼肌。

这项研究得到了俄克拉荷马州立大学机构动物护理和使用委员会的批准。本研究使用4匹纯种阉马（17.5±1.3岁，593±45公斤）产生代表性结果。

1.获取骨骼肌活检标本

1. 在轻度镇静下，使用 12 G 大学学院医院 （UCH） 活检针（见 材料表）从半腱肌（或其他感兴趣的肌肉）中心获取骨骼肌活检（遵循无菌技术），并根据先前发表的报告使用局部麻醉¹¹.
2. 将活检标本立即转移到带有冰冷活检运输介质溶液（2.77 mM CaK 2-EGTA、7.23 mM K 2-EGTA、20 mM 咪唑、20 mM 牛磺酸、50 mM K-MES、0.5 mM 二硫苏糖醇、6.56 mM MgCl₂、5.77 mM ATP 和 15 mM 磷酸肌酸，调节至 pH 7.1;参见材料表）的小瓶中。运送到实验室进行分析。
   注意:有关制备活检运输培养基的具体说明，请参阅Doerrier等人¹⁵。
3. 根据制造商的说明，使用商业试剂盒从活检样本中分离线粒体（见 材料表）。最终的储存缓冲液不应含有ADP、ATP和琥珀酸盐等底物，这些底物是呼吸测定的一部分。
4. 使用每 100 mg 用于线粒体分离的肌肉使用 80 μL 悬浮培养基（225 mM 甘露醇、75 mM 蔗糖和 1 mM EGTA;参见 材料表）重悬分离线粒体的最终沉淀。
5. 尽量减少从活检程序到分离线粒体的间隔，并在整个处理步骤中将样品保持在0-4°C，直到添加到高分辨率呼吸计中。
   注意:初步研究发现，当保持在0-4°C时，分离线粒体的悬浮液在大约2小时后开始失去功能能力。

2. 高分辨率呼吸计的设置

1. 高分辨率呼吸计用于量化线粒体呼吸和相关过程。使用制造商提供的软件控制程序（见 材料表）来控制呼吸计，校准传感器并收集原始数据。分析每个测试条件的一式两份样本。
   注意:在所有情况下，本协议中描述的推荐滴定和最终试剂浓度均基于2 mL呼吸测定室。
2. 按照制造商的说明，通过连二亚硫酸盐的连续滴定，每2-4周确定O 2电极的背景O₂通量和零点。保留这些校准常数以供后续分析，直到重复校准。
   注意:与以前发表的使用透化肌纤维¹¹，^12，13，¹⁶的程序相比^，其中需要高氧（250-500μM）以避免O 2向线粒体的扩散限制，分离的线粒体可以使用50-200μM O₂的范围进行评估.这可以通过在添加线粒体悬浮液之前（即，在每日单点校准之后）让呼吸介质与室内空气平衡来实现。同样，呼吸室的复氧可以通过简单地打开室来完成，直到足够的环境氧气溶解到呼吸测量介质中，将氧气浓度提高到所需水平。
3. 用无镁培养基（0.5 mM EGTA、60 mM K-乳糖酸、20 mM 牛磺酸、10 mM KH₂PO₄、20 mM HEPES、110 mM 蔗糖和 1 g/L 牛血清白蛋白 [BSA] 基本上不含脂肪酸，调节至 pH 7.1;参见 材料表）填充呼吸计室。
   注意:有关制备呼吸介质的具体说明，请参阅Komlodi等人¹⁷ 。
   1. 将仪器孵育温度设置为38°C以表示马骨骼肌的基础温度，并使用在呼吸计室底部转动的磁力搅拌器将呼吸介质的混合设置为800rpm。
   2. 关闭腔室照明以避免干扰荧光传感器。
   3. 用800 mV极化电压为氧电极通电，并以增益设置为1放大产生的信号。
   4. 每2秒记录一次氧浓度，将氧通量计算为前40秒（20个数据点）氧测量的负斜率，并报告为PMOL x ^s-1 x mL的孵育溶液。
4. 通过让介质与室内空气平衡来校准氧传感器。根据高分辨率呼吸计测量的气压和标准大气氧浓度计算参考氧分压。

