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方法文章

经导管球囊损伤诱导的兔主动脉瓣狭窄模型

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DOI：

10.3791/65078

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2023年3月31日

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1Cardiovascular Research Institute for Intractable Disease, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 2Division of Cardiology, Incheon St. Mary’s Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 3College of Pharmacy and Natural Medicine Research Institute, Mokpo National University, 4Division of Cardiology, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

需要合适的动物模型来理解主动脉瓣狭窄（AVS）的病理机制，并评估治疗干预措施的有效性。本方案描述了一种建立AVS兔模型的新方法 通过 直接球囊损伤 体内.

摘要

由于难以获得可靠的病变人主动脉瓣组织来源，动物模型正逐渐成为研究主动脉瓣狭窄（AVS）病理机制的重要工具。在多种动物模型中，AVS兔模型是大动物研究中最常用的模型之一。然而，传统的AVS兔模型需要长期饮食干预和基因操作才能诱导出明显的主动脉瓣狭窄，限制了其在实验研究中的应用。为克服这些局限性，本文提出一种新的AVS兔模型，通过直接对主动脉瓣进行球囊损伤来诱导狭窄。本方案详细描述了在新西兰白兔（NZW）中成功诱导AVS的技术，包括术前准备、手术操作步骤以及术后护理的逐步流程。该模型操作简便且可重复，为研究AVS的起始与进展过程提供了有前景的方法，也为探索该疾病潜在的病理机制提供了有价值的工具。

引言

人们日益认识到，由于难以获得与主动脉瓣狭窄（AS）进展相关的病变人主动脉瓣的可靠来源，采用合适的动物模型有助于更好地理解主动脉瓣狭窄（AVS）背后的病理机制。在用于研究AVS的各种动物模型中，兔子是最常用的大型动物AVS模型之一，可通过补充胆固醇/维生素D2或基因操作来诱导建立AVS兔模型1,2,3,4。

尽管兔AVS模型已为AVS的发生和发展提供了重要的认识，但在我们的初步实验中仍发现，一致且可重复地诱导AVS仍然具有挑战性。

除了饮食诱导和遗传易感性动物模型外，还已通过小鼠的直接机械损伤建立了新的主动脉瓣狭窄（AVS）模型5,6。该机械损伤模型可成功诱导主动脉瓣狭窄，是在野生型小鼠中建立的一种简单且可重复的AVS模型。据我们所知，目前尚无研究探讨机械损伤对兔模型主动脉瓣的影响。因此，本研究提供了一种通过球囊直接损伤主动脉瓣在雄性新西兰白兔中诱导AVS的新方法，该方法能够准确模拟瓣膜性主动脉瓣狭窄的病理状态。本实验方案详细描述了术前准备、手术操作步骤以及术后护理，有助于建立可重复的兔AVS模型。

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方案

所有动物实验程序均经韩国天主教大学医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并依照《实验动物福利法》、《实验动物护理与使用指南》以及该委员会发布的动物实验准则进行（批准编号：CUMC-2021-0176-05）。本研究采用3月龄雄性新西兰白兔（NZW），体重为3.5–4.0 kg，在单独笼具中按标准条件饲养。兔子饲喂正常饮食或添加0.5%胆固醇并补充50,000 U维生素D2的饮食（见材料表）。诱导主动脉瓣狭窄兔模型的实验设计及分析方法详见图1。

1. 手术准备

  1. 确保在手术开始时，所有医疗器械和外科器械（参见材料表）均已灭菌。
  2. 按照以下步骤准备扩张球囊导管套装。
    1. 将装有生理盐水与市售造影剂混合液（1:1）的注气/排气装置连接至球囊导管的鲁尔锁接头部分（参见材料表）。
    2. 用充盈液填充球囊，并排出球囊导管中的任何空气。
      ​注意：本研究中使用的充盈液为30%碘克沙醇与0.9%生理盐水的混合液（参见材料表）。
    3. 通过用充盈液冲洗球囊腔，确认球囊正常充盈。

