经导管球囊损伤诱导的兔主动脉瓣狭窄模型

摘要

需要合适的动物模型来理解主动脉瓣狭窄（AVS）的病理机制，并评估治疗干预措施的有效性。本方案描述了一种建立AVS兔模型的新方法 通过 直接球囊损伤 体内.

摘要

由于难以获得可靠的病变人主动脉瓣组织来源，动物模型正逐渐成为研究主动脉瓣狭窄（AVS）病理机制的重要工具。在多种动物模型中，AVS兔模型是大动物研究中最常用的模型之一。然而，传统的AVS兔模型需要长期饮食干预和基因操作才能诱导出明显的主动脉瓣狭窄，限制了其在实验研究中的应用。为克服这些局限性，本文提出一种新的AVS兔模型，通过直接对主动脉瓣进行球囊损伤来诱导狭窄。本方案详细描述了在新西兰白兔（NZW）中成功诱导AVS的技术，包括术前准备、手术操作步骤以及术后护理的逐步流程。该模型操作简便且可重复，为研究AVS的起始与进展过程提供了有前景的方法，也为探索该疾病潜在的病理机制提供了有价值的工具。

引言

人们日益认识到，由于难以获得与主动脉瓣狭窄（AS）进展相关的病变人主动脉瓣的可靠来源，采用合适的动物模型有助于更好地理解主动脉瓣狭窄（AVS）背后的病理机制。在用于研究AVS的各种动物模型中，兔子是最常用的大型动物AVS模型之一，可通过补充胆固醇/维生素D2或基因操作来诱导建立AVS兔模型^1,2,3,4。

尽管兔AVS模型已为AVS的发生和发展提供了重要的认识，但在我们的初步实验中仍发现，一致且可重复地诱导AVS仍然具有挑战性。

除了饮食诱导和遗传易感性动物模型外，还已通过小鼠的直接机械损伤建立了新的主动脉瓣狭窄（AVS）模型^5,6。该机械损伤模型可成功诱导主动脉瓣狭窄，是在野生型小鼠中建立的一种简单且可重复的AVS模型。据我们所知，目前尚无研究探讨机械损伤对兔模型主动脉瓣的影响。因此，本研究提供了一种通过球囊直接损伤主动脉瓣在雄性新西兰白兔中诱导AVS的新方法，该方法能够准确模拟瓣膜性主动脉瓣狭窄的病理状态。本实验方案详细描述了术前准备、手术操作步骤....

方案

所有动物实验程序均经韩国天主教大学医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并依照《实验动物福利法》、《实验动物护理与使用指南》以及该委员会发布的动物实验准则进行（批准编号：CUMC-2021-0176-05）。本研究采用3月龄雄性新西兰白兔（NZW），体重为3.5–4.0 kg，在单独笼具中按标准条件饲养。兔子饲喂正常饮食或添加0.5%胆固醇并补充50,000 U维生素D2的饮食（见材料表）。诱导主动脉瓣狭窄兔模型的实验设计及分析方法详见图1。

1. 手术准备

1. 确保在手术开始时，所有医疗器械和外科器械（参见材料表）均已灭菌。
2. 按照以下步骤准备扩张球囊导管套装。
   1. 将装有生理盐水与市售造影剂混合液（1:1）的注气/排气装置连接至球囊导管的鲁尔锁接头部分（参见材料表）。
   2. 用充盈液填充球囊，并排出球囊导管中的任何空气。
      ​注意：本研究中使用的充盈液为30%碘克沙醇与0.9%生理盐水的混合液（参见材料表）。
   3. 通过用充盈液冲洗球囊腔，确认球囊正常充盈。

结果

通过主动脉瓣损伤诱导的兔主动脉瓣狭窄模型
为建立兔主动脉瓣狭窄（AVS）模型，本研究选用体重为3.5–4.0 kg的雄性新西兰白兔。根据步骤2所述的手术方法（图2），通过主动脉瓣损伤建立AVS模型，该操作可导致机械性主动脉瓣退变及钙化。对照组包括喂饲含0.5%胆固醇的高胆固醇（HC）饮食并联合给予50,000 U维生素D2（VitD2）的兔子，此为已知的饮食诱导型AVS模型。

主动脉瓣的评估
为评估主动脉瓣的结构变化，采用超声心动图短轴和长轴切面评价瓣叶的活动度和厚度。在主动脉瓣损伤后8周，超声心动图显示，与对照组兔子（包括野生型（WT）兔子以及未接受瓣膜损伤但喂食高胆固醇加维生素D2（HC + VitD2）饮食的兔子）相比，喂食HC + VitD2饮食且接受瓣膜损伤的兔子其瓣叶增厚且活动受限（图3）。

组织学.......