3. 使用TMRM测量线粒体膜电位

1. 使用"绿色"荧光传感器（530 nm主波长）量化来自呼吸室的荧光信号。在 400-500 mV 下为传感器通电;产生的信号以1:1，000的增益被放大。
   注意: 必须针对单个仪器优化特定设置，以捕获传感器线性范围内的预期信号。
2. 加入TMRM（4μL的1mM溶液，最终浓度为2μM;参见 材料表）在加入线粒体之前。
3. 在添加线粒体之前，使用荧光信号（电压）与添加荧光团（mM）的量进行简单的两点校准来校准荧光信号。
   注意: 使用机器控制软件中的荧光信号校准功能来校准此信号。来自荧光探针的原始信号可能需要30分钟或更长时间才能稳定下来，以便记录校准的第二个点。
4. 完成呼吸测定滴定方案后，通过多次滴定解偶联剂（羰基氰间氯苯基腙;每次滴定 2 μL）进行 TMRM 信号的最终校准，直到没有观察到 TMRM 荧光信号进一步增加，表明线粒体膜电位完全崩溃（图 1）。
   注意:该荧光信号值被认为等于0 mV跨膜电位，并用作呼吸测定滴定方案期间记录的相对膜电位值的参考点。

4. 使用镁绿 （MgG） 测量 ATP 产量

1. 使用"蓝色"荧光传感器（465 nm主波长）量化来自呼吸室的荧光信号。为各个仪器的这些传感器通电，以捕获传感器线性范围内的预期信号。
2. 在线粒体添加后但在添加任何底物之前，执行 MgG 荧光信号的化学设置和校准。向呼吸测定室中加入 8 μL 2 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA），以螯合与 Mg 2+ 竞争与 MgG 结合的阳离子（特别是 Ca²⁺），然后向呼吸室中加入 4 μL 1 mM MgG （1.1 μM）。
3. 用 10 x 2 μL 100 mM MgCl 2 的顺序滴定校准原始荧光信号，滴定间隔 1 分钟以稳定荧光信号（图 2）。
   注意:该过程在完成测定后离线完成，并使用机器制造商和相关软件提供的模板，产生镁浓度到荧光信号的二阶曲线（预期r^{2 >} 0.98），该曲线将与已知量的ADP一起添加到呼吸测量室和先前确定的K_d 值以确定ATP¹¹的相应浓度。
4. 确定ATP合成速率，即整个协议中ATP浓度随时间推移的斜率（图3）。

5. 使用 Amplex UltraRed （AmR） 测量线粒体产生 ROS

1. 使用"绿色"荧光传感器（530 nm主波长）量化来自呼吸室的荧光信号。在 300-400 mV 下为传感器通电;产生的信号以1:1，000的增益被放大。优化单个仪器的特定设置，以捕获传感器线性范围内的预期信号。
   注意:如果使用不含 MgCl 2 的呼吸培养基，则应在添加用于 AmR 测定的试剂之前添加（20-60 μL 100 mM MgCl 2 以产生 1-3 μM MgCl₂）。
2. 在添加线粒体之前，执行AmR测定的化学设置和初始校准。加入 30 μmol DTPA（6 μL 5 mM 溶液）以螯合可能干扰反应的阳离子，然后加入超氧化物歧化酶（2 μL 的 5，000 U/mL 储备溶液，将超氧阴离子转化为 H 2 O₂，以便更全面地检测活性氧的生成）、辣根过氧化物酶（5 μL 的 500 U/mL 储备溶液）， 和Amplex UltraRed（2 μL 10 mM储备溶液）（参见材料表），分别在呼吸测定室中产生5 U / mL，1 U / mL和10 μM。
3. 让荧光信号稳定，然后加入 0.2 μmol 过氧化氢（5 μL 每天新鲜制作的 40 μM 溶液）两次，间隔约 5 分钟。
   注意:H₂O 2 两次滴定前后的荧光信号提供了系统的三点线性校准曲线（预期r 2>0.95），其斜率反映了系统在报告荧光信号与H 2 O 2 O ²产生（或添加）之间的关系时的整体响应性。使用机器控制软件中的荧光信号校准功能来校准该信号。
4. 在整个测定过程中执行额外的两点校准（每天新鲜的5μL40μM溶液），以允许在整个测定过程中随着呼吸测定的化学变化调整测定的反应性，这些校准点的具体时间由研究者决定（图4）。