2. 主动脉瓣损伤的手术操作

  1. 注射氯胺酮混合物（替来他明）肌肉注射 & 唑拉西泮（15 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）（参见 材料表) 以麻醉动物。
    注意：在给予麻醉之前，兔子预先皮下注射格隆溴铵（0.05 mg/kg），作为麻醉前用药的抗胆碱能药物。麻醉深度的充分性通过多项标准综合判断，包括对足趾夹捏无反应以及呼吸频率稳定。
  2. 将24 G静脉留置针插入耳缘静脉，并连接含肝素盐水（100 U/kg肝素）的输液装置。
  3. 将兔子连接至多参数兽用监护仪（参见 材料表) 以持续监测生命体征，例如血氧饱和度信号（SpO2）、温度和血压。
    注意：对于 SpO2 监测时，连接 SpO2 将传感器连接至兔的舌部。进行体温监测时，将探头插入兔的直肠。进行血压监测时，将袖带套在兔的前肢。
  4. 将兔子置于配备C型臂X线透视机的手术台上，呈仰卧位（参见 材料表），使用动物毛发剪刀去除颈部腹侧区域的毛发（图 2A).
  5. 用碘伏对切口区域进行消毒，并用手术巾覆盖兔子。
  6. 将兔心置于C形臂成像设备图像的中心位置。
    注意：所有研究人员在进行C形臂引导手术时，必须穿戴带有热释光剂量计（TLDs）的防护装备，以减少辐射暴露。
    1. 打开C型臂，选择 透视模式 用于心脏成像。
    2. 调整兔子的位置，确保心脏位于成像视野的中心。
  7. 在颈部皮肤上做一个约3 cm的纵向切口，使用手术剪剪开筋膜和脂肪组织。
  8. 通过仔细分离肌肉暴露左侧颈总动脉（LCCA），直至暴露约3-3.5 cm的LCCA图2B).
  9. 用3-0丝线结扎左颈总动脉（LCCA）（参见 材料表在暴露的左颈总动脉（LCCA）近端和远端放置动脉夹以阻断血流。
  10. 插入22 G静脉导管至左侧颈总动脉（LCCA），并引入导丝（0.016 in，参见 材料表通过静脉导管将导管尖端准确置于C形臂成像视野内，进入左心室（LV）。
    注意：插入静脉导管时，应小心逐步松开通向主动脉瓣路径上的结扎缝线，以允许导管顺利前进。
  11. 撤出静脉导管，保留导丝，并置入4-F鞘管（参见 材料清单) 沿导丝插入左侧颈总动脉（LCCA），以引入球囊导管（图 2C).
    注意：在用鞘管替换静脉导管后，应清除鞘管装置内任何残留的空气。
  12. 在C臂透视引导下，沿导丝将8 mm球囊导管小心插入主动脉瓣图2D).
  13. 将球囊导管尖端置于主动脉瓣下方约1-2 cm处，使用压力加压器以6 atm压力注入充盈液使球囊膨胀。
  14. 将球囊导管推进至左心室心尖部，再回撤至左心室流出道。重复此操作五次，随后使球囊放气。图2E，F).
  15. 重复步骤 2.8–2.9 三次，以确保瓣膜损伤充分。
  16. 撤出球囊导管和导丝。缓慢拔除左侧颈总动脉（LCCA）内的鞘管，并立即用缝线结扎LCCA，直至主动脉瓣水平。
  17. 用生理盐水清洁切口区域以清除血凝块，并检查穿刺部位是否有动脉出血。
  18. 用3-0非吸收性缝线缝合肌肉和皮肤，并用碘伏对伤口各侧进行消毒。

3. 术后护理

  1. 移除监测贴片和夹子，将兔子置于重症监护培养箱中。
    注意：术后兔子在重症监护培养箱中密切观察1天，随后转移至普通饲养笼具。
  2. 术后镇痛使用5 mg/kg曲马多和3 mg/kg酮洛芬，抗生素（4 mg/kg庆大霉素）通过皮下注射给药，每日两次，持续3天（参见材料表）。
    注意：术后镇痛管理应遵循兽医及IACUC指南（例如阿片类药物、非甾体抗炎药、局部麻醉药或联合用药）。
  3. 喂食含0.5%胆固醇并添加50,000 U维生素D2（HC + VitD2）的饮食，持续8周。