讨论

动物主动脉瓣狭窄（AVS）模型常用于研究AVS的病理特征，包括AVS的起始与进展过程。本方案介绍了一种通过直接球囊损伤主动脉瓣所建立的新型兔AVS模型。本研究中，主动脉瓣损伤模型表现出明显的瓣叶增厚和钙化。与通过饮食补充诱导的轻度AVS模型相比，直接球囊损伤模型可选择性地损伤主动脉瓣，导致瓣叶增厚、活动受限，以及瓣叶增厚和钙化。这些结果与AVS的一般特征一致^10,11。

通过饮食补充和基因操作诱导的常用AVS兔模型在实验研究中存在若干局限性^12,13,14。在兔模型中形成显著狭窄通常需要比小鼠更长的喂养周期，可能导致明显的炎症和肝毒性。此外，这些模型中的饮食补充（如高胆固醇饮食和维生素D2）并不总能诱导出一致且显著的瓣膜狭窄。相比之下，本方案中描述的直接球囊损伤可对操作的主动脉瓣叶.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-0 丝线缝合线	AILEE	SK312
4% 多聚甲醛（PFA）	内含子	IBS-BP031-2
茜素红溶液	Millpore	TMS-008-C
ASAHI SION BLUE	ASAHI		导丝
背侧手术台覆盖物	尤汉·金佰利	80101-30
球囊充放气装置	德马克医疗	DID30s
Bionet 动物监护仪	BIONET	BM3 VET
C型臂	西门子医疗有限公司	Cios alpha
认证兔粮	普瑞纳	5322	4.7% 氢化椰子油，0.5% 胆固醇 &和 1% 蔗糖
Curadle 智能培养箱	自动电泳	CS-CV206	重症监护室（ICU）
麦角钙化醇	Sigma-Aldrich	E5750	维生素D2
Fechtner 结膜镊，钛制	WORLD PRECISSION 仪器	WP1820
镊子	HEBU	HB203
庆大霉素	Shin Poong
格隆溴铵	SamChunDang
Greenflex NS	DAI HAN PHARM		生理盐水 500 mL
苏木精溶液	Sigma-Aldrich	HT1079-1 SET
肝素	JW制药		25,000 U
一次性使用输液器	SWOON MEDICAL
碘	绿色制药
碘克沙醇	GE Healthcare	Visipaque	充盈溶液（造影剂）
22 G静脉导管	BD	382423
24 G 静脉留置针	BD	382412
酮洛芬	SamChunDang
10 mL 鲁尔锁注射器	贝克顿·迪金森医疗
3 mL 鲁尔锁注射器	Becton Dickinson 医疗
显微镜	OLYMPUS	SZ61
切片机	赛默飞世尔科技	HM 325
MT染色试剂盒	Sigma-Aldrich	HT15-1kt
持针器	Solco	009-1304
带锁针持与缝合线	JEUNGDO BIO &和植物	H-1222-18
石蜡	LK LABKOREA	H06-660-107
PBS	Gibco	10010-023
氯化钾 40	Daihan Pharm		KCl
理想亲水性鞘管	MERIT MEDICAL	PID4F11018SS	鞘管 4F
PTA球囊扩张导管	波士顿科学公司	H749-3903280208-0	球囊导管 8.0 mm
Rompun	Elanco		Xylaxine
无菌纱布	DAE HAN Medical		10 cm × 20 cm
外科手套	Ansell	安塞尔
手术衣	尤汉·金佰利	90002-02
手术剪	诺帕，德国	AC020/16
手术胶带	3M 微孔胶带	1530-1
1 mL 注射器	新昌医疗
10 mL 注射器	新昌医疗
组织包埋盒	Scilav 韩国	Cas3003
换能器凝胶	SUNGHEUNG	SH102
Tridol	Yuhan Corp.		盐酸曲马多
超声系统	Philps	Affiniti 50
Von Kossa 染色试剂盒	Abcam	ab105689
Zoletil 50	Virbac 韩国		替来他明 &和唑拉西泮