6. 线粒体呼吸的测量

1. 向每个 2 mL 孵育室中加入 15 μL 分离的线粒体悬浮液（步骤 1.4），使结果代表 18.75 mg 肌肉的线粒体产量。密封培养室。在每次滴定之间涡旋样品，以保持样品的均匀悬浮液。
2. 在添加任何底物之前测量残余氧消耗量（ROX）。完成方案后，从底物/解偶联剂/抑制剂滴定（SUIT）方案¹¹中每个步骤的耗氧量值中减去该值（通常小于0.2 pmol O₂ x s-1 x ^mL-1）。
   注意:至关重要的是，来自氧传感器和荧光传感器的信号至少稳定1分钟（通过主要传感器信号的稳定计算斜率评估），因为滴定会改变呼吸的整体状态以获得可靠的结果。这适用于所有滴定步骤。
3. 使用通用 SUIT，用于初步表征马骨骼肌线粒体功能。首先依次滴定丙酮酸（5 μL 2 M 水溶液）、谷氨酸（10 μL 2 M 水溶液）和苹果酸盐（10 μL 0.4 M 水溶液）（参见 材料表）进入每个腔室以产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （NADH） 并刺激由通过复合物 I （L_N） 氧化的 NADH 支持的非磷酸化（泄漏）呼吸（图 1， 图 3 和 图 4）。
4. 加入ADP（20μL的500mM水溶液;参见 材料表）以刺激通过复合物I（P_N）磷酸化呼吸。
5. 加入琥珀酸盐（20 μL 1 M 水溶液;参见 材料表），通过复合物 I 和复合物 II 的组合产生磷酸化呼吸 （P_{N + S}）。
   注意:通过复合物I和复合物II的呼吸组合，耗氧量可能高到足以消耗溶解在孵育培养基中的大部分氧气。如果O 2浓度降至50μM以下，则通过打开孵育室来重新复氧培养基，直到测量的O 2浓度增加到150μM以上。 根据需要重复此步骤以保持足够的O₂用于线粒体呼吸。
6. 加入鱼藤酮（2 μL 0.1 mM 乙醇溶液;参见材料表）以阻断复合物 I。由此产生的氧通量代表复合物II通过单独氧化琥珀酸（P_S）支持线粒体耗氧的能力。
   注意:鱼藤酮是一种有毒物质。使用标准的实验室安全性，避免摄入或吸入。
7. 计算包含单次活检等分试样的各个呼吸测量室中给定实验条件的平均值。
   注意:推导的计算，如通量控制比（FCR），对于识别不同途径的相对变化很有价值，包括FCR_泄漏（L N / P N），FCR N（P N / P N + S）和FCR S（P S / P _N + _S）。计算的氧化磷酸化效率 （1-L_N/P_N+S） 提供了根据总呼吸能力调整的渗漏呼吸的总体影响的估计值。

建议的参考状态是健康的久坐纯种马（由于强制运动而没有增加健康）和从姿势肌中心收集的新鲜肌肉样本，含有高百分比的富含线粒体的I型骨骼肌纤维，并在接近静息代谢的条件下孵育（即38°C和pH 7.0）。在这些条件下，研究者可以预期L N值为2.71±0.90，P N值为62.40±26.22，PN + S值为93.67±34.76，PS值为46.93±14.58 pmol O2 x s-1 x mL-1（图3和图4）。由于该荧光团的抑制作用，与TMRM一起孵育的线粒体的呼吸值较低（图1）。FCR泄漏、FCRN 和 FCRS 分别为 0.05 ± 0.01、0.66 ± 0.07 和 0.51 ± 0.07。计算的氧化磷酸化效率为0.97±0.01。这些呼吸状态的绝对值因个体受试者和组织氧化能力而异，但这些值的相对模式与透化马骨骼肌纤维的已发表结果一致（即，通过添加特定底物的呼吸增加，由于电子转移系统的饱和，通过复合物I和复合物II的呼吸组合分别小于这些电子源中的每一个[ETS] 下游产能）。分离的马骨骼肌线粒体的计算效率与透化马骨骼肌纤维11的相应值一致。