4. 超声心动图

  1. 球囊损伤术后8周，采用步骤2.1中所述相同方法对兔进行麻醉。
  2. 使用二维经胸超声心动图观察主动脉瓣，并在短轴和长轴切面记录M型图像。
    1. 将兔仰卧位放置于超声检查台上。
    2. 使用电动剃毛器和脱毛膏去除胸部区域的毛发。
    3. 在胸部涂抹超声探头耦合剂（参见材料表）。
    4. 调整探头位置，获取主动脉瓣的胸骨旁长轴切面和胸骨旁短轴切面图像。
    5. 使用M型超声在长轴和短轴切面记录主动脉瓣图像，并保存图像以供后续分析。

5. 组织学分析

  1. 超声心动图检查后，通过静脉注射氯化钾（KCl, 3 g/20 mL, 1 mL）处死家兔。
  2. 打开胸腔，连同升主动脉7一起取出心脏，并将其置于含磷酸盐缓冲液（PBS）的冰上。
  3. 立即将心脏浸入4%多聚甲醛（PFA）溶液中固定，随后包埋于石蜡中（参见材料表）。
  4. 使用切片机将石蜡包埋的心脏组织切成4 µm厚的切片，并分别采用马松三色染色（MT）、茜素红染色和冯·科萨染色（参见材料表）对胶原沉积和瓣膜钙化情况进行评估8,9。

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结果

通过主动脉瓣损伤诱导的兔主动脉瓣狭窄模型
为建立兔主动脉瓣狭窄（AVS）模型，本研究选用体重为3.5–4.0 kg的雄性新西兰白兔。根据步骤2所述的手术方法（图2），通过主动脉瓣损伤建立AVS模型，该操作可导致机械性主动脉瓣退变及钙化。对照组包括喂饲含0.5%胆固醇的高胆固醇（HC）饮食并联合给予50,000 U维生素D2（VitD2）的兔子，此为已知的饮食诱导型AVS模型。

主动脉瓣的评估
为评估主动脉瓣的结构变化，采用超声心动图短轴和长轴切面评价瓣叶的活动度和厚度。在主动脉瓣损伤后8周，超声心动图显示，与对照组兔子（包括野生型（WT）兔子以及未接受瓣膜损伤但喂食高胆固醇加维生素D2（HC + VitD2）饮食的兔子）相比，喂食HC + VitD2饮食且接受瓣膜损伤的兔子其瓣叶增厚且活动受限（图3）。

组织学...

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讨论

动物主动脉瓣狭窄（AVS）模型常用于研究AVS的病理特征，包括AVS的起始与进展过程。本方案介绍了一种通过直接球囊损伤主动脉瓣所建立的新型兔AVS模型。本研究中，主动脉瓣损伤模型表现出明显的瓣叶增厚和钙化。与通过饮食补充诱导的轻度AVS模型相比，直接球囊损伤模型可选择性地损伤主动脉瓣，导致瓣叶增厚、活动受限，以及瓣叶增厚和钙化。这些结果与AVS的一般特征一致10,11。

通过饮食补充和基因操作诱导的常用AVS兔模型在实验研究中存在若干局限性12,13,14。在兔模型中形成显著狭窄通常需要比小鼠更长的喂养周期，可能导致明显的炎症和肝毒性。此外，这些模型中的饮食补充（如高胆固醇饮食和维生素D2）并不总能诱导出一致且显著的瓣膜狭窄。相比之下，本方案中描述的直接球囊损伤可对操作的主动脉瓣叶...

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披露

作者声明本研究无任何利益冲突。

致谢

本工作由韩国国家研究基金会（NRF）资助，该基金会由韩国政府（MSIT）提供资金（项目编号：2020R1A4A3079570）、韩国教育部（项目编号：2021R1I1A1A01051425）以及产业通商资源部资助的产业战略技术开发项目（项目编号：20014873）支持。 & 能源部，韩国

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-0 丝线缝合线AILEESK312
4% 多聚甲醛（PFA）内含子IBS-BP031-2
茜素红溶液MillporeTMS-008-C
ASAHI SION BLUE ASAHI导丝
背侧手术台覆盖物尤汉·金佰利80101-30
球囊充放气装置德马克医疗DID30s
Bionet 动物监护仪BIONETBM3 VET
C型臂西门子医疗有限公司Cios alpha
认证兔粮普瑞纳53224.7% 氢化椰子油，0.5% 胆固醇 &和 1% 蔗糖
Curadle 智能培养箱自动电泳CS-CV206重症监护室（ICU）
麦角钙化醇Sigma-Aldrich E5750维生素D2
Fechtner 结膜镊，钛制WORLD PRECISSION 仪器WP1820
镊子HEBUHB203
庆大霉素Shin Poong
格隆溴铵 SamChunDang
Greenflex NSDAI HAN PHARM生理盐水 500 mL
苏木精溶液Sigma-Aldrich HT1079-1 SET
肝素JW制药25,000 U
一次性使用输液器SWOON MEDICAL
碘绿色制药
碘克沙醇GE HealthcareVisipaque充盈溶液（造影剂）
22 G静脉导管BD 382423
24 G 静脉留置针BD382412
酮洛芬SamChunDang
10 mL 鲁尔锁注射器贝克顿·迪金森医疗
3 mL 鲁尔锁注射器Becton Dickinson 医疗
显微镜OLYMPUSSZ61
切片机赛默飞世尔科技HM 325
MT染色试剂盒Sigma-AldrichHT15-1kt
持针器Solco009-1304
带锁针持与缝合线JEUNGDO BIO &和植物H-1222-18
石蜡LK LABKOREAH06-660-107
PBSGibco10010-023
氯化钾 40Daihan PharmKCl
理想亲水性鞘管MERIT MEDICALPID4F11018SS鞘管 4F
PTA球囊扩张导管波士顿科学公司H749-3903280208-0球囊导管 8.0 mm
RompunElancoXylaxine
无菌纱布DAE HAN Medical10 cm × 20 cm 
外科手套Ansell安塞尔
手术衣尤汉·金佰利90002-02
手术剪诺帕，德国AC020/16
手术胶带3M 微孔胶带1530-1
1 mL 注射器新昌医疗
10 mL 注射器新昌医疗
组织包埋盒Scilav 韩国Cas3003
换能器凝胶 SUNGHEUNGSH102
TridolYuhan Corp.盐酸曲马多
超声系统PhilpsAffiniti 50
Von Kossa 染色试剂盒Abcamab105689
Zoletil 50Virbac 韩国替来他明 &和唑拉西泮

参考文献

  1. Aliev, G., Burnstock, G. Watanabe rabbits with heritable hypercholesterolaemia: A model of atherosclerosis. Histology and Histopathology. 13 (3), 797-817 (1998).
  2. Cimini, M., Boughner, D. R., Ronald, J. A., Aldington, L., Rogers, K. A. Development of aortic valve sclerosis in a rabbit model of atherosclerosis: An immunohistochemical and histological study. Journal of Heart Valve Disease. 14 (3), 365-375 (2005).
  3. Drolet, M. C., Couet, J., Arsenault, M. Development of aortic valve sclerosis or stenosis in rabbits: role of cholesterol and calcium. Journal of Heart Valve Disease. 17 (4), 381-387 (2008).
  4. Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310(2011).
  5. Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (2), 270-278 (2014).
  6. Niepmann, S. T., et al. Graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics human functional and morphological disease phenotype. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 847-856 (2019).
  7. Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; A versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).
  8. Wirrig, E. E., Gomez, M. V., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. COX2 inhibition reduces aortic valve calcification in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (4), 938-947 (2015).
  9. Jung, S. H., et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2(hi) macrophages in infarcted hearts. Nature Communications. 13 (1), 4580(2022).
  10. Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111 (24), 3316-3326 (2005).
  11. Lindman, B. R., et al. Calcific aortic stenosis. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16006(2016).
  12. Cuniberti, L. A., et al. Development of mild aortic valve stenosis in a rabbit model of hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 47 (11), 2303-2309 (2006).
  13. Marechaux, S., et al. Identification of tissue factor in experimental aortic valve sclerosis. Cardiovascular Pathology. 18 (2), 67-76 (2009).
  14. Hara, T., et al. Progression of calcific aortic valve sclerosis in WHHLMI rabbits. Atherosclerosis. 273, 8-14 (2018).

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