用于分离线粒体的源组织，P N 呼吸的 ATP 合成速率预计为 438.59 ± 397.10 pM x s-1，PN + S 呼吸为 383.18 ± 397.19，PS 呼吸为 172.07 ± 125.60。添加琥珀酸盐后ATP合成的减少可能是由于两个电子馈电在ETS的醌连接处的竞争，来自复合物II的馈电（不直接有助于线粒体膜电位）减少了通过复合物I的电子流动（通过质子泵送穿过线粒体膜直接有助于线粒体膜电位）。

对于用于分离线粒体的源组织，H2O2的产生速率预计为0.079±0.095 nmol.s-1，P N呼吸为0.021 ± 0.043，PN + S呼吸为0.026 ± 0.056，PS呼吸为0.237 ± 0.248（图4）。ROS产生的相对速率与线粒体膜电位的预测大小以及高膜电位与ROS产生之间的关联一致。这种关系的例外是，当呼吸仅通过复合物II发生时，由于电子从醌结向复合物I的反向流动，当它被鱼藤酮阻挡时，ROS产生非常高。

图 1:马骨骼肌线粒体呼吸和相对膜电位的代表性高分辨率呼吸测定图。顶部窗口是腔室氧浓度（左Y轴）和氧通量（右Y轴）随时间的变化（X轴）;底部窗口是腔室TMRM荧光（左Y轴）和荧光信号随时间变化的速率（右Y轴）（X轴）。垂直标记表示向腔室中添加特定底物（mt:线粒体悬浮液;P:丙酮酸;G:谷氨酸;M:苹果酸盐;D:ADP;S:琥珀酸盐;R:鱼藤酮;CCCP:羰基氰间氯苯基腙）。请点击此处查看此图的大图。

图 2:校准镁绿的腔室荧光信号以及测定镁和腺苷酸盐的 Kd 的代表性高分辨率呼吸测量迹线。 腔室 MgG 荧光（左 Y 轴）和荧光信号随时间变化速率（右 Y 轴）（X 轴）。最初的垂直标记表示向腔室中添加了特定的底物（MgG:镁绿; mt:线粒体悬浮液;P:丙酮酸;G:谷氨酸;M:苹果酸盐;S:琥珀酸盐;EDTA:乙二胺四乙酸）。随后使用自动滴定泵（TIP）连续滴定MgCl 2 ，增加荧光信号，然后连续滴定腺苷酸（在本例中为ATP）以降低荧光信号。MgCl2 的滴定也用于每次测定开始时以校准MgG信号，但在添加线粒体和呼吸测定底物（如P，G，M和S）之前 进行。

图 3:马骨骼肌线粒体呼吸和 ATP 合成的代表性高分辨率呼吸测定痕迹。 顶部窗口是腔室氧浓度（左Y轴）和氧通量（右Y轴）随时间的变化（X轴）;底部窗口是腔室MgG荧光（左Y轴）和荧光信号随时间变化的速率（右Y轴）（X轴）。垂直标记表示向腔室中添加特定底物（mt:线粒体悬浮液;P:丙酮酸;G:谷氨酸;M:苹果酸盐;D:ADP;S:琥珀酸盐;R:鱼藤酮）。 请点击此处查看此图的大图。

图 4:马骨骼肌线粒体呼吸和 H 2 O2产生的代表性高分辨率呼吸测定痕迹。顶部窗口是腔室氧浓度（左Y轴）和氧通量（右Y轴）随时间的变化（X轴）;底部窗口是室试卤灵荧光（左Y轴）和荧光信号随时间变化的速率（右Y轴）（X轴）。垂直标记表示向腔室中添加特定底物（mt:线粒体悬浮液;P:丙酮酸;G:谷氨酸;M:苹果酸盐;D:ADP;S:琥珀酸盐;R:鱼藤酮）。还包括使用 H 2 O2对荧光信号进行三次测定内两点校准。请点击此处查看此图的大图。

作者与本手稿没有利益冲